Name: 게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 배우세요 게놈 DNA에서 β-glucosyltransferase와 클릭 화학을 이용해 5-hmC를 선택적으로 캡처하는 방법을. 이 기술은 밀도에 무관하게 효율적으로 농축하여 차세대 시퀀싱 분석에 활용됩니다.

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이 연구는 국립 보건원 (CH와 NS051630/MH076090/MH078972에 PJ에 GM071440)에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 게놈 DNA 조각 원하는 크기 범위로 sonication을 사용하여 조각 게놈의 DNA는 게놈 전체 시퀀싱 플랫폼에 가장 적합합니다. (우리는 보통 ~ 300 BP에 sonicate.) 1% 아가로 오스 겔 (그림 1)에 조각 게놈의 DNA의 크기 분포를 확인합니다. 2. DNA 준비 게놈 DNA의 5 HMC의 풍부한에 따라 시작 DNA 금액을 확인합니다. 5 HMC 수준이 다른 조직 유형에 크게 다르므로, 시작 DNA의 금액은 샘플 5 HMC 수준에 따라 달라집니다. 예제 표 1을 참조하십시오. 3. β-GT 촉매 반응 (포도당 전송 반응) <ol><li> 1 시간에 37 ° C 물 목욕의 표 2와 배양에 명시된 바와 같이 혼합물을 pipetting하여 섞는다. </li><li> 부화 후, DNA의 10 μg을 당 사용 QIAquick 염기 제거 키트와 반응을 정리열. 열 30 μl 물 Elute과 조화를 이루고 있습니다. </li></ol> 4. Biotinylation 반응 (클릭 화학) <ol><li> 150 μm의 최종 농도 (즉, 30 μl DNA 솔루션에 따라 솔루션을 작업 5 μl)에 용출 DNA 솔루션 (3 단계에서) DBCO-SS-PEG3 - 비오틴 공액 작업 솔루션 (1 MM)를 추가합니다. </li><li> 2 시간에 37 ° C 물 목욕에 pipetting 및 배양하여 섞는다. </li><li> QIAquick 염기 제거 키트와 반응을 정리. 이상적인 총 용출 볼륨은 100 μl입니다. </li><li> 마이크로 리터 규모 분광 광도계 (예를 들면., NanoDrop)를 사용하여 복구 DNA 금액을 수량화. </li></ol> 5. 5 HMC 함유 DNA의 캡처 <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 1X B &amp; W 버퍼 1 ML과 Dynabeads MyOne Streptavidin C1의 50 μl 3 번 씻으십시오. 자기 스탠드로 구슬을 분리합니다. </li><li> 복구 biotinylated D에 배 B &amp; W 버퍼의 동등한 볼륨을 추가세척 구슬로 NA (100 UL). </li><li> 회선 근의 부드러운 회전 실온에서 15 분에 품다. </li><li> 자기 스탠드로 구슬을 분리하고 1X B &amp; W 버퍼 1 ML과 구슬에게 3 번 씻는다. </li><li> 회선 근의 부드러운 회전 상온에서 2 시간에 신선하게 조리 된 50 ㎜의 DTT의 100 μl의 구슬을 잠복기하여 DNA를 Elute. </li><li> 자기 스탠드로 구슬을 분리합니다. DTT를 제거 할 수있는 제조 지침에 따라 마이크로 바이오 스핀 6 열로 eluent와 부하를 대기음. 대상 DNA는 이제 솔루션입니다. </li><li> EB 버퍼의 10 μl의 Qiagen PCR MinElute 정화 키트 및 elute의 DNA에 의해 이전 단계에서 용출 DNA를 정화. 농도가 20 NG / UL보다 높은 경우 큐빗 Fluorometer, 또는 NanoDrop를 사용하여 DNA를 정량화. DNA는 다운 스트림 게놈 전체 시퀀싱 도서관 준비 할 준비가되었습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 품질 O 경우F 게놈 DNA가 높은, β-GT와 biotinylation 반응 후 일반적인 복구 수율은 ~ 60-70% 있습니다. 그러나, 캡처 효율은 샘플의 5 HMC 수준에 따라 서로 다른 조직 유형 상당히 다릅니다. 일반적으로, 뇌 게놈의 DNA에 대한 캡처 효율은 ~ 4-9%이며, 일부 극단적 인 경우에 효율은 12 %까지 도달 할 수 있습니다. ES 세포의 경우 평균 캡처 효율은 신경 줄기 세포에 대한 ~ 0​​.5 %로 대조적으로, ~ 2-4%입니다. 본 최저 효율은 지금까지 암 세포의 게놈 DNA에 대한했습니다. 모든 농축 DNA는 표준 차세대 도서관 준비 프로토콜 준비가되었습니다. 또한 캡처 한 DNA는 또한 관련 프리 머를 사용할 경우 입력 DNA에 비해 몇 조각의 강화를 감지하는 실시간 PCR을위한 템플릿으로 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4441/4441fig1.jpg" /> 1 그림. 에 Sonicated 인간 게놈의 DNA 조각1퍼센트 아가로 오스 겔. 1X TE 버퍼 120 μl 인간의 IPS 세포로부터 격리 게놈 DNA의 10 μg은 sonication 장치 (Covaris)를 사용하여 sonicated되었습니다. sonication 후, sonicated DNA의 2 μl은 sonicated DNA 조각의 크기를 비교하는 DNA 마커의 100 BP를 사용하여 1퍼센트 아가로 오스 겔에로드했습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 음량 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 물 </td><td> _ μl </td><td></td></tr><tr><td> 10 X β-GT 반응 버퍼 </td><td> 2 μl </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> 최대 10 μg의 게놈의 DNA에 </td><td> _ μl </td><td> 최대 500 μl / NG </td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-Glc (3 ㎜) </td><td> 0.67 μl </td><td> 100 μM </td></tr><tr><td> β-GT (40 μM) </td><td> 1 μl </td><td> 2 μM </td></tr><tr><td> 총 볼륨 </td><td> 20 μl </TD&gt; <td></td></tr></tbody></table> 조직 게놈의 DNA (높은 5 HMC 내용&gt; 0.1 %)의 경우 I) <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 음량 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 물 </td><td> _ μl </td><td></td></tr><tr><td> 10 X β-GT 반응 버퍼 </td><td> 10 μl </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> 20 μg의 게놈의 DNA에 </td><td> _ μl </td><td> 최대 500 μl / NG </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 ㎜) </td><td> 1.33 μl </td><td> 100 μM </td></tr><tr><td> β-GT (40 μM) </td><td> 2 μl </td><td> 2 μM </td></tr><tr><td> 총 볼륨 </td><td> 40 μl </td><td></td></tr></tbody></table> II) 줄기 세포 게놈의 DNA (평균 5 HMC 내용 ~ 0.05 %)의 경우 <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 음량 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 물 </td><td> _ μl </td><td></td></tr><tr><td> 10 X β-GT 반응 버퍼 </td><td> 10 μl </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> 최대 50 μg의 게놈의 DNA에 </td><td> _ μl </td><td> 최대 500 μl / NG </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 ㎜) </td><td> 3.33 μl </td><td> 100 μM </td></tr><tr><td> β-GT (40 μM) </td><td> 5 μl </td><td> 2 μM </td></tr><tr><td> 총 볼륨 </td><td> 100 μl </td><td></td></tr></tbody></table> III) 암 세포 게놈의 DNA (낮은 5 HMC 내용 ~ 0.01 % 용) 표 1. 입력 DNA와 선택 화학 라벨 방식에 의한 다양한 5 HMC 수준으로 샘플을 사용하여 라벨 반응 금액의 예. <table border="1"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> 5 HMC 수준 </strong&gt; </td><td> 시작 DNA (μg) </td><td> 라벨 후 복구 (구슬로 입력) (μg) </td><td> 복구 수율 </td><td> 풀다운 DNA (NG) </td><td> 풀다운 얻을 수 </td></tr><tr><td> 성인 마우스 소뇌 </td><td> 0.4 % </td><td> 10 </td><td> 7.5 </td><td> 75% </td><td> 236 </td><td> 3.1 % </td></tr><tr><td> 출생 후의 일 7 마우스 소뇌 </td><td> 0.1 % </td><td> 11 </td><td> 9 </td><td> 82% </td><td> 140 </td><td> 1.6 % </td></tr><tr><td> 마우스 ES 세포 E14 </td><td> 0.05 % </td><td> 60 </td><td> 42 </td><td> 70% </td><td> 350 </td><td> 0.8 % </td></tr></tbody></table> 표 2. 마우스 뇌 조직 및 ES 세포의 대표 결과입니다.

<ol><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).</li>
<li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion%2C+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li>
<li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li>
<li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li>
<li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li>
<li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241(2011).</li>
<li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li>
<li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li>
<li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888(2010).</li>
<li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li>
<li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li>
<li>Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine%3A+a+new+kid+on+the+epigenetic+block%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562(2011).</li>
<li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181(2010).</li>
<li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+recombinant+%CE%B2-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li>
<li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li>
<li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367(2010).</li>
<li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mbd3%2FNURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li>
<li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154(2011).</li>
<li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

5 hydroxymethylcytosine (5 HMC)는 특정 포유류의 세포 유형에서 상당한 양의 최근 확인 epigenetic 수정 존재입니다. 여기에 제시된 방법은 5 HMC의 게놈 전체의 분포를 결정하기위한 것입니다. 우리는 5 HMC의 수산기 그룹에 azide 그룹을 포함하는 엔지니어링 포도당 잔기를 전송하는 β-glucosyltransferase T4 박테리오파지를 사용합니다. azide 그룹은 화학적으로 포유류의 genomes에 5 HMC 함유 DNA 조각의 감지, 연관성 강화, 그리고 배열 ​​비오틴을 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 hMeDIP은 간단하지만, 그 고밀도 5 HMC 지역에 대한 강한 편견을 가지고 있으며 일반적으로 독립 풀에서 일관 결과를 제공, 5 HMC 항체 기반 hydroxymethylated DNA의 immunoprecipitation (hMeDIP-Seq) 13-15 이상의 장점이 있습니다 다운. 우리의 방법은 편견을 소개 할 것입니다. <p class="j...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> # 카탈로그를 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 5M 나트륨 염화물 (NaCl) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma베이스 (트리스) pH7.5 </td><td> Invitrogen </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M, pH7.4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15,630 </td><td></td></tr><tr><td> 염화 마그네슘 (MgCl 2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530G </td><td></td></tr><tr><td> 디메틸 sulfoxide (DMSO) </td><td> 시그마 </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> 피셔 BioReagents </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-PEG3 - 비오틴 공액 </td><td> 화학 도구를 클릭합니다 </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4 - Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure </td><td> Invitrogen </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick 염기 제거 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 28,304 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 바이오 스핀 6 열 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> Invitrogen </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Qiagen PCR MinElute 정화 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 28,004 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure 아가로 오스 </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-N 3 포도당 </td><td> 활성 Motif로 </td><td> 55,013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 효소 </td></tr><tr><td> β-glucosyltransferase (β-GT) </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> Sonication 장치 </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 데스크탑 원심 분리기 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 열탕 목욕 </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 젤 실행 장치 </td><td> 바이오 RAD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> 열 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake 튜브 쉐이커 </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake 튜브 쉐이커 </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 자기 분리 스탠드 </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> 큐빗 2.0 Fluorometer </td><td> Invitrogen </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 설정 10 X β-GT 반응 버퍼 (500 MM의 HEPES 산도 7.9, 250 MM MgCl 2) 2 X 구속력과 (10 MM 트리스 산도 7.5, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2 M NaCl, 0.02 % 십대 초반 20) (B &amp; W) 버퍼를 세척 . </td></tr></tbody></table>

게놈 dna에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5 methylcytosine (5-MC)는 인간 게놈 DNA의 총 cytosines의 ~ 2-8%를 구성하고 유전자 발현, 게놈 무결성 유지, 부모의 각인, X-염색체 불 활성화, 규제 등의 생물학적 기능의 광범위한 영향을 개발, 노화, 암 1. 최근 산화 5 MC, 5 hydroxymethylcytosine (5 HMC)의 존재는 배아 줄기 (ES) 세포와 neuronal 세포 2-4, 특히 포유류의 세포에서 발견되었습니다. 5 HMC는 TET 가족 철 (II) / α-ketoglutarate에 따라 달라 dioxygenases 2, 3 5 - MC 촉매의 산화에 의해 생성됩니다. 5 HMC는 배아 줄기 (MES) 세포, 정상 조혈 및 malignancies, 그리고 접합자 개발이 5-10의 유지에 참여 제안합니다. 더 나은 5 HMC의 기능을 이해하기 위해서는 안정적이고 간단한 시퀀싱 시스템이 필수적입니다. 전통 bisulfite 배열은 5 - MC 11 일부터 5 HMC을 구별 할 수 없습니다 </sup&gt;. 5 HMC의 생물학을 해명하기 위해, 우리는 특별히 5 HMC에 12 포도당 잔기를 추가 박테리오파지 효소 활용, 라벨 및 5-HMC를 캡처 할 수있는 매우 효율적이고 선택적 화학 접근 방식을 개발했습니다. 여기 5 HMC의 선택적 화학 라벨에 대한 간단한 두 단계 절차를 설명합니다. 첫 번째 라벨 단계에서, 게놈 DNA의 5 HMC는에서 5 HMC에 6 azide 포도당를 전송하는 방식으로, β-GT, T4 박테리오파지에서 glucosyltransferase로 6 azide-포도당 촉매으로 표시됩니다 수정 cofactor, UDP-6-N3-Glc (6 N3UDPG). 두 번째 단계, biotinylation에서 이황화 비오틴의 링커는 클릭 화학으로 azide 그룹에 연결되어 있습니다. 두 단계는 게놈 지역에서 5 HMC의 풍부한 관계없이 라벨 매우 낮은 배경을 제공 완료로 이어지는, 매우 구체적이고 효율적이다. 5 HMC의 후 biotinylation, 5 HMC 함유 DNA 조각을 한 후 선택적으로 캡처되어밀도 독립적 인 방식으로 streptavidin 비즈를 사용합니다. 그 결과 5 HMC 강화 DNA 조각은 차세대 시퀀싱 등의 다운 스트림 분석을 위해 사용될 수있다. 우리의 선택 레이블 및 캡처 프로토콜은 다양한 / 변수 5 HMC의 abundances과 게놈 DNA의 소스에 해당 높은 감도를, 수여. 이 프로토콜의 주요 목적은 자사의 다운 스트림 응용 프로그램 (예., 차세대 시퀀싱은 게놈의 5 HMC 배포를지도)이지만, 단일 분자입니다 실시간 SMRT (DNA) 시퀀싱과 호환됩니다 5 HMC의 단일 기본 해상도 시퀀싱을 제공 할 수.

설명이 쉽고 밀도에 독립적 인 강화를위한 비오틴 링커를 전송할 클릭 화학에 이어, 5 HMC에 azide - 포도당를 전송하는 β-glucosyltransferase (β-GT)를 사용하여 두 단계 라벨 프로세스입니다. 이 효율적이고 특정 라벨 방식은 차세대 시퀀싱을 통해 매우 낮은 배경과 높은 처리량 epigenomic 매핑과 5 HMC의 농축이 가능합니다.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

5-메틸시토신(5-mC)은 인간 게놈 DNA 전체 시토신의 약 2-8%를 구성하며, 유전자...를 포함한 광범위한 생물학적 기능에 영향을 미칩니다.

본 절차의 전반적인 목표는 새롭게 발견된 DNA 변형인 5-hydroxyethyl cytokine을 표지하고 포획하는 것입니다. 먼저 초음파 처리를 통해 게놈 DNA를 단편화한 다음, Click chemistry를 사용하여 beta gluc glucose transferase 반응을 수행함으로써 DNA의 5-hydroxyethyl cytidine 잔기에 azide glucose 작용기를 전달합니다. Azid 그룹에 salide biotin 링커를 부착하여 비오틴화된 DNA를 생성합니다. 그 후, 스트렙타비딘 비즈를 이용하여 5-hydroxyethyl cytidine을 포함하는 DNA 단편을 밀도 독립적인 방식으로 선택적으로 포획합니다.정제된 5-hydroxyethyl cytidine 농축 DNA 단편은 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)을 포함한 후속 분석에 사용할 수 있습니다. 항체 기반 방식과 같은 기존 접근법에 비해 이 기술의 주요 장점은 phy hydroxyethyl cytosine의 캡처가 PHY C 밀도와 무관하다는 점입니다. 실험실의 선임 연구원으로 Eugene Lee가 이 프로토콜을 시연하겠습니다.먼저, 게놈 전장 시퀀싱 플랫폼에 적합한 크기 범위가 되도록 게놈 DNA를 초음파 처리합니다. 1% agarose 겔에서 단편화된 게놈 DNA의 크기 분포를 확인합니다. 이제 게놈 DNA 내의 five hydroxyethyl citabine 함량을 기준으로 시작 DNA 양을 결정합니다.5-hydroxyethyl citabine은 서로 다른 조직 탭 간에 상당한 차이가 있으므로, 시작 DNA 양은 샘플의 5-C 수준에 따라 달라집니다. 예시는 원고의 표 1을 참조하십시오. 라벨링 과정의 첫 번째 단계는 조각난 게놈 DNA의 5-C 잔기로 AZA glucose Es를 이동시키는 기본적인 전이 반응입니다.반응 성분들을 혼합하고 피펫팅으로 섞은 다음, 37 °C 항온수조에서 1시간 동안 효소 반응을 진행합니다. 반응물을 Kayak Quick Nucleotide Removal Kit에 통과시키되, 컬럼당 10 µg의 DNA를 사용합니다. 컬럼당 30 µL의 물로 DNA를 용출시키고, 라벨링 과정의 두 번째 단계에서 샘플을 회수합니다.클릭 화학 반응을 통해 결합 링커가 eza 그룹에 부착되었는지 확인합니다. 비오틴 결합 반응을 위해 DNA 용액 30 µL당 5 µL의 비오틴 접합 작업 용액을 첨가합니다. 37 °C 항온수조에서 2시간 동안 배양합니다.KAYAK 퀵 뉴클레오타이드 제거 키트를 사용하여 반응물을 처리하고 DNA를 100 µL로 희석하십시오. 그런 다음 NanoDrop을 사용하여 회수된 DNA의 양을 측정하십시오. 50 µL의 strep adin dyna beads로 시작하십시오.제조업체의 지침에 따라 3회 세척을 수행하고, 자석 스탠드에서 비드를 수집합니다. 이제 비오틴화된 DNA를 100 µL의 2배 BNW 완충액으로 희석하고, 세척된 비드에 샘플을 추가합니다. 실온에서 가볍게 회전시키며 15분 동안 배양합니다.마그네틱 스탠드를 사용하여 비즈를 수집하고 DNA를 용출시키기 전 세 번 세척합니다. 새로 조제한 50 mM DTT 100 µL를 첨가하고, 완만한 회전 상태에서 실온으로 2시간 동안 배양합니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비즈를 분리합니다.그 다음 표적 DNA가 포함된 EENT를 수집하고, 샘플을 microbio spin six 컬럼에 로딩합니다. DTT를 제거하기 위해 cogen 컬럼에서 샘플을 추가로 정제하고 10 µL의 EB 버퍼로 DNA를 용출한 뒤, Qubit, 형광 광도계(fluorimeter) 또는 NanoDrop을 사용하여 DNA 양을 측정합니다. 농도가 20 ng/µL보다 높을 경우, 이 1% agarose 겔은 인간 iPS 세포에서 분리하여 초음파 처리한 DNA 단편들을 보여줍니다.차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)과 같은 후속 응용 분야의 경우, 일반적인 단편화 크기는 약 300 base pairs입니다. genomic DNA의 품질이 높을 때 beta GT 및 biotin 반응 후의 회수 수율은 약 60에서 70% 정도라는 점에 유의하십시오. 하지만 pull down 수율은 샘플의 5-hydroxyethyl cytokine 수준에 따라 조직 유형별로 크게 다릅니다. 일반적으로 뇌 genomic DNA의 캡처 효율은 약 4에서 9%이며, 일부 극단적인 경우에는 효율이 최대 12%에 달할 수 있습니다. ES 세포의 평균 캡처 효율은 약 2에서 4%인 반면, 신경 줄기세포의 경우는 약 0.5%입니다. 지금까지 관찰된 가장 낮은 효율은 암세포 유래 genomic DNA에서 나타났습니다.이러한 절차를 거친 후, 다섯 가지 GC 변형의 게놈 전반에 걸친 분포와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing technique)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

selective-capture-of-5-hydroxymethylcytosine-from-genomic-dna

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 분석하고 spe cific 로커스 이내 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine을 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. 키트는 β - glucosyltransferase (T4 - BGT)를 이용한 효소 반응을 통해 5 - HMC의 수산기 그룹에 포도당의 추가에 의해 5 - HMC에서 5 - MC를 구별. 5 HMC는 CCGG의 맥락에서 발생하면,이 수정은 아닌 cleavable 사이트에 cleavable MspI 사이트를 변환합니다.

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

DNA의 methylation 분석을위한 황금 표준 bisulphite 변환 DNA의 게놈 시퀀싱 수 있습니다. 이 방법은 산성 조건 하에서 deamination을 bisulphite 5 - methylcytosine (5 멕)과 비교 사이 토신의 증가 감도 활용합니다. Unmethylated cytosines는 대상 게놈의 DNA의 PCR 증폭 후 methylated cytosines 구별하실 수 있습니다.

의 DNA Methylation : Bisulphite의 변경 및 분석

이 비디오는 나일론 멤브레인에 DNA 샘플을 블롯팅하고 단클론 항체를 사용한 후속 시각화를 통해 체외에서 인간 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 결정하는 도트 블롯 기술을 설명합니다. 이는 배양의 다양한 단계에서 연골세포의 표현형을 결정하는 데 도움이 됩니다.

DNA 메틸화 정도를 결정하기 위한 5-메틸시토신 점 블롯

여기에서는 과산화효소 접합 2차 항체 및 티라미드 신호 증폭의 사용을 기반으로 5mC 산화 유도체의 공간 분포를 매핑하기 위한 민감한 면역화학적 방법을 설명합니다.

민감한 면역를 사용하여 시토신의 수정 된 형태의 검출

5-methylcytosine (oxi mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)의 산화 형태를 새로 발견 하 고 5-carboxylcytosine (5caC) 독특한 기능 역할을 가진 고유한 DNA 수정 나타낼 수 있습니다. 여기 oxi mCs의 공간 배급, 신호 강도 프로 파일링 및 colocalization의 시각화를 위한 반 정량 워크플로 설명 되어 있습니다.

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

자세한 프로토콜 설계 분할-TET2 효소 (사이 다) 화학 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 후 리 모델링 포유류 세포에 도입 되 게 됩니다.

화학을 유도할 수 있는 DNA Hydroxymethylation 및 후 리 모델링 설계 분할-TET2 효소

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

이 보고서의 목적은 강력한 immunohistochemical epigenetic 마커의 검출을 위한 프로토콜을 설명 하기 위해, 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)을 개발 하 고 postmitotic 마우스 망막.

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

여기에서, 우리는 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩 방법을 활용하여 세포와 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다.

신경 줄기 세포와 쥐의 뇌에서 5-하이드록시메틸시토신의 검출

이 논문은 온전한 제브라피쉬 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화의 신속하고 효율적인 시공간적 모니터링을 위한 프로토콜을 설명합니다.

온전한 Zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링

배우세요 게놈 DNA에서 β-glucosyltransferase와 클릭 화학을 이용해 5-hmC를 선택적으로 캡처하는 방법을. 이 기술은 밀도에 무관하게 효율적으로 농축하여 차세대 시퀀싱 분석에 활용됩니다.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

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