Name: Prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprenda a registrar potenciais de campo extracelulares no prosencéfalo de larvas de zebrafish intactas. Esta técnica permite monitorar atividade semelhante a convulsões em modelos genéticos e farmacológicos de epilepsia.

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O autor gostaria de agradecer a Peter Castro e Mateus Dinday por seus esforços iniciais para estabelecer zebrafish em laboratório. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde EUREKA concessão (# R01NS079214-01).

1. Produção de ovos e Cobrança <ol><li> Zebrafish criação segue procedimento padrão descrito anteriormente 8. Resumidamente, zebrafish adultos são criados em tanques de criação com divisórias no lugar. Quando as luzes da sala de vir na manhã seguinte, divisórias são removidas de reprodução tanques e os peixes são permitidos aproximadamente 20 a 60 minutos de tempo de acasalamento imperturbável. </li><li> Ovos de tanques de criação são coletados em uma peneira e lavadas com água de ovo. Os ovos são então transferidos para uma placa de Petri com água de ovo. Ovos não fertilizados e detritos são removidos utilizando uma pipeta de transferência. </li><li> Prato lugar Petri contendo os ovos recolhidos numa incubadora (28-32 ° C). Após eclosão dos ovos, cerca de dois dias após a fertilização (dpf), remova córion e qualquer outros detritos com uma pipeta de transferência. </li><li> No dia desejado pós-fertilização (3-8 dpf) remover uma placa de Petri contendo larvas livremente natação e lugar na bancada do laboratório à temperatura ambiente. </li></ol><ol><li> Usando um extrator micropipeta, puxe de 1,2 mm de diâmetro externo de borosilicato capilar de vidro em duas agulhas e armazenar em uma placa de Petri 150 mm ou caixa de pipeta vazio que coloca sobre rampas bolinha de borracha. As agulhas podem ser puxado com antecedência. Diferente OD capilares de vidro podem ser usados, dependendo do tipo de andar de entrada do amplificador disponível. </li><li> Microeléctrodo protelar o com solução de gravação extracelular (2 M NaCl) utilizando uma seringa de 1 ml com uma seringa de filtro Nalgene (4 mm) e de filamentos Microfil (Warner Instruments Precision) ligado. Agite ou o bolo em direção à ponta da agulha até que haja algumas bolhas ou nenhuma restantes. </li></ol> 3. Imobilização em Agar <ol><li> Prepara-se uma solução fresca de 1,2% de agar baixo ponto de fusão em água ovo. Solução de agar em lugar de um conjunto banho de água a ~ 37 ° C. </li><li> Prepare uma lamela com câmara de gravação e coloque no freezer (5-10 min). A câmara de gravação deve MatCh que é utilizado na plataforma de electrofisiologia. Nós usamos um baixo perfil aberto diamante câmara de banho de imagem da Warner Instruments (modelo RC-26GLP). </li><li> Utilizando uma pipeta de Pasteur ou transferência, um peixe-zebra lugar larval em uma pequena gota de água ovo em uma placa de Petri limpa. Para esta gotícula, adicionar uma gota de uma solução contendo um anestésico (0,02% tricaina) e agente paralisante (1 mg / ml α-bungarotoxina). </li><li> Monitorar zebrafish para perda de movimento (5 a 10 min). </li><li> Retirar as lamelas / câmara de gravação do freezer. Coloque câmara no palco de um estereomicroscópio. Utilizando uma pipeta de transferência, misturar de alguns ml de 1,2% de agarose de ponto de fusão baixo com gota e solução de transferência (com peixe) para a câmara de lamela / gravação. </li><li> Utilizando uma ponta de pipeta ou agulha romba fina, larvas de posição sob o estereomicroscópio, de modo que o dorso do peixe é exposto à superfície do gel de agarose. Permitir agarose para endurecer (5-10 min), em seguida, utilizando uma espátula plana a transferência b agarbloquear a uma câmara de gravação criado em uma plataforma de eletrofisiologia. </li></ol> 3. Gravação de campo extracelular <ol><li> Adicionar 2-5 ml de meio de registo para o peixe-zebra câmara de gravação. Se as mudanças de droga são de câmara, necessário perfundir com solução de gravação a uma velocidade de aproximadamente 1 ml / min. Não oxigenação da solução de gravação é necessária. </li><li> Inserir um microeléctrodo (aproximadamente 1 diâmetro de ponta um, 2-7 MQ) no andar de entrada do amplificador montado num micromanipulador tridimensional. Verificar se o micromanipulador está numa posição apropriada para permitir uma amplitude de movimento e ajustamento. Coloque a extremidade do microeléctrodo para dentro do plano de vista do microscópio, elevado para fora do palco, e utilizando o ajuste grosseiro inferior a um ponto imediatamente acima e ligeiramente à frente da cabeça do peixe-zebra. </li><li> Com o amplificador em &quot;grampo-atual&quot; modo de zero, o eletrodo. </li><li> Usando ajuste grosso inferior ponta do eletrodo para que ele só toca o surface do peixe-zebra, ligeiramente à frente da parte anterior do cérebro. </li><li> Usando etapas de ajuste fino avançar a ponta do eléctrodo até que perfura a pele do peixe-zebra. Deixar depositar e depois avançar o eletrodo vários microns em prosencéfalo. </li><li> Registrar a atividade elétrica no grampo de modo atual usando o software Axoscope. Os dados são adquiridos a uma taxa de amostragem de 10 kHz. </li></ol>

<ol><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressing+zebrafish+for+behavioral+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stressing zebrafish for behavioral genetics.</a> Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49(2011).</li>
<li>Rinkwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+an+integrative+system+for+neurogenomics+and+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences.</a> Progress in Neurobiology. 93 (2), 231(2011).</li>
<li>Penberthy, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for human disease.</a> Frontiers in Bioscience. 7, d1439(2002).</li>
<li>Letamendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+automated+high-throughput+system+for+zebrafish+in+vivo+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings.</a> PLoS One. 7, e36690(2012).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216(2000).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line.</a> Development. 123, 1(1996).</li>
<li>Suster, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Molecular Biology. 561, 41(2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior%2C+neural+activity+and+c-fos+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131 (3), 759(2005).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+mutagenesis+screen+to+identify+seizure-resistant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish.</a> Epilepsia. 48 (6), 1151(2007).</li>
<li>Williams, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+radiotelemetry+to+evaluate+electrographic+seizures+in+rats+with+kainate-induced+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39(2006).</li>
<li>Marsh, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interictal+EEG+spikes+identify+the+region+of+electrographic+seizure+onset+in+some%2C+but+not+all%2C+pediatric+epilepsy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients.</a> Epilepsia. 51 (4), 592(2010).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+application+of+modularly+assembled+zinc-finger+nucleases+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish.</a> Development. 138 (20), 4555(2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de gravação extracelular aqui apresentada permite uma análise muito sensível e rápido de atividade cerebral. Estas gravações são análogos a monitorização (EEG) eletroencefalográficos vulgarmente usado para avaliar a presença de descarga eléctrica anormal (isto é, convulsões) em modelos de roedores de epilepsia e 11 pacientes 12. Gravações extracelulares podem ser combinadas com as manipulações farmacológicas, como mostrado aqui. Estes tipos de gravações podem também ser usados ​​p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Agarose de fusão baixo </td><td> Fisher-Científico </td><td> BP1360-100 </td><td> Dissolver em mídia de embrião em 1,2% </td></tr><tr><td> Mídia de gravação </td><td> Fisher-Científico </td><td> BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 </td><td> 1 mM de NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM de HEPES, 1,2 mM de MgCl2, 10 mM de dextrose, 2,1 mM CaCl 2 o pH para aproximadamente 7,3 com NaOH 1 N </td></tr><tr><td> Tricaina </td><td> Argent Labs </td><td> MS-222 </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> α-bungarotoxina </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 2133 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Um tubo de vidro capilar </td><td> Warner Instruments </td><td> G120TF-3 </td><td> Puxar a uma resistência de 2 -7 MQ </td></tr><tr><td> Amplificador de fixação de membranas </td><td> Warner Instruments </td><td> PC-505B </td><td> Nós usamos um amplificador Warner no modo de fixação de corrente; Ganho fixado em 2 mV / PA e filtro de Bessel fixado em 2K. Modelos comparáveis ​​podem ser usados ​​de acordo com as instruções do fabricante. </td></tr><tr><td> Filtro amplificador / </td><td> Cygnus Tecnologia </td><td> FLA-01 </td><td> Nós usamos um Cygnus pré-amplificador; Ganho fixado em 10-20; Frequência de corte fixada em 1-2K; filtro Notch IN. Modelos comparáveis ​​podem ser usados ​​de acordo com as instruções do fabricante. </td></tr><tr><td> Axon A / D bordo e software Axoscope </td><td> Molecular Devices </td><td> Axon Digidata 1320A; Axoscope 8,2 </td><td> Os dados são coletados em Axoscope usando lacuna livre modo de aquisição; amostragem de 10 kHz. Modelos comparáveis ​​e os programas podem ser usados ​​de acordo com as instruções do fabricante. </td></tr><tr><td> Água ovo </td><td&gt; Instant Oceano </td><td></td><td> 3 g Instantânea Oceano mar de sal, 2 ml de azul de metileno 0,1% em 10 ml de água deionizada </td></tr></tbody></table>

prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval zebrafish

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

A epilepsia afeta cerca de 3 milhões de pessoas nos Estados Unidos e até 50 milhões de pessoas em todo o mundo. Definido como a ocorrência de convulsões espontâneas não provocados, a epilepsia pode ser adquirido como resultado de um insulto ao cérebro ou a uma mutação genética. Os esforços para convulsões modelo em animais têm utilizado principalmente adquiridos insultos (fármacos convulsivos, estimulação ou lesão cerebral) e manipulações genéticas (knockdown antisense, a recombinação homóloga ou transgénese) em roedores. Zebrafish é um sistema modelo de vertebrados 1-3 que poderia fornecer uma alternativa valiosa para roedor pesquisa baseada em epilepsia. Peixe-zebra são amplamente utilizados no estudo da genética de vertebrados ou de desenvolvimento, exibem um elevado grau de semelhança genética para os mamíferos e expressam homólogos de ~ 85% de humanos conhecidos mutações de um único gene de epilepsia. Devido ao seu tamanho pequeno (4-6 mm de comprimento), larvas de peixe-zebra pode ser mantida em volumes de fluidos tão baixo como 100 ul durante o desenvolvimento inicial e arraYED em multi-poços. Os reagentes podem ser adicionados directamente à solução em que os embriões se desenvolvem, o que simplifica a administração do fármaco e permitindo uma rápida no rastreio in vivo de compostos de teste 4. Os oligonucleótidos sintéticos (morpholinos), mutagénese, dedo de zinco nuclease e abordagens transgénicas podem ser utilizadas para gerar rapidamente knockdown gene ou mutação no peixe-zebra 5-7. Estas propriedades pagar estudos zebrafish uma vantagem sem precedentes análise estatística poder sobre roedores para o estudo de distúrbios neurológicos como a epilepsia. Porque o &quot;padrão ouro&quot; para a pesquisa a epilepsia é monitorar e analisar as descargas elétricas anormais que se originam em uma estrutura cerebral central (isto é, convulsões), um método eficiente para registrar a atividade cerebral em larvas do peixe-zebra é descrito aqui. Este método é uma adaptação de técnicas convencionais de gravação extracelular e permite a monitorização a longo prazo estável de actividade do cérebro em larvas do peixe intacta. Sgravações amplas são mostrados para convulsões agudas induzidas pela aplicação de banho de drogas convulsivas e apreensões espontâneas gravadas em um peixe geneticamente modificado.

Exemplos de descarga do tipo convulsivas electrográfico gravado no cérebro anterior de um agar-embedded larvas do peixe são mostrados na Figura 1. De grande amplitude de descarga explosão multi-pico nas amostras foi evocado por aplicação de banho de um fármaco convulsivo, 40 mM de pilocarpina (em A, 6 dpf) ou 1 mM de picrotoxina (em B, 8 dpf). Nestes registos, imobilizado e de ágar-embedded zebrafish são monitorados continuamente durante até 90 min. Peixe permanecem viáveis ​​nestas condições de gravaçã...

Um método simples para gravar os potenciais de campo extracelulares no larval do peixe-zebra é descrita prosencéfalo. O método proporciona um forte<em&gt; In vivo</em&gt; Leitura de apreensão como atividade. Esta técnica pode ser utilizada com larvas do peixe geneticamente modificada carregando epilepsia genes relacionados ou convulsões evocadas pela administração de fármacos convulsivos.

Prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

O objetivo geral deste procedimento é obter gravações de campo extracelular do prosencéfalo de um peixe-zebra larval intacto. Isso é feito imobilizando primeiro as larvas de peixe-zebra em um bloco de aros. Em seguida, um microeletrodo de gravação é colocado no prosencéfalo sob visualização direta.A etapa final é registrar a atividade elétrica do prosencéfalo. Em última análise, os resultados podem ser usados para monitorar a atividade anormal de convulsões eletrográficas em larvas intactas de peixe-zebra. Tive a ideia desse método pela primeira vez quando estava tentando demonstrar que as convulsões poderiam ser provocadas em larvas de peixe-zebra A criação de peixes-zebra segue os procedimentos padrão descritos anteriormente. Brevemente.O peixe-zebra adulto é instalado em tanques de reprodução com divisórias no lugar. Quando as luzes da sala se acendem na manhã seguinte, as divisórias são removidas e os peixes têm de 20 a 60 minutos de tempo de acasalamento sem perturbações. Os ovos são então coletados dos tanques, transferidos para uma placa de Petri com água de ovo e limpos de detritos com uma pipeta de transferência, agora coloque os ovos em uma incubadora e, em cerca de dois

forebrain-electrophysiological-recording-in-larval-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O protocolo descreve o procedimento para realizar eletrofisiologia em peixe-zebra adulto. Este método pode ser usado para medir a atividade neural in vivo.

Eletrofisiologia do peixe-zebra adulto: um método para medir a atividade elétrica extracelular de neurônios in vivo

Este vídeo demonstra a gravação de sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra paralisada, posicionando uma micropipeta perto do gânglio da linha lateral e formando uma vedação solta para captura de sinal. A solução extracelular mantém a viabilidade neuronal durante esse processo.

Monitorando sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra imobilizada

Neste vídeo, vamos demonstrar como para registrar a atividade elétrica dos neurônios individuais identificados em uma preparação do cérebro inteiro, o que preserva os circuitos neurais complexos. Usamos peixe transgênico no qual hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) neurônios são geneticamente marcadas com uma proteína fluorescente para identificação na preparação cérebro intacto.

Registro da atividade elétrica dos neurônios identificados no cérebro intacto de peixes transgénicos

Este artigo descreve como um peixe-zebra adulto podem ser imobilizados, entubado, e usado para experimentos in vivo eletrofisiológicos para permitir gravações e manipulação da atividade neural em um animal intacto.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e a caracterização de um modelo de zebrafish de epilepsia resultante da inibição transitória do gene DEPDC5.

Análise comportamental e fisiológica em um modelo de zebrafish de epilepsia

Aqui, apresentamos um protocolo que simplifica a medição de luz electroretinogram evocado respostas de zebrafish larval. Um eletrodo de esponja-ponta cónica romance pode ajudar a tornar o estudo de desenvolvimento visual no zebrafish larval usando o electroretinogram ERG mais fácil de conseguir com resultados confiáveis e menor custo.

Electroretinogram gravação no Zebrafish Larval usando eletrodo de esponja-ponta em forma de Cone de romance A

Aqui apresentamos um método para a imagem do cérebro embrionário de zebrafish in vivo upto larval e juvenil estágios. Este procedimento microinvasivo, adaptado a partir de abordagens eletrofisiológicas, fornece acesso a detalhes celulares e subcelulares de neurônio maduro e pode ser combinado com estudos optogenéticos e neurofarmaológicos para caracterização da função cerebral e intervenção medicamentosa.

In vivo Imagem de Tecido Cerebral Totalmente Ativo em Larvas de Zebrafish Acordados e Juvenis por Remoção de Crânio e Pele

Apresentamos aqui um protocolo para imagens in vivo de todo o cérebro de larvas de peixes-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional. O procedimento experimental inclui preparo da amostra, aquisição e visualização das imagens.

In vivo Imagem do cérebro inteiro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar imagens de cálcio de dois fótons no prosencéfalo dorsal de zebrafish adultos.

Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para examinar a atividade neural em regiões cerebrais de peixes-zebra transgênicos que expressam indicadores de cálcio GCaMP usando microscopia confocal.

In vivo Imagem de fluorescência confocal da atividade neural induzida por estimulação sensorial em peixes-zebra larvais parcialmente contidos

Aprenda a registrar potenciais de campo extracelulares no prosencéfalo de larvas de zebrafish intactas. Esta técnica permite monitorar atividade semelhante a convulsões em modelos genéticos e farmacológicos de epilepsia.

Prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval Zebrafish

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