Name: Muis embryonale ontwikkeling in een Serumvrij Hele Embryo Cultuur System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Leer een serumvrije zuurstofrijke kweekmethode voor muisembryo's om embryonale ontwikkeling te bestuderen. Dit systeem ondersteunt morfologische ontwikkeling vergelijkbaar met in utero omstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Dr Julie Gordon en Dr Nancy Manley bedanken voor hun nuttige adviezen met de cultuur techniek. Dit werk werd ondersteund door de Children&#39;s Glaucoom Stichting en Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.

Muizenembryo cultuur: Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen volgende protocol # A2010 07-119, die werd beoordeeld en door de Universiteit van Georgia Institutional Animal Care en gebruik Comite, dat bleef regelgevend toezicht houdt goedgekeurd. 1. Voorbereiding van Cultuur Media <ol><li> Bereid kweekmedium in de handel verkrijgbare stamcel media en supplementen in de volgende hoeveelheden: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Vervangende (KSR) (10%) N-2 supplement (1x), albumine uit runderserum (2%), penicilline ( 50 IE / ml), streptomycine (50 ug / ml) en amfotericine B (1,25 ug / ml). Het kweekmedium bereid is gelijk aan die eerder beschreven 15 met de volgende wijzigingen: toevoeging van antimycotica en met tweemaal de concentratie antibiotica (voor details van specifieke reagentia en apparatuur, zie List van Materialen). Opmerking: antibioticumconcentratie zoals eerder gebruikt (. Moore-Scott, et al. 15) was voldoende voor embryocultures uitgevoerd tot 24 uur periode. Wanneer cultuur na 24 uur werd voortgezet, we ondervonden verontreiniging van de kweek en dit werd succesvol gecontroleerd door een verdubbeling van de concentratie antibioticum. </li><li> Bewaar de mediacomponenten bij 4 ° C of bij -20 ° C volgens aanbevelingen van de fabrikant. KSR en N-2 supplement worden in porties bewaard bij -20 ° C tot herhaaldelijk bevriezen en ontdooien te voorkomen. KnockOut DMEM eenmaal geopend moet worden gebruikt binnen 30 dagen volgens aanbevelingen van de fabrikant. Voor gebruik verwarmen van de componenten in een waterbad tot 37 ° C. </li><li> Bereid de media onder steriele omstandigheden. Ontsmet het oppervlak van alle apparatuur en flessen die de media componenten met 70% alcohol spuiten voordat u ze in de cultuur kap. </li><li> De media componenten kunnen hetzij in een steriele beker of direct in het filtersysteem (Corning) gemengd. Voeg eerst de albumine poeder om de knock-out DMEM. Meng goed door zachtjes schudden totdat de albumine volledig oplost. Voeg vervolgens de N-2 Supplement, KSR en de antibiotica en meng met behulp van een pipet. Vervolgens filteren steriliseren de media met behulp van een 0,22 um poriegrootte filter met afzuiging. Breng het materiaal in 50 ml conische buizen en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. De media eenmaal voorbereid moeten worden gebruikt binnen 4-5 dagen voor cultuur. </li></ol> 2. Voorbereiding van Cultuur Equipment <ol><li> Steriliseer de glazen cultuur flessen en rubber kurken. Wikkel de cultuur flessen in een aluminiumfolie en plaats de rubber kurken in een water beker en steriliseer in de autoclaaf. </li><li> Steriliseer de cultuur kamer (Precision Incubator Unit) met 70% alcohol spray en warm tot 37 ° C voordat de cultuur. De cultuur kamer is egrapte met een rollende schijf in het midden, die de cultuur flessen houdt. Gasstroom in de kamer wordt geregeld door een manometer en het debiet kan door het observeren van de uitstroom van luchtbellen door het water in een glazen buis aan het einde. Deze rollende fles cultuur apparaat is een aangepaste versie van het originele apparaat geïntroduceerd door nieuwe en Cockroft 17. </li><li> Sluit een gasfles met een gasmengsel van 95% O 2/5% CO 2 bij de kweekkamer en stel de gasstroom &quot;een luchtbel per seconde&quot; met een stroomsnelheid van 50 cc / min geeft en dat een adequate zuurstoftoevoer de cultuur embryo. </li></ol> 3. Muis Embryo verzamelen en bereiden voor Cultuur <ol><li> Met wild-type muis embryo&#39;s te verkrijgen, hebben we gebruik gemaakt van muizen C57BL/6J en CD-1 (Charles River Laboratories) genetische achtergrond stammen. </li><li> Controleer de vrouwelijke muizen voor vaginale plugs elke dag &#39;s ochtends. Het uur op de dag van het vinden van the vaginale plug moet worden beschouwd als E0.5 DPC (dagen na de coïtus). </li><li> Verzamel muizenembryo&#39;s op E10.5 dpc door euthanizing de zwangere muizen volgende standaard protocollen. Muizen werden gedood met behulp van een CO 2 inhalatie-apparaat, zoals gespecificeerd door de American Veterinary Medical Association (AVMA) Richtsnoeren voor de euthanasie van dieren (2013). Om dodelijke verzekeren, werd cervicale dislocatie uitgevoerd na blootstelling aan CO2. </li><li> Spray 70% ethanol aan de ventrale abdominale oppervlak kleven van abdominale haar te vermijden de instrumenten. Open vervolgens de buikholte ventraal met een scherp-botte operationele schaar en een paar 4-3/4 in microdissecting tang om de baarmoeder te lokaliseren. Met een 4 in microdissecting tang heffen de gehele baarmoeder en scheiden van het lichaam door snijden met een lichte werkende schaar op de baarmoeder lichaam en bij de uiteinden van de baarmoederhoorns. </li><li> Snel spoel de gehele baarmoeder in 1x PBS verwarmd tot 37 ° Ceen bloedtest plakken verwijderen om de baarmoeder en direct plaats in DMEM verwarmd tot 37 ° C in een petrischaal. Steriliseren van de instrumenten met 70% ethanol spuiten vóór verder gebruik. Opmerking: Voorverwarmen oplossingen waaronder PBS, DMEM en het kweekmedium en handhaven ervan bij 37 ° C gedurende de gehele procedure wordt aanbevolen. </li><li> Onder een microscoop ontleden, moet de baarmoeder per segment worden ontleed met een lichte operationele schaar. Dit resulteert in kleine openingen aan weerszijden van de gesegmenteerde baarmoeder waardoor een paar gemodificeerde (afgestompte uiteinden) microdissecting pincet voorzichtig kan worden opgenomen de opening verbreden. Hierdoor kan de blootstelling van de placenta decidua, die vervolgens kan worden verwijderd door voorzichtig scheuren met een paar microdissecting pincet om de pariëtale dooierzak (PYS) bloot aan de Reichert&#39;s membraan. Met de ene rand van de pincet voorzichtig doorboren de Reichert&#39;s membraan met de PYS en scheiden van ee van viscerale dooierzak (VYS) laag om de embryo&#39;s bloot met intacte VYS. De ectoplacental kegel en trophoectoderm derivaten kunnen worden verwijderd of met de placenta decidua of de Reichert&#39;s membraan. Zorg moeten worden genomen om breuk van de VYS voorkomen als de embryo&#39;s pop uit onmiddellijk. </li><li> De embryo&#39;s met intacte VYS moet dan worden overgebracht naar een petrischaal met het kweekmedium verwarmd tot 37 ° C met een plastic overdracht pipet. Opmerking: Transfer naar kweekmedium direct na afscheiding van baarmoeder draagt ​​voor een betere ontwikkeling van het embryo in kweek. </li><li> Een kleine opening moet worden gemaakt in de dooierzak met een paar pincetten microdissecting grote bloedvaten voorkomen. Een scherpe pincet kan worden gebruikt om de opening te maken door voorzichtig piercing in een gebied grenzend aan het hoofdgebied. Ook twee paar stompe pincet kan worden gebruikt om de dooierzak houden en voorzichtig scheuren een kleine opening te maken.Dan zachtjes verbreden de opening door de uitbreiding met de pincet om juist groot genoeg om de embryonale hoofd past. De amnionmembraan die nauw wikkelen het embryo moet voorzichtig van het lichaam worden gehouden en gescheurd met een pincet. De embryonale hoofd en later het hele embryo moet voorzichtig worden naar buiten gebracht uit de dooierzak behoud van de integriteit van de embryonale vasculatuur met die van de dooierzak 15. Opmerking: Eventuele schade aan de dooierzak vaatstelsel kan mogelijk invloed hebben op de ontwikkeling van het embryo in de cultuur. Dergelijke embryo&#39;s met beschadigde bloedvaten mag niet worden gebruikt voor kweek en kan worden gebruikt voor het organiseren van de embryo&#39;s die later kunnen worden verwijderd. </li><li> Embryonale staging criteria: Onderzoek de embryo&#39;s onder de microscoop ontleden en groeperen op morfologische criteria, waaronder lichaam en hoofd grootte, ledematen en oog morfologie en het stadium door het tellen van het aantal somiet (s) gedurende ten minste twee embryo&#39;s van elke groep. &lt;strong&gt; Opmerking: Meestal embryo&#39;s verkregen uit hetzelfde nest vertonen verschillen in de ontwikkeling in de baarmoeder en verschillen in lichaamsgrootte, morfologische kenmerken en het aantal somieten. Toch vonden we dat embryo&#39;s gegroepeerd op onze morfologische criteria meestal tentoongesteld soortgelijke somiet nummer (± 1). Daarom is het niet nodig om voor elk embryo somieten tellen omdat dit de tijd voor het starten van de kweek vertragen. Opmerking: de embryo&#39;s die werden gebruikt om de somieten voor cultuur tellen niet gebruiken. Tel de somieten na aanvang van de kweek van andere embryo&#39;s om de vertraging in het starten van de kweek te voorkomen. De embryo&#39;s die werden uitgesteld tot cultuur na afscheiding van de baarmoeder meestal vertonen een slechte ontwikkeling. </li><li> Breng de embryo onmiddellijk een petrischaal met vers kweekmedium verwarmd tot 37 ° C en het naar de cultuur kap wanneer de embryo weer worden overgebracht naar een petrischaal met steriele cule media alvorens ze in de cultuur flessen met medium om de cultuur te starten. Opmerking: De meerdere media transfers voor de embryo&#39;s vóór cultuur helpt bij het ​​voorkomen van besmetting met de verschillende stappen van het embryo en de dissectie werden uitgevoerd onder een dissectie microscoop die niet in de cultuur kap is geïnstalleerd. Opmerking: Wanneer het nest groot is (&gt; 12 embryo&#39;s), proces de helft van de embryo&#39;s en start de cultuur of leg ze in een schotel met kweekmedium en plaats deze in een CO 2 incubator bij 37 ° C. Wanneer embryo&#39;s buiten werden gelaten voor een langere periode (&gt; 35-40 min) zagen we de hartslag te vertragen en dit zal invloed hebben op de latere ontwikkeling in de cultuur. </li></ol> 4. Het kweken van muizenembryo&#39;s <ol><li> Open de geautoclaveerde cultuur flessen in de cultuur kap en correct te labelen. Overdracht 3 ml kweekmedium verwarmd tot 37 ° C voor elk van de thij flessen en vervolgens de muis embryo&#39;s moet voorzichtig in de cultuur flessen met steriele plastic pipetten worden overgedragen. De cultuur flessen moet vervolgens worden afgedekt met rubber kurken die helpen om de cultuur flessen houden om de rollende schijf in de cultuur apparaat. Opmerking: De cultuur flessen met de media kan worden voorbereid en geplaatst op de rollende schijf van de cultuur apparaat voordat euthanizing de muizen. Dit verkort de tijd voor overdracht van embryo&#39;s in de cultuur flessen. Opmerking: muizenembryo&#39;s kunnen afzonderlijk of als hulpkweken met twee of drie embryo&#39;s in dezelfde cultuur fles worden gekweekt. </li><li> De cultuur flessen moeten aseptisch worden uitgevoerd aan de kweek inrichting bij 37 ° C en ze stevig aansluiten op de openingen in de rollende schijf met de rubber kurken. Zet de rollende schijf roteren met een constante snelheid van 35 omwentelingen per minuut (rpm), die vrij opdrijven van de embr maaktJo&#39;s in de media en helpt ook in de vrije gasuitwisseling door de embryonaal weefsel. Het gas uit de cilinder verbonden met de kweekkamer stroomt door de rollende schijf en de rubber kurken in de cultuur flessen. </li><li> Cultuur van de embryo&#39;s voor 16-40 uur en regelmatig te controleren op de gas uitstroom en cultuur kamertemperatuur. Opmerking: muis embryo manipulatie cultuur: Laat de embryo&#39;s krijgen aangepast aan de kweekomstandigheden gedurende tenminste 30 minuten. Dan embryo&#39;s die slecht presteren en tonen zwakke hartslag kan worden verwijderd en de resterende embryo&#39;s worden gebruikt voor verdere manipulatie studies. Embryo manipulaties zoals elektroporatie 5,9,16, 18 micro-injecties, kraal implantatie 16, medicamenteuze behandeling en andere procedures kunnen worden uitgevoerd op dit moment. We succes uitgevoerd implantatie van Affi-gel agarose parels behandeld met bepaalde signaalmoleculen hun rol in de vroege ontwikkeling oog bestuderen. De embryo namanipulaties kunnen worden geretourneerd in een vers medium en bleef in de cultuur. </li><li> Vervang het kweekmedium volledig met verse media op bepaalde tijdstippen na 9-10 uur en 18-19 uur van de cultuur als de cultuur werd gedurende 40 uur. Opmerking: Cultuur media teniet kan worden vereist als de cultuur wordt gestopt door 16-18 uur. </li><li> Maatstaven voor succes in cultuur: embryonale overleving in cultuur moet worden bepaald door zichtbare hartslag en bloedcirculatie in het lichaam, terwijl embryonale groei in de cultuur dient te worden beoordeeld door de toename van de lichaamsgrootte, somiet aantal en de morfologische ontwikkeling van het hoofd, de ledematen, het hart en de ogen. </li><li> In de baarmoeder ontwikkeld embryo&#39;s in E11.0 DPC (~ 40-41 s) en E12.0 DPC (~ 49-50 s) moeten worden gebruikt als controle voor het vergelijken van embryo&#39;s gekweekt voor 16-18 uur en 38-40 uur, respectievelijk. </li><li> Embryonale ontwikkeling op verschillende tijdstippen gedurende de cultuur en in de baarmoeder stadia worden captbestrooide onder dissectiemicroscoop. Spot imaging software werd gebruikt om de beelden vast te leggen en later verwerkt met behulp van software voor beeldverwerking. </li></ol>

<ol><li>Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+BMP4+signaling+is+critical+for+the+regulation+of+distinct+T-box+gene+expression+domains+and+growth+along+the+dorso-ventral+axis+of+the+optic+cup%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup.</a> BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).</li>
<li>Gray, J., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tube+closure+in+mouse+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neural tube closure in mouse whole embryo culture.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+mouse+development%3A+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).</li>
<li>Miura, S., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-embryo+culture+of+E5.5+mouse+embryos%3A+development+to+the+gastrulation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage.</a> Genesis. 37, 38-43 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Yokoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+in+rodent+whole-embryo+culture+are+reprogrammed+to+contribute+to+kidney+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).</li>
<li>Sadler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+early+somite+mouse+embryos+during+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Culture of early somite mouse embryos during organogenesis.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).</li>
<li>Kitchin, K. T., Ebron, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+development+of+rodent+whole+embryo+culture%3A+solvent+toxicity+and+water+insoluble+compound+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system.</a> Toxicology. 30, 45-57 (1984).</li>
<li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Different%22%5BJournal%5D)">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).</li>
<li>Cuthbertson, R. A., Beck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+whole+embryo+culture%3A+a+new+method+for+studying+ocular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).</li>
<li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+explanted+rat+embryos+in+circulating+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Development of explanted rat embryos in circulating medium.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).</li>
<li>Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+and+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentially+modulate+cytotoxic+effect+of+nitric+oxide+generated+by+serum+deprivation+in+neuronal+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells.</a> J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).</li>
<li>Sasaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+Shc+proteins+in+mitogenic+signaling+induced+by+insulin%2C+insulin-like+growth+factor-1%2C+and+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor.</a> J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).</li>
<li>Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cAMP+signaling+pathways+differentially+regulate+alpha2C-adrenoceptor+expression%3A+role+in+serum+induction+in+human+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).</li>
<li>Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+serum-free+in+vitro+culture+technique+for+midgestation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos.</a> Genesis. 35, 164-168 (2003).</li>
<li>Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-Free+Culture+of+Mid-gestation+Mouse+Embryos%3A+A+Tool+for+the+Study+of+Endoderm-Derived+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs.</a> Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).</li>
<li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li>
<li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+in+culture+of+rat+foetuses+explanted+at+12.5+and+13.5+days+of+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).</li>
<li>Zeeb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+manipulation+of+blood+and+lymphatic+vascularization+in+ex+vivo-cultured+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos.</a> Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).</li>
<li>Wawersik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP7+acts+in+murine+lens+placode+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">BMP7 acts in murine lens placode development.</a> Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Greenfield, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+lowers+Alzheimer+beta-amyloid+generation+by+stimulating+trans-Golgi+network+vesicle+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis.</a> J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).</li>
<li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+generation+of+C57BL%2F6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39, 100-104 (2004).</li>
<li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, 649-643 (2009).</li>
<li>Totonchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-+and+serum-free+establishment+and+expansion+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).</li>
</ol>

We hebben geen concurrerende financiële belangen.

Mid-dracht stadium muizenembryo&#39;s werden gekweekt in een serumvrij kweekmedium in een atmosfeer van 95% O 2/5% CO 2 in een rollende fles cultuur apparaat bij 37 ° C. Embryo ex utero was sterk afhankelijk van meerdere factoren bij elke stap in de procedure vanaf het moment dat de baarmoeder wordt geïsoleerd uit de muizen gedood om de voltooiing van de kweek (Figuur 1). De belangrijkste factor die de ontwikkeling invloed was de tijd voor de kweek te starten. De andere kr...

In vitro kweek methoden gebruik te maken van hele embryo&#39;s zijn zeer geschikt om te studeren signalering mechanismen die betrokken zijn bij de embryonale organogenese die anders moeilijk te bereiken in de baarmoeder. Hele embryo&#39;s bieden de weefsel integriteit en geschikt is voor het weefsel interacties die cruciaal zijn voor het tijdig voorkomen van signaleringsmechanismen essentieel zijn ondersteuning voor verschillende cellulaire processen tijdens organogenese. Terwijl de hele embryo culturen bieden een platform voor een overvloed aan toepassingen zoals transplantatie studies, genetische en weefsel manipulaties, kraal implantatie studies, toxicologische studies, enz., Momenteel toegepast embryo cultuur systemen zijn voornamelijk afhankelijk van het serum voor een goede groei en het onderhoud van de embryo&#39;s in de cultuur 1-9. Serum is gebruikt als een van de belangrijkste componenten vinden van 10-100% van het kweekmedium 6-8, 10, 11., De samenstelling van serum is niet goed gedefinieerd en kunnen van dier tot dier en elke keer het serum verzameld. Terwijl laboratorium voorbereiding van het serum is tijdrovend en het gaat om strenge procedures, serum verkregen commercieel vertoont een aanzienlijke variatie tussen verschillende partijen en verhoogt experimentele kosten. Naast deze, kan het serum onbekende factoren zoals groeifactoren, hormonen of andere eiwitten, die mogelijk invloed hebben op de uitkomst van bepaalde experimenten, met name die de studie van signaalmoleculen belangrijk weefselinteractie inhouden. Studies hebben aangetoond dat toevoeging van serum cultuur mogelijk de intracellulaire niveaus van bepaalde signaalmoleculen zoals cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) en eiwitten betrokken bij mitogene signalering en fosfoinositide 3 (PI3)-kinase signaalwegen 12-14 kan veranderen. Anders dan deze, een serumvrije biedt de voordelen van antigeen vrije omgeving,onthouding van biologisch actieve enzymen die de cellulaire processen veranderen en maakt samenhang tussen experimenten. In de huidige studie hebben we gebruik gemaakt van een serum-vrij kweekmedium bereid uit in de handel verkrijgbare stamcel media aanvullingen op cultuur medio zwangerschap stadium hele embryo&#39;s in een atmosfeer van 95% O 2/5% CO 2 in een rollende fles cultuur apparaat bij 37 ° C 15,16. Muizenembryo&#39;s gekweekt gedurende 16-40 uur onder deze gedefinieerde omstandigheden vertoonden progressie morfologische ontwikkeling van embryonale totale lichaam en verschillende structuren zoals het hart, ledematen, hersenen en de ogen aangeeft passende niveaus van cellulaire proliferatie, migratie, differentiatie en weefsel interacties. Moleculaire analyse van de embryonale ontwikkeling in de cultuur van een van de complexe orgaansystemen zoals het oog bleek de oculaire ontwikkeling overeen met die waargenomen bij oculaire weefsel embr teJo&#39;s ontwikkelen in de baarmoeder (Kalaskar en Lauderdale, in voorbereiding). Zo tonen we muizenembryo&#39;s gekweekt halverwege zwangerschap stadium vertonen progressieve groei en morfologische ontwikkeling vergelijkbaar met die waargenomen bij embryo ontwikkeling in utero.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Stock: 100x</td></tr><tr><td>Albumine, uit bovien serum</td><td>Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Stock: 100%</td></tr><tr><td>Antibiotic - Antimycotic Oplossing</td><td>Cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td>Stock: Penicillin (10.000 IU/ml); Streptomycin (10.000 &micro;g/ml; Amphotericin (250 &micro;g/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Precision Incubator Unit</td><td>B.T.C. Engineering Milton Cambridge England</td><td>Id.No. 840-374</td><td></td></tr><tr><td>Glasflessen voor roterende eenheid</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siliconenrubberkurk</td><td>B.T.C. Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2 Cilinder</td><td>AirGas Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Water Jacketed Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>Model: 3110</td><td></td></tr><tr><td>Cultuurkap</td><td>Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2</td><td>Model: Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>IsoTemp205</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Mettler Toledo</td><td>AG285</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuis, 50 ml</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Licht werkend schaar</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Scherp-Blunt werkend schaar&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Microdissectiepincet, 4 inch</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Microdissectiepincet - Hudson (cWALD), 4-3/4 inch</td><td>Roboz</td><td>RS-5237</td><td></td></tr><tr><td>Microdissectiepincet (5/45)</td><td>Roboz</td><td>RS-5005</td><td>Gemodificeerd - Scherpe uiteinden zijn stomp gemaakt</td></tr><tr><td>Microdissectiepincet (5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5060</td><td>Gemodificeerd - Scherpe uiteinden zijn stomp gemaakt</td></tr><tr><td>Microdissectiepincet (55)</td><td>Roboz</td><td>RS-5063</td><td>Gemodificeerd - Scherpe uiteinden zijn stomp gemaakt</td></tr><tr><td>Instrumentenlade</td><td>Roboz</td><td>RT-1401S</td><td></td></tr><tr><td>Deksel voor instrumentenlade</td><td>Roboz</td><td>RT-1401L</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal-100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>087571Z</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal-60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal-35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>Filtersysteem ( 0,22 &micro;m cellulose acetaat)-150 ml</td><td>Corning</td><td>431153</td><td></td></tr><tr><td>Filtersysteem (0,22 &micro;m cellulose acetaat)-250 ml</td><td>Corning</td><td>430756</td><td></td></tr><tr><td>Filtersysteem (0,22 &micro;m cellulose acetaat)-500 ml</td><td>Corning</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid Pipettor</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>D57849</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipet-10 ml</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp serologische Pipet-25 ml</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipet - 7,7 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>202-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

muis embryonale ontwikkeling in een serumvrij hele embryo cultuur system

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-dracht stadium muizenembryo&#39;s werden gekweekt met behulp van een serum-vrij kweekmedium bereid uit in de handel verkrijgbare stamcel media supplementen in een zuurstofrijk rollende fles kweeksysteem. Muizenembryo&#39;s op E10.5 werden zorgvuldig geïsoleerd uit de baarmoeder met intacte dooierzak en werkwijzen waarbij nauwkeurige chirurgische handeling de embryo voorzichtig werden naar buiten gebracht vanuit de dooierzak terwijl de vasculaire continuïteit van de embryo met de dooierzak. Vergeleken met embryo&#39;s voorbereid met intacte dooierzak of met de dooierzak verwijderd, deze embryo&#39;s tentoongesteld superieure overleving en ontwikkeling progressie indien gekweekt onder vergelijkbare omstandigheden. We zien dat deze muizenembryo&#39;s, indien gekweekt in een gedefinieerde medium in een atmosfeer van 95% O 2/5% CO 2 in een rollende fles kweek inrichting bij 37 ° C gedurende 16-40 uur, vertonen morfologische groei en ontwikkeling vergelijkbaar de embryo ontwikkeling in utero. Wij geloven eis de methode nuttig zal zijn voor onderzoekers om hele embryo cultuur gebruiken om signalering interacties belangrijk in embryonale organogenese bestuderen.

Ontwikkeling van muizenembryo&#39;s ex utero afhankelijk van meerdere factoren vanaf het moment dat de baarmoeder wordt geïsoleerd uit het lichaam en het moment van embryo&#39;s gekweekt. Zoals weergegeven in figuur 1, de procedure omvat een aantal stappen, waaronder scheiding van de zwangere baarmoeder van de behuizing (Figuur 1A), isolatie van de embryo&#39;s met intacte dooierzak (Figuur 1B), uittreding van de embryo&#39;s uit de dooierzak ( figuur 1...

Serum gebruikt in embryocultures bevat onbekende componenten die het resultaat van experimenten vooral in studies met signalering interacties beïnvloeden. Hier gebruikte we een serumvrij zuurstof kweeksysteem aantonen dat mid-dracht muizenembryo&#39;s gekweekt gedurende 16-40 uur vertonen morfologische ontwikkeling vergelijkbaar embryo ontwikkeling in utero.

Muis embryonale ontwikkeling in een Serumvrij Hele Embryo Cultuur System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Het algemene doel van deze procedure is om een serumvrij, zuurstofrijk kweeksysteem te gebruiken om specifieke aspecten van de embryonale ontwikkeling van muizen te bestuderen en te manipuleren. Dit wordt bereikt door eerst de baarmoeder met embryo's van de moedermuis te isoleren. De tweede stap is om de embryo's met een intacte dooierzak te scheiden van de placentale decidua na segmentale dissectie van de baarmoeder.Vervolgens moeten de embryo's voorzichtig uit de dooierzak worden gehaald terwijl de integriteit van de embryonale vasculaire structuur wordt gehandhaafd. De laatste stap is om de embryo's in een serumvrij, zuurstofrijk rollend fles kweekapparaat bij 37 graden Celsius voor een specifieke hoeveelheid tijd te kweken. Uiteindelijk kan dit volledige embryo kweeksysteem, dat de ontwikkeling van verschillende structuren ondersteunt op zowel morfologisch als moleculair niveau, worden gebruikt voor de studie van zich ontwikkelende muizenembryo's met behulp van verschillende technieken.Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden op het gebied van ontwikkelingsbiologie, zoals de rol van verschillende signaalmechanismen in sulfaatspecificatie en weefselmorfogenese in het zic

mouse-embryonic-development-serum-free-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel presenteren we een eenvoudige methode om op lange termijn in staat...

Een Ex-ovo Chicken Embryo Cultuur systeem geschikt voor Imaging en microchirurgie toepassingen

Een methode waardoor de directe farmacologische manipulatie van muis embryo's tijdens neurulatie dat maternale metabolisme omzeilt wordt beschreven. De techniek kan worden aangepast aan de verschillende aspecten van de neurulatie studie door het variëren van het tijdstip en farmacologische agent.

Neurale buis sluiting in Mouse Whole Embryo Cultuur

The video describes the procedure for developing serum-free embryoid bodies (SFEBs) from neuronal progenitor cells using various serum-free differentiation mediums or DM. DM-2 facilitates neurons' maturation and arrangement to form SFEBs, while DM-3 is used for further growth maintenance.

Development and Maintenance of Serum-Free Embryoid Bodies

Cultuur van het hele embryo van zoogdieren (WEC) wordt veel gebruikt in de teratology en ontwikkelingsbiologie. Direct gecentrifugeerd rattenserum wordt vaak geleverd als medium voor zowel muis- als ratten-WEC. In deze video demonstreren we ons standaardprotocol voor de bereiding van hoogwaardig rattenserum dat geschikt is voor zoogdier-WEC.

Voorbereiding van de Rat Serum Geschikt voor zoogdieren Hele Embryo Cultuur

Dit protocol beschrijft in detail de methode voor het genereren van neurale progenitoren uit embryonale stamcellen met behulp van een serumvrije monolaagmethode. Deze progenitoren kunnen worden gebruikt om rijpe neurale celtypen te verkrijgen of om het proces van neurale specificatie te bestuderen en is geschikt voor schaalvergroting in multiwell-formaat voor compound screening.

Neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in serum-vrije monolaagkweek

Dit protocol verschaft een werkwijze voor het verzamelen van muis embryonale stamcellen (mES) -geconditioneerd medium (mES-CM) verkregen uit serum (foetaal bovine serum, FBS) - en feeder (muis embryonale fibroblasten MEF) vrij voorwaarden voor een cel -gratis aanpak. Het kan dienstig voor de behandeling van veroudering en veroudering-geassocieerde ziekten.

Het verzamelen van serum en Feeder-vrij muis embryonale stamcellen geconditioneerd medium voor een Cell-free Approach

Een verbeterd platform voor de kweek van hele embryo's maakt een continue en robuuste ex utero-ontwikkeling van postimplantatiemuismyo's gedurende maximaal zes dagen mogelijk, van pregastrulatiestadia tot gevorderde organogenese. In dit protocol beschrijven we de standaardprocedure voor succesvolle embryokweek met behulp van statische platen en roterende flessystemen.

Ex Utero Kweek van muizenembryo's van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese

We presenteren een gedetailleerd protocol voor het kweken en beeldvorming van muizenembryo's dat 3D + tijdbeeldvorming van cardiale voorlopercellen mogelijk maakt. Deze video-toolkit behandelt de belangrijkste vaardigheden die nodig zijn voor succesvolle live imaging die anders moeilijk te verkrijgen zijn uit tekstpublicaties.

Live beeldvorming van vroege cardiale voorlopers in het muizenembryo

Dit protocol beschrijft methodologieën om een eenvoudig en efficiënt in-vitromodel voor embryo-implantatie op te zetten voor het evalueren van de relevante moleculen die het embryo-implantatieproces beïnvloeden.

Opstelling van een embryo-implantatiemodel in vitro

Dit protocol beschrijft procedures voor in-vitro rijping van muis-oocyten, in-vitrofertilisatie en daaropvolgende embryokweek tot het blastocyststadium.

Muize-oocyt in vitro rijping, bevruchting en kweek van pre-implantatie embryo's

Leer een serumvrije zuurstofrijke kweekmethode voor muisembryo's om embryonale ontwikkeling te bestuderen. Dit systeem ondersteunt morfologische ontwikkeling vergelijkbaar met in utero omstandigheden.

Muis embryonale ontwikkeling in een Serumvrij Hele Embryo Cultuur System

Meer video's verkennen