Name: ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ幼生の自動化ハイスループット行動分析法。環境毒性物質や医薬品曝露後の行動変化を検出し、脳発達への影響を評価するコスト効率の良い手法です。

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我々は行動アッセイの最適化の支援のためにショーンPelkowskiに感謝します。この作品は、母子保健と人間開発研究所、R01 HD060647と国立環境健康科学研究所、F32 ES021342とR03 ES017755によってサポートされていました。

1。ゼブラフィッシュ胚の収集と幼虫を育てる<ol><li> &quot;偽の&quot;草（緑糸から作られた）（ 図1）を有するガラスパイレックス皿を夜明けにタンク内に挿入され、ゼブラフィッシュ胚を収集するために、2時間にしておく必要があります。胚を含むガラス皿は、ハンドヘルドストレーナ上に注ぎ、脱イオン水で洗浄されるべきである。胚はその後、卵の水で栽培されるべきである。卵水は脱イオン水やカビ防止剤として使用されているメチレンブルー、0.25 mg / Lででインスタントオーシャンの60 mg / Lで含まれています。 </li><li>個々の実験の仮説に応じて、胚を直ちに又は毒物または医薬品を使用して、開発の特定の段階で処理することができる。毒物および医薬品は、通常、DMSOに溶解させた（1,000 Xの濃度で）、さらに、卵、水媒体中で直接希釈されるべきである。 </li><li>医薬品や毒物による胚および幼虫の治療中行動解析7におけるDPF（卵水溶液が真菌/細菌の増殖を回避するために、一日おきに、少なくとも変更する必要があるまで、sが、幼虫及び胚を50 1ml当たり約50〜60幼虫の密度で深いペトリ皿内に収容することができる死者胚から）。 </li></ol> 2。行動分析のための金型を準備する<ol><li>特にX 7.6センチメートル×5㎜社内でカスタム構築された11.7センチメートルを測定プラスチック金型を開発しました。金型はサーモサイエンティフィックから単一のウェルプラスチックプレートに注ぎ、アガロースを用いて車線を作成するために必要とされる。シングルウェルプレート対策12.4センチメートルX 8.1センチメートル×1.2センチメートル。 </li><li>金型の側面を60°の角度を付けている5つのレーンが含まれています。金型内のレーンは底幅が14ミリメートルであるのに対し、最も広い上部に18ミリメートルのベースの高3.5ミリメートルです。金型内のレーン（ 図2）の間に4ミリメートルのギャップがあります。 </li><li>レーンを準備するには脱イオン内の溶融アガロース（0.8％アガロースを50mlを注ぐシングルウェルプレートに60 mg / Lでインスタントオーシャン）とDの水。金型は、任意の気泡形成を排除する液体アガロースの上に非常にゆっくり配置し、アガロース（約45分かかります）まで冷却したときに除去することができる。 </li><li>行動実験が実行される前に、アガロースレーンは1日よりも以前に行われてはならない（アガロースが出て乾燥を避けるため）レーンは、最大およそ36時間のために料理に蓋室温で保存することができます。アガロースレーンは、1つの実験のために使用されるべきであり、その後廃棄されるべきである。 </li></ol> 3。画像キャプチャ<ol><li>最大20幼虫には、プレートの各レーンに配置することができます。典型的には、レーンごとに5幼虫を泳ぐ速度の最も正確な追跡を容易にするために、実験ごとに必要とされる幼虫の数を減らすために使用される。レーンは卵水でや実験に応じて、医薬品や毒物なしで充填することができる。しかし、レーンはFであってはならない彼らはイメージングキャビネット内に配置されるまで、すべての方法をilled、これはオーバーフローを防ぐことができます。それらはアガロース金型に入れ、ノートパソコンの画面の上部に配置された後の一貫性を保つために、幼虫は、10分の馴化期間を有するべきである。効率的にペトリ皿からアガロースレーンに幼虫を移動すると、幼虫のストレスを軽減するのに役立ちます。幼虫が浅いタンクやペトリ皿に収納されているとき、これは最も簡単です。 </li><li>イメージングキャビネットは、時間経過の写真撮影やノートパソコンに使わキヤノン製デジタルカメラが含まれています。カメラは、キャビネットの上部に配置され、15.6インチスクリーンのラップトップは、画面（ 図3）上に向けて配置する必要がありますキャビネットの下部に向かって目的とすべきである。 4枚のプレートを直接ノートパソコンの画面の上部に手で位置決めされるべきである。それが（Lの縁に影を排除するためにレーンの上部とレベルであるように、この時点でレーンは卵の水や化学処理をオフに突破することができます画像でanes）。 </li><li> PowerPointプレゼンテーションは、幼虫のために嫌悪刺激として使用されます。過去動く赤のボールで6または12マルチウェルプレート15,17,18で幼虫ゼブラフィッシュが示された。現在PowerPointはプレートの上半分（ 図4）に移動する赤いバーの15分続いて15分間のために空白の背景から始まります。過熱幼虫を排除するためには、28の上方行かない画面温度がノートパソコンを購入するために最善℃ですアガロースレーン内の液体の蒸発を避けるために、最大の撮像時間を1時間未満に保たれるべきである。 </li><li>デジタルカメラは、実験ごとに300枚の合計ごとに6秒撮影、タイムラプス撮影にプログラムする必要があります。しかし、周波数および長さは、実験および行動の定量化に応じて調整することができる。過去の拡張イメージングの時代に各画像間の長い間隔を使用して使用した。カマー動画速度（毎秒30フレーム）で画像化のためのより低い解像度に設定することができる。低い解像度では、単一のマルチウェルプレートに録音を制限している間、ビデオ録画は、イメージング急速な水泳イベント15に適しています。 </li></ol> 4。画像解析<ol><li>画像はImageJので開くと特に社内で書かれたマクロで使用されるべきである。マクロが自動的に赤い色を除去することができるカラーチャンネルを分割し、バックグラウンドを減算し、しきい値を適用し、粒子分析により幼虫を識別する。 5レーン幼虫分析の最新マクロはZebrafish_macro25kです。画像の数、減算する色、イメージのしきい値などを設定するために、マクロのプロンプトを使用し</li><li>すべての画像は、ImageJのマクロを介して実行された後に、結果ファイルが表示され、Xが含まれ、yは画像番号とレーン番号と一緒に画像ごとに個別の幼虫の座標。 </李&gt; <li>結果ファイルは、Excel形式で保存した後、空白の背景対移動バーの背景とよく数に基づいてソートされるべきである。 Excelテンプレートが自動的にウェルに幼虫の配置を決定する方程式に組み込まれ、幼虫の間の距離、移動速度、および残りの量を有する使用されるべきである。最新のExcelテンプレートは、リクエストに応じて入手可能ですCretonラボで作成25ibです。さまざまな治療群を示すグラフは、治療群とコントロールとの比較のためにt検定と一緒にExcelシートに組み込まれなければならない。さらなる統計的分析はSPSSを用いて行うことができる。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

我々は継続的に我々の小説の行動アッセイを改善しているが、それは常にゼブラフィッシュ幼生15で回避と接触走性行動の検出に有用であった。多くの試験はそのような使用刺激の色として、アッセイの結果を最適化するために行われてきた、レーンあたりの幼虫、行動アッセイの長さの理想的な数。以前、我々は、マルチウェルプレート（6または12ウェルを有する）15,17,18を使用していました。しかし、最近我々は我々は、単一のアッセイ16（ 図5）における行動の措置の多くを収集できるようにする幼虫のための大きい水泳スペースを作成するための新しいレーン型を作成しました。その他の変更は、PowerPoint示す（アッセイの改変動きや長さ）と（我々はまた、より狭い車線のための金型を持っている）を使用レー​​ンの大きさのバリエーションが含まれています。 現在、このハイスループット自動化されたシステムは、zebrにおける行動の大規模な範囲を測定する独自の機能です。例えば、速度、回避、他の幼虫に近接し、マルチレーンプレート中の接触走性と同時にafish幼虫。結果を迅速に得ることができ、幼虫多数の撮影時に分析することができる。システムは、セットアップが構築する、安価で迅速かつ簡単なの両方です。このシステムの制約は、3次元運動がゼブラフィッシュ幼虫で評価することができないことである。大人のゼブラフィッシュを追跡する自動化システムは,3-D能力を有し、水柱10,19内で上下に移動などの動作の広い範囲を識別することができる。別の制限は、我々の撮像システムは、現在のビデオ速度でのハイスループット分析のために最適化されていないことである。低い解像度15にカメラを設定するときに、ビデオ速度撮像が可能であるが、これは単一のプレートに分析を制限する。 新しく作成された &quot;レーン&quot;メソッドを使用して、アッセイのいくつかの部分は、正確な方法で実行する必要があった。 Tにおける幼虫を配置するとき彼レーン、それはプレートがノートパソコンの画面の上に配置されるまで、液体のレベルが非常に浅いあることを確認することが重要です。レーンが液体のいっぱいである場合、幼虫は、プレートの外周にエスケープします。また、アガロースに金型を挿入する際に、注意が非常にゆっくりと金を下げるように注意する必要があります。金型が早すぎる挿入されている場合、気泡がアガロース中に形成され、追加の幼虫のようにイメージJマクロによって識別される。これは、アガロースレーンも少ない泡を持っている場合、それは新しいものを作るのがベストであることをお勧めします。 今後は、このようなゼブラフィッシュ幼生での学習など、他の複雑な挙動を分析し、学習を早期開発における毒性物質や医薬品への曝露によって影響を受ける可能性がある方法を調べるために私たちの行動のアッセイを最適化したいと思います。我々は現在の行動の結果は脳領域であるかを決定する容易のできる学習行動を分析するのに有用であり得るアッセイに取り組んでいます開発中に特定毒物または医薬品の影響を受ける。自動化されたアッセイは、ゼブラフィッシュの幼虫20と、これらのアッセイでの学習挙動を測定するために開発されているマルチレーンプレートで堅牢な回避反応を用いてハイスループットスクリーニングのために修正可能であってもよい。 我々は、この行動アッセイは、医薬品や毒物が多数発生への影響を試験するための今後の研究に用いることができることを提案する。このような研究は、特定のリスク要因に豊富な情報を提供し、妊娠中の女性と子供のためのよりよい健康と安全のガイドラインを設定に寄与する。

ゼブラフィッシュは、遺伝、発達や行動科学1-4のための普及したモデルになってきています。彼らは、2〜3日後に受精（DPF）で彼らのchorionsから孵化4-5 DPFで完全に機能する臓器を開発し、7 DPF 5,6によって行動を多数展示。ゼブラフィッシュの幼虫は、理想的にはサイズが小さいため7,8のハイスループット解析に適しています。ソフトウェアは、幼虫と成虫ゼブラフィッシュ9-14における行動の自動分析のために市販されている。しかしながら、このソフトウェアは高価であり、マルチウェルプレート中のゼブラフィッシュの幼虫の複雑な挙動を測定するための限られた選択肢を有することができる。 我々はセットアップが安価であり、7 DPFのゼブラフィッシュの幼虫15,16で異なる行動の数を定量化できる新規なハイスループットイメージングシステムを作成しました。システムは、数に胚の暴露後、私たちは迅速かつ効率的に微妙な行動異常をテストすることができます医薬品や環境毒物16-18。 システムは、キャビネットの上部にある家は、デジタルカメラの木製キャビネットを使用して構築されました。カメラは、ラップトップは15を上向きに画面が置かれるキャビネットの下部に下向き。タイムラプス撮影が車線内の幼虫の配置をキャプチャするために使用される。幼虫はノートパソコンの画面の上部に配置された4つのマルチウェルまたはマルチレーンプレートに中に収容することができる。私たちは、幼虫が遠ざかって（回避）とエッジ（接触走性）15,17に向かって泳いで応答するに嫌悪刺激としてPowerPointプレゼンテーションを使用しています。画像は、自動化されたマクロは、カラーチャンネルを分割バックグラウンドを引き算し、個々の幼虫を識別するためのしきい値を適用するために使用されるImageJのにインポートされる。座標は、各画像の各幼虫のために記載されています、我々は回避とthigmotaを定量化するために使用してExcelファイルに挿入することができます軸ロボットP行動、魚の距離に魚、泳ぐ速度、残り16の量。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>インスタントオーシャン</td><td>そのペットの場所</td><td>198262</td><td></td></tr><tr><td>アガロー</td>ス<td>フィッシャーBP1356-100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>そのペットの場所</td><td>214325<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Oneウェルプレート</td><td>フィッシャー12-565-493</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>キヤノン</td><td>EOS 反乱軍 T1i</td><td></td></tr><tr><td>イメージングキャビネット</td><td>ウッドクラフトタワー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラップトップ</td><td>エイサーアスパイ</td>ア <td>15.6インチである限り、どれでも良いです。1366 x 768ピクセルの解像度と220 cd / m2の明るさのLCDスクリーン。</td><td></td></tr><tr><td>カメラレンズ</td><td>Canon</td><td>EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS ズームレンズ</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックディフューザー</td><td>Pendaflex</td><td>52345</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</strong</td></tr><tr><td>>PowerPoint 2010</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a</td></tr><tr><td>>Excel 2010</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>統計ソフト</td><td>SPSS 20</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

私たちは、マルチレーンプレートに7日齢ゼブラフィッシュの幼虫の行動を分析するための新規ハイスループットイメージングシステムを作成しました。このシステムは、PowerPointプレゼンテーションを経由して幼虫に表示される自発的な行動や嫌悪刺激に対する応答を測定します。記録された画像を自動的にカラーチャンネルを分割ImageJのマクロで分析され、バックグラウンドを減算し、車線内の個々の幼虫の配置を特定するためにしきい値を適用する。我々はその後、泳ぐ速度、車線の端または側面のための好み、休息行動、接触走性、幼虫の間の距離、および回避行動を定量化するためのExcelシートに座標をインポートすることができます。行動の微妙な変化を簡単に環境毒物や医薬品への曝露後の行動分析のための、それが有用なもの、我々のシステムを使用して検出される。

我々の以前のアッセイにおいて、野生型の幼虫はよく（回避行動）でダウンして泳いで、よく（接触走性行動）15の端に向かって移動するボールに対応する、跳ねるボール嫌悪刺激を未処理のされている使用して。後ほど、このアッセイにおいて接触走性行動がゼブラフィッシュ幼生17で不安関連行動の尺度であることを確認した。空白の背景と比較した場合、幼虫の動きに大きな違いは、ボールとエッジのための好みからありました。これらの動作は、また移動赤いバーを使用して、私たちの新しいアッセイで確認され、さらに堅牢な16アールた。さらに、我々は今、泳ぐ速度、残り、井戸の終わりまたは側面を優先し、魚との距離（ 図5）を含む、単一のアッセイにおいて、行動の多くを試すことができます。卵の水で育った制御の幼虫が増加好みが皿に、レーンの端にダウンして見せる上げ装置は、それらが嫌悪刺激（赤いバーを移動）が掲載されています。幼虫1μgの/ mlのDMSO、一般に1,000 Xのストック溶液として種々の医薬品および毒性物質を溶解するために使用される溶媒を含む卵の水に成長させる場合にも同様の結果が得られる。 代表的な結果は、卵、水とDMSO（コントロールなど）と、一般的に非有機食品で見つかった有機リン系殺虫剤の様々な濃度で処理した幼虫で、図5に示されている。示された結果は一つの実験からのサンプリングです。しかし、繰り返されるとき、結果は泳ぐ速度と接触走性行動は、人間の食糧消費18のレベルを模倣する有機リン系殺虫剤の低濃度、によって変更されることを示している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig1.jpg" /> 図1。コレクショントレイ。ガラスパイレックス皿は、電子を収集するために使用されている成魚の水槽からmbryos。パイレックス皿から蓋を切断し、プラスチックグリッドと緑の糸がプラスチックでグリッド上に縫い付けていたと挿入した。これは、自然環境を模倣で大人ゼブラフィッシュの繁殖雰囲気を演出しています。 <img alt="図2" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig2highres.jpg" fo:width="6in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig2.jpg" /> 図2。プラスチック金型とアガロースレーン。 A）金型は、左に表示されています。 0.8％アガロースを1ウェルプレートに注ぎ、金型はゆっくり挿入し、アガロースが冷却されたときに削除されますB）右側のプレートは、プラスチック成形によりアガロースで作成されたレーンを示しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig3.jpg" /> 図3。イメージングキャビネット。イメージングキャビネットのspeciallあったyは我々の研究室で構築し、高スループットの行動分析に使用。 15メガピクセルデジタルカメラ、ノートパソコンの画面上に配置マルチ·プレートで幼虫のタイムラプス画像を収集するために下向きにキャビネットの頂部に取り付けた。プレートとスクリーンとの間に収集された画像におけるモアレを防止するために使用されるプラスチック製のディフューザがある。 <img alt="図4" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig4highres.jpg" fo:width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig4.jpg" /> 図4。空白の背景およびPowerPoint嫌悪刺激。これはゼブラフィッシュ幼生における行動の変化を喚起するために使用され、現在のパワーポイントです。それは）空白の背景およびB）移動赤いバーの間に堅牢な動作の違いを提供しています。 <img alt="図5" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig5highres.jpg" fo:width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig5.jpg" /> 図5。ハイスループットアッセイで定量行動。我々はX、幼虫のy座標に使用するExcelシート内の私達の行動のアッセイから定量化される行動の例。白いバーは空白の背景にさらされると赤のバーはPowerPointで赤移動バーにさらさ幼虫からのデータを表示幼虫からのデータを表示。グラフは）B、レーンの端にある幼虫の割合、C）レーンの端に幼虫の割合、D）との間に距離を車線内に幼虫の）パーセンテージダウン行動の分析から得られる測定値を示す魚（mm）の、E）は、幼虫の幼虫の速度（mm /分）、F）パーセンテージ残りを泳ぐ。図示のグラフでは、データはtreatmであるDMSOコントロールおよび0.001〜0.1μM（一般的に人間の食事で見つかったレベル）に至るまで、いくつかの農薬濃度の幼虫のENTは<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50622/50622fig5large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

我々の研究室では、7日齢のゼブラフィッシュの幼虫で、いくつかの異なる挙動の検出に有用な新規なハイスループット自動化されたイメージングシステムを開発しました。幼虫は、環境毒素又は薬剤に曝露された後にシステムが動作の微妙な変化を検出するために用いることができる。

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

本手順の全体的な目的は、毒性物質または医薬品で処理したゼブラフィッシュ幼魚における行動学的欠陥を特定することです。まず、胚または幼魚を回収し、発生後7日目まで化学物質で処理します。次に、専用の型を用いて泳行レーンを作成します。次に、処理した幼虫をアグロスレーンに配置し、タイムラプス撮影を用いて行動解析を行います。最終ステップとして、画像をImage Jにインポートし、院内で作成した特定のマクロを使用して、レーン内における幼虫のXY座標データを収集します。最終的に、このハイスループット行動アッセイを用いて、処理群間における回避行動やフィグマ軸行動、ならびに遊泳速度と静止時間の差を解析します。市販品などの既存の手法と比較して、本手法の最大の利点は、より複雑な行動を観察できる点にあります。また、構築コストが低く、セットアップも容易です。本手法は、胚発生の早期段階における毒性物質の曝露が脳の発達や行動にどのような影響を与えるかといった、行動神経科学分野における重要な問いに答える一助となります。また、本手法は、現在の他の毒性スクリーニングでは検出できないヒトにおける微細な脳の欠陥に関する知見を提供することも可能です。一般的に、この手法に不慣れな人は、幼魚の捕獲が困難であるため苦労することがあります。プロトコルに特注のシステムが含まれているため、各ステップには習得までの時間が必要であり、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。この手順を開始するには、緑色の毛糸で作られた擬似的な草を入れたパイレックス製ガラスシャーレを水槽に設置します。夜明けに、ゼブラフィッシュの胚を回収するため、シャーレを2時間水槽内に放置します。胚の入ったガラスシャーレの内容物を、脱イオン水で洗浄したハンドストレーナーに注ぎ入れます。次に、脱イオン水にInstant Oceanを60 mg/L、および防カビ剤としてメチレンブルーを0.25 mg/L加えた卵水中で胚を育成します。胚は、毒性物質による処理を行うまで、50 mLあたり50～60匹の密度で飼育するか、あるいはより大きな飼育タンクで飼育します。個々の実験の仮説に応じて、毒性物質または医薬品を用いて、胚を直ちに、あるいは発生の特定の段階で処理します。これらの薬剤は通常、DMSOに溶解させた後、卵水培地でさらに希釈して使用します。青色は、胚および幼魚への処置におけるビデオ実演目的で使用しています。幼魚および胚は、受精後7日目の行動解析まで、50 mLあたり約50〜60匹の密度で深いペトリ皿で飼育することが可能です。死んだ胚からの真菌や細菌の増殖を防ぐため、卵の水溶液は少なくとも2日に1回は交換してください。Thermo Scientific社のシングルウェルプラスチックプレートにアガロースを流し込み、レーンを作成するためのプラスチック製型を製作しました。モールドには、側面が60度の角度に傾斜した5つのレーンがあります。モールドとプレートの寸法については、このビデオに付随するテキストプロトコルを参照してください。まず、脱イオン水に60 mg/LのInstant Oceanを加えた溶液で0.8%アガロースを溶解し、アガロース溶液を調製します。次に、融解させたアガロースをシングルウェルプレートに50 milliliters注ぎ、レーンを作成します。その後、気泡の形成を防ぐため、液体アガロースの上に非常にゆっくりとモールドを配置します。アガロースが冷却されたら、モールドを取り除きます。arosレーンは、ディッシュの蓋を閉めた状態で、室温で最大36時間まで保存可能です。ハイスループットな行動解析を行うため、イメージングキャビネットを準備します。キャビネットの上部には15メガピクセルのデジタルカメラを、底面に向けて下向きに設置します。また、15.6インチ画面のノートパソコンを、画面を上に向けて配置します。幼虫の過熱を防ぐため、画面温度が 28 °C を超えないノートパソコンを使用することが最適です。アグロスプレートを配置するノートパソコンの画面の上に、プラスチック製のディフューザーを設置します。このディフューザーにより、収集される画像に不要なパターンが入るのを防ぐことができます。画像キャプチャを開始するために、幼魚へのストレスを軽減しながら、ペトリ皿からアグロスレーンへと慎重に移動させます。各レーンに最大20匹まで入れることができますが、遊泳速度を最も正確に追跡し、1回の実験に必要な幼魚の数を抑えるため、通常は1レーンあたり5匹を使用します。実験の内容に応じて、薬剤や毒性物質を含む、あるいは含まない卵水でレーンを満たしてください。液が溢れるのを防ぐため、イメージングキャビネットに設置するまでレーンを完全に満たさないようにしてください。順化期間の後、幼虫を10分間静置して慣らします。4枚のプレートを手でラップトップ画面の直上に配置します。このとき、レーンの端に影ができるのを防ぐため、卵、水、または化学処理剤をレーンの上端まで満たして水平にします。画像プログラムにおいて、タイムラプス撮影の設定を行い、1回の手順につき合計300枚となるよう6秒ごとに撮影するように設定します。ビデオ速度で撮影するために、カメラを低解像度に設定してください。低解像度に設定した場合、記録範囲はシングルマルチウェルプレート1枚に制限されます。ビデオ録画は、急速な遊泳イベントのイメージングに適しています。本デモンストレーションでは、幼魚に対する嫌悪刺激としてPowerPointプレゼンテーションを使用します。PowerPointは、まず15分間の空白の白い背景で始まり、続いてプレートの上半分に移動する赤いバーを15分間表示します。arosレーン内の液体の蒸発を防ぐため、最大イメージング時間は1時間未満に抑えてください。このデモンストレーションでは、ImageJで画像を開きます。5レーンの幼生解析用の自作マクロを使用しており、希望するユーザーに提供可能です。マクロのプロンプトを使用して、画像数や減算する色などのパラメータを設定します。すると、マクロが自動的にカラーチャンネルを分割し、赤色を除去できるようにします。「Subtracts the background」により、しきい値が適用され、粒子解析によって幼虫が特定されます。すべての画像をImage Jマクロで処理すると、各画像内の個々の幼虫のXY座標、画像番号、およびレーン番号を含む結果ファイルが表示されます。この結果ファイルをExcel形式で保存し、「空白の背景」と「移動バーの背景」でソートした後、ウェル番号でソートします。幼虫のウェル内での配置、幼虫間の距離、移動速度、および静止量を自動的に算出する数式が組み込まれたExcelテンプレートを使用してください。Cretin研究室で作成された最新のExcelテンプレートは、リクエストに応じて提供可能です。このExcelシートでは、さまざまな処理群のグラフ作成に加え、処理群とコントロール間の比較のためのT検定を行うことができます。さらに詳細な統計解析には、SPSS統計ソフトを使用することが可能です。ここでは、コントロールとして卵水およびDMSOで処理した幼虫と、非オーガニック食品に一般的に含まれる有機リン系殺虫剤をさまざまな濃度で処理した幼虫の結果を示します。ここでは、白いバーは空白の背景にさらされた幼魚のデータを示し、赤いバーは赤い移動バーにさらされた幼魚のデータを示しています。対照群。卵水で飼育した幼魚は、移動する赤いバーを提示した後、ディッシュの底に留まろうとする傾向が強まります。同様の結果は、さまざまな医薬品や毒性物質を1000倍濃度のストック溶液として溶解させる際によく使用される溶媒であるDMSOを1 µg/mL含む卵水で飼育した幼魚でも得られます。これらのグラフは、行動解析から得られる測定値を示しており、これにはレーン内で停止している幼魚の割合、レーンの端に位置する幼魚の割合、レーンの縁に位置する幼魚の割合、魚同士の距離、幼魚の遊泳速度、および幼魚が静止している時間の割合が含まれます。提示された結果は、1回の実験からのサンプルです。しかし、再現実験の結果、低濃度の有機リン系殺虫剤（ヒトの食品中に存在するレベルを模倣したもの）によって、遊泳速度およびfigma行動が変化することが示されています。習熟すれば、適切に実施することで、イメージングおよび画像解析は1時間半で完了させることができます。この手順において最も重要な点は、毎日新しい培地へと交換することで、培養液を清潔に保つことを忘れないことです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は光をインクリメントおよびデクリメントに対応して幼虫のゼブラフィッシュのモータ出力を定量化するために視覚運動応答を開発した。我々はまた別のビジョンアッセイ、視覚性運動反射によってテストするときに完全に盲目であると思われた視運動性応答（NRC）変異体、何を含めていないゼブラフィッシュのビジョンの変異を調べた。...

光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

我々は、マルチウェルプレートのゼブラフィッシュ遺伝子導入胚の自動化された画像と解析のためのシステムの開発について報告する。これは、線維芽細胞成長因子のレポーター遺伝子の発現に低分子化合物、BCI、の用量依存性の効果を測定し、高スループットのゼブラフィッシュの化学物質の画面を確立するための技術を提供する能力を示しています。...

ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。

このビデオでは、ゼブラフィッシュの幼生の回避とチグモタキシスアッセイについて説明しています。このビデオでは、視覚嫌悪刺激に反応したゼブラフィッシュの幼生の行動を調べています。...

ゼブラフィッシュの回避とチグモタキシスアッセイ:嫌悪的な視覚刺激に応答した幼虫の行動を調べるためのハイスループット法

この記事では、幼虫の運動を監視することにより、有毒化合物に対するゼブラフィッシュの行動反応について説明します。この議定書では、ゼブラフィッシュの幼生の環境汚染物質に対する反応の例をさらに見ています。...

幼虫ロコモーションアッセイ:ゼブラフィッシュ幼生における化合物の神経行動毒性を研究するためのハイスループット法

ゼブラフィッシュの個体やグループを追跡できる3D自動ビデオシステムの使用について説明しています。応用例として、NMDA受容体拮抗薬MK-801がゼブラフィッシュの群れに及ぼす影響について検討します。...

自動3D追跡システムを使用して、成魚のゼブラフィッシュの個体群と群れを記録

ここでは、設計し、高スループット ゼブラフィッシュ胚配列 96 ウェル プレートにそのようなテンプレートの利用に関する詳細な手順が続くテンプレートを配列複写するゼブラフィッシュ胚を作製するためのプロトコルを提案する.

3 次元 (3 D)-高スループット ゼブラフィッシュ胚配列複写のためテンプレートを印刷

このプロトコルの目的は、高スループット方法でゼブラフィッシュ稚魚の腸を介して蛍光に分類された食物の通過時間を測定することです。...

ゼブラフィッシュ稚魚を用いた消化管通過時間の高スループット測定

てんかんのゼブラフィッシュモデルにおける行動と生理学的解析

本稿では、大人のゼブラフィッシュのストレス行動を測定する簡単な方法について述べる。このアプローチは、ストレス状態にあるときにゼブラフィッシュがタンクの下半分を好むという生来の傾向を利用している。また、アッセイと薬理学を結合するための方法についても述べる。...

ゼブラフィッシュの先天性ストレスを研究する行動的アプローチ

本プロトコルは、MPTP処理済みゼブラフィッシュ幼虫における行動表現型パラダイムを確立し、パーキンソン病様の運動障害および非運動障害を評価することを目的としています。...

行動実験に基づくゼブラフィッシュ幼虫におけるMPTP誘導パーキンソン様行動表現型の表現型プロファイリング

学ぶゼブラフィッシュ幼生の自動化ハイスループット行動分析法。環境毒性物質や医薬品曝露後の行動変化を検出し、脳発達への影響を評価するコスト効率の良い手法です。

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

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