Name: Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Leer hoe je met click-chemie transcriptieactiviteit in virusgeïnfecteerde cellen analyseert. Deze methode gebruikt fluorescente aziden om nieuw gesynthetiseerd RNA in 293-cellen te visualiseren zonder radioactieve isotopen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken RB Tesh voor het verstrekken van de muis polyklonale anti-RVFV antiserum en M. Griffin van de UTMB flowcytometrie Core Facility voor hulp bij flowcytometrie. Dit werk werd ondersteund door 5 U54 AI057156 via de Western Regional Center of Excellence, NIH-subsidie ​​R01 AI08764301, en de financiering van de Sealy Center for Vaccine Development bij UTMB.BK werd gesteund door de James W. McLaughlin Fellowship Fund op UTMB.OL werd ondersteund door een Maurice R. Hilleman Early-Stage Career Investigator Award.

Analyse van transcriptie bij fluorescentiemicroscopie 1. Infecteren cellen met MP-12 en Label ontluikende RNA met EU <ol><li> Plaats 12-mm round dekglaasjes in 12-well weefselkweek plaat, een dekglaasje per putje. </li></ol> Opmerking: Als cellen hebben moeite zich te houden aan dekglaasjes, jas met poly-L-lysine (MW ≥ 70.000) voordat u het in putten. Hiertoe dompel dekglaasjes in een steriele 0,1 mg / ml oplossing in H2O van poly-L-lysine gedurende 5 minuten. Spoel coverslips met steriele H 2 O en de lucht drogen gedurende minstens 2 uur. <ol start="2"><li> Om zaad 293-cellen op dekglaasjes, voeg 5 x 10 4 cellen in 1 ml groeimedium (DMEM dat 10% foetaal bovien serum, 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine) per putje. Incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 O / N. </li><li> Cellen infecteren met MP-12 bij een multipliciteit van infectie (moi) van 3. Ten minste twee<html> geïnfecteerde putten: een van de twee putten zal dienen als de niet-geïnfecteerde controle, zal de ander worden behandeld met actinomycine D (ActD) bij stap 1.5 als controle voor transcriptionele onderdrukking. Verwijder groeimedium en los het virus stock zodat het totale volume toegevoegd aan elk putje wordt 200 ml. Incubeer gedurende 1 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol> Opmerking: In plaats van het infecteren van cellen, kunnen cellen worden getransfecteerd met plasmide DNA of in vitro gesynthetiseerd RNA coderend voor een specifieke virale eiwit. Hiertoe cellen te transfecteren met een geschikt chemisch transfectie reagens volgens de instructies van de fabrikant en verdergaan naar stap 1.5 op 16 uur na transfectie. Het is raadzaam om de transfectie voorwaarden en incubatietijd optimaliseren voordat RNA etikettering en fixatie. <ol start="4"><li> Verwijderen inoculum en voeg 1 ml vers groeimedium per well. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 uur. </li></ol>ove_content &quot;&gt;. Opmerking: Als de aanpassing van deze protocol voor gebruik met een ander virus, is het raadzaam om een tijdsverloop experiment uit te voeren om het optimale tijdstip voor RNA etikettering en fixatie bepalen Stel dit tijdsverloop, zodat de infectie tijden zijn gespreid en al monsters kunnen worden gelabeld, gefixeerd en gekleurd op hetzelfde moment. <ol start="5"><li> Op 15 uur na infectie (hpi), vervang groeimedium met medium dat 1 mM EU. Om een ​​van de mock geïnfecteerde putten, ook 5 ug / ml ActD voegen. Dit zal dienen als controle voor transcriptionele onderdrukking, zoals ActD remt DNA-afhankelijke RNA-synthese. Cellen terug in de incubator. </li><li> Op 16 hpi, verwijder het medium en een keer was de dekglaasjes met 1 ml PBS (KCl 0,20 g / L, KH 2 PO 4 0,20 g / L, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / L, pH 7,4) per putje. Fix cellen door toevoeging van 1 ml van 4% paraformaldehyde (PFA) per putje en het incuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol>Opmerking: Voor 4% PFA fixatie oplossing te bereiden, los 10 g paraformaldehyde in 150 ml H 2 O verwarmd tot 60 ° C op een verwarmde magneetroerder. Voeg 500 ul van 1 M NaOH en blijf roeren totdat de oplossing helder wordt. Filter PFA oplossing door een papieren filter om deeltjes te verwijderen en voeg 62,5 ml fosfaatbuffer (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM Na 2 HPO 4, pH 7,4). Voeg H 2 O tot een totaal volume van 250 ml. Bevriezen bij -20 ° C in aliquots eenmalig gebruik. <ol start="7"><li> Was eenmaal met 1 ml PBS per well. Geen incubatietijd voor deze en alle daaropvolgende wasstappen. Gaat u direct naar stap 2. </li></ol> Opmerking: Het is belangrijk om onmiddellijk met de click reactie, zoals de RNA degenereert indien bewaard in dit stadium voor langere tijd, een verlies van de RNA fluorescentiesignaal bestaat reeds als cellen gedurende 1 uur bij 4 ° C . Evenzo, als perde vorming van een tijdsverloop experiment, moet u het etiket, repareren, en vlekken alle monsters tegelijk. 2. Klik op Reactie op Detect gelabelde RNA <ol><li> Permeabilize cellen door toevoeging van 1 ml 0,2% Triton X-100 in PBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol> Opmerking: Alle oplossingen in stappen 2,1-2,3 moeten nuclease vrij. <ol start="2"><li> Spoel driemaal met 1 ml PBS per well. </li><li> Verwijder de dekglaasjes van 12-well plaat en de overdracht in de vochtige kamer. Bedek elk dekglaasje met 50 - 100 ul klik kleuring oplossing (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CUSO4, 20 uM fluorescerende azide [excitatie / emissie maximaal: 590/617 nm], 100 mM ascorbinezuur) elk. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li></ol> Opmerking: Om de vochtige kamer, lijn assembleren de bodem van een celkweek of een petrischaal met een diameter van 10 cm met plastic folie paraffine. Bekleed de binnenkant van de rand van de dish met vochtige papieren handdoeken. Plaats de dekglaasjes op de plastic paraffine folie. Opmerking: Wees voorzichtig niet te laten de dekglaasjes uitdrogen tijdens deze of een andere stap in het protocol. Het beste is om de kleuroplossing elk dekglaasje direct nadat deze is geplaatst in de vochtige kamer voegen. Opmerking: Maak de klik kleuroplossing verse onmiddellijk voorafgaand aan deze stap. Voorraadoplossingen van 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM CUSO4 en 500 mM ascorbinezuur kunnen bij 4 ° C worden bewaard Echter, moet u alle ascorbinezuur voorraad oplossing die geel is geworden. Opmerking: Zorg ervoor dat u een fluorofoor die overeenkomt met de filters op uw fluorescentiemicroscoop selecteren. <ol start="4"><li> Verwijder de dekglaasjes van vochtige kamer en plaats in een frisse 12-well plaat en drie keer wassen met 1 ml PBS per well. </li></ol> Opmerking: Als er geen debescherming van virale eiwitten gewenst, dekglaasjes worden gemonteerd afgebeeld na deze stap (ga naar stap 3.3). 3. Immunofluorescentie tot Expressie van virale eiwitten Detect <ol><li> Voeg 1 ml blokkerende buffer (3% (w / v) runderserumalbumine (BSA) in PBS) aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Verwijder de dekglaasjes van 12-well plaat, overdracht in vochtige kamer en dek af met 50 - 100 ul van primair antilichaam (anti-RVFV, een soort geschenk van dr. RB Tesh, UTMB) verdund in het blokkeren van buffer (1:500). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li></ol> Opmerking: Bij de aanpassing van het protocol voor gebruik met een ander virus, de optimale verdunning van het primaire antilichaam eerste. Opmerking: Als alternatief kan deze stap worden uitgevoerd O / N bij 4 ° C in het donker. <ol start="3"><li> Verwijder de dekglaasjes van vochtige kamer en plaats terug in 12-well plaat en wassendrie maal met 1 ml PBS per putje. </li><li> Verwijder de dekglaasjes van 12-well plaats, plaats in de vochtige kamer en dek af met 50 - 100 ul van secundair antilichaam (anti-muis IgG geconjugeerd met fluorescente kleurstof [excitatie / emissie maximaal: 495/519 nm]) verdund in het blokkeren van buffer (1: 500). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li></ol> Opmerking: Zorg ervoor dat u een secundair antilichaam dat uw primaire antilichaam kan herkennen en past de filters op uw fluorescentiemicroscoop selecteren. Opmerking: Indien gewenst, kan 200 ng / ml DAPI worden toegevoegd aan het secundaire antilichaam verdunning kernen visualiseren. <ol start="5"><li> Verwijder de dekglaasjes van vochtige kamer en plaats terug in 12-well plaat en drie keer wassen met 1 ml PBS per well. </li><li> Monteren dekglaasjes door het plaatsen van een druppel (ca. 15 pl) van Fluoromount-G op een objectglaasje. Dompel de dekglaasje in H 2 O, verwijder overtollige H 2 O door het aanraken van the kant tegen een papieren handdoek, en plaats cel-kant naar beneden in de druppel Fluoromount-G. Lucht drogen gedurende 5 minuten. </li></ol> Opmerking: Als beeldvorming op een omgekeerde microscoop, zodat Fluoromount-G te stollen bij 4 ° CO / N of brengt de dekglaasjes om de microscoop dia door het afdichten van de rand met transparante nagellak. Opmerking: Dia kan onmiddellijk worden afgebeeld of opgeslagen bij 4 ° C in het donker gedurende een week. 4. Overname van gegevens <ol><li> Beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop. </li></ol> Opmerking: Zorg ervoor dat geschikte fluoroforen die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van uw microscoop te selecteren. Ter referentie, de volgende zijn de fluoroforen en filter sets gebruikt om de afbeeldingen in deze publicatie te verwerven. DAPI: Excitatiefilter: BP 330-385 Dichromatic spiegel: 400 DM Emissiefilter: LP 420 Excitatiefilter: BP 460-490 Dichromatic spiegel: 505 DM Emissiefilter: LP 510 Fluorofoor met een excitatie / emissie maximum van 590/617: Excitatiefilter: BP 545-580 Dichromatic spiegel: 600 DM Emissiefilter: LP 610 Analyse van transcriptie bij flowcytometrie 5. Infecteren cellen met MP-12 en Label ontluikende RNA met EU <ol><li> Seed 293 cellen in 6-well weefselkweek plaat in groeimedium (DMEM dat 10% foetaal runderserum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine). Incubeer in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 totdat cellen 80 bereikt - 100% confluentie. </li><li> Cellen infecteren met MP-12 bij een moi van 3. Ten minste twee geïnfecteerde putjes: een van de twee putjes zal dienen als de niet-geïnfecteerde controle, de andere behandeld met ActD in stap5.4. Verwijder groeimedium en verdun het virus voorraad, zodat het totale volume toegevoegd aan elk putje wordt 400 ul. Incubeer gedurende 1 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Verwijderen inoculum en voeg 2 ml vers groeimedium per well. Incubeer bij 37 ° C gedurende 12 uur. </li></ol> Opmerking: Als het protocol aanpassen voor gebruik met een ander virus, is het raadzaam om een tijdsverloop experiment om het optimale tijdstip te bepalen voor het coderen en oogsten voeren. Zet dit tijdsverloop waardoor de infectie tijd worden gespreid en alle monsters kunnen worden gelabeld, geoogst en gekleurd tegelijkertijd. <ol start="4"><li> Op 12 hpi, vervang groeimedium met medium dat 0,5 mM EU. Om een ​​van de mock geïnfecteerde putten, ook 5 ug / ml ActD voegen. Dit zal dienen als controle voor transcriptionele onderdrukking, zoals ActD remt DNA-afhankelijke RNA-synthese. Cellen terug in de incubator. </li><li> Op 13 hpi, wassen cellen eenmaal verstandh PBS en oogst door behandeling met trypsine van cellen. Wassen geoogste cellen driemaal met PBS bevattende 1 mM EDTA (PBS-EDTA). </li></ol> Opmerking: Tijdens deze en volgende stappen, niet cellen gecentrifugeerd sneller dan 500 - 1000 xg naar cel breuk te voorkomen. Centrifugeer cellen voor 1 - 2 min. aan sediment. Opmerking: Als een oppervlak immunostaining is gepland na de klik reactie, oogst met een rubberen politieman of wegwerp celschraper plaats. <ol start="6"><li> Fix cellen door resuspenderen in 1 ml van 4% PFA en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Zie stap 1.6 voor instructies over hoe te bereiden 4% PFA. </li><li> Was eenmaal met 1 ml PBS-EDTA per well. Gaat u direct naar stap 6. </li></ol> Opmerking: Het is belangrijk om direct door te gaan met de klik reactie, zoals de RNA degenereert als het wordt bewaard in dit stadium voor langere tijd. Evenzo, als het uitvoeren van een tijd course experiment, er zeker van te labelen, repareren en vlekken op alle monsters tegelijk. 6. Klik op Reactie op Detect gelabelde RNA <ol><li> Permeabilize cellen door resuspenderen in 0,5 ml 0,2% Triton X-100 in PBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol> Opmerking: Alle oplossingen die gebruikt worden in de stappen 6,1-6,3 moeten nuclease vrij te zijn. Opmerking: Als cellen niet goed sediment tijdens deze stap, verhogen de tijd centrifugeren 5 minuten. Sedimentatiegedrag zal verbeteren in een keer cellen worden gesuspendeerd in FACS-buffer (stap 6.4). <ol start="2"><li> Was eenmaal met 1 ml PBS. </li></ol> Opmerking: EDTA niet gebruiken in deze stap, omdat dit zal cheleren de Cu2 +-ionen die noodzakelijk zijn voor de click reactie. <ol start="3"><li> Resuspendeer cellen in 200 pi klik kleuring oplossing (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CUSO4, 200 nM azide gelabeld met fluorescerende kleurstof [excitation / emissie maximaal: 650/665 nm], 100 mM ascorbinezuur). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li></ol> Opmerking: Maak de klik kleuroplossing verse onmiddellijk voorafgaand aan deze stap. Voorraadoplossingen van 1,5 M Tris pH 8,5, 100 mM CUSO4 en 500 mM ascorbinezuur kunnen bij 4 ° C worden bewaard Echter, moet u alle ascorbinezuur voorraad oplossing die geel is geworden. Opmerking: Als cellen samenklonteren tijdens deze stap, resuspendeer door en neer te pipetteren meerdere malen. Opmerking: Zorg ervoor dat u een fluorofoor die kan worden gedetecteerd door uw flowcytometer selecteren. Opmerking: Bereid ook een monster van geïnfecteerde cellen die niet zijn onderworpen aan de klik kleuring procedure, die nodig zijn voor de kalibratie van de flowcytometer. Gebruik ofwel de helft van de geïnfecteerde cellen of voorzien van een extra goed geïnfecteerd bij stap 5.2. Deze concontrole cellen worden immunologisch bij stap 7.1. <ol start="4"><li> Was tweemaal met FACS buffer (PBS met 1 mM EDTA en 0,5% (w / v) BSA). </li></ol> Opmerking: Indien geen immunokleuring van virale eiwitten gewenst is, kunnen cellen worden meteen geanalyseerd (door naar stap 8). 7. Immunofluorescentie tot Expressie van virale eiwitten Detect <ol><li> Resuspendeer cellen in 200 ul van primair antilichaam (anti-RVFV) verdund in FACS buffer (1:10.000) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li></ol> Opmerking: Als alternatief kan deze stap worden uitgevoerd O / N bij 4 ° C in het donker. Opmerking: Bereid ook een monster van geïnfecteerde cellen die werden blootgesteld aan de klik kleuringsprocedure maar niet immunologisch, zullen deze nodig zijn voor de kalibratie van de flowcytometer. Gebruik ofwel de helft van de mock geïnfecteerde cellen of voorzien van een extra niet-geïnfecteerde goed opstap 5.2. Opmerking: Bij de aanpassing van het protocol voor gebruik met een ander virus, de optimale verdunning van het primaire antilichaam eerste. <ol start="2"><li> Was tweemaal cellen in FACS buffer. </li><li> Resuspendeer cellen in 200 pl secundair antilichaam (anti-muis IgG geconjugeerd met fluorescente kleurstof [excitatie / emissie maximum: 495/519 nm]) verdund in FACS buffer (1:1000) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Was de cellen eenmaal in FACS buffer. </li></ol> Opmerking: Op dit punt, kunnen cellen worden opgeslagen O / N bij 4 ° C in het donker. 8. Overname van gegevens <ol><li> Resuspendeer cellen in 500 pi FACS buffer, overdracht in 5 ml polystyreen buizen en analyseren met behulp van een flowcytometer. Gebruik MP-12 geïnfecteerde cellen (geen klik reactie, anti-RVFV alleen kleuring) en mock-geïnfecteerde cellen (klik enige reactie) om het instrument te kalibreren. </li></ol> Niete: Zorg ervoor dat geschikte fluoroforen die kunnen worden gedetecteerd door het instrument te selecteren. Ter referentie, de volgende zijn de laserlijnen en filter sets gebruikt om de in deze publicatie gegevens te verkrijgen. Fluorofoor met een excitatie / emissiespectrum van 495/519: Laser: 488 nm Filter: 530/30 Fluorofoor met een excitatie / emissiespectrum van 650/665: Laser: 640 nm Filter: 670/20

<ol><li>Fakan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+support+for+RNA+synthesis+in+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Achiev.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus.</a> Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).</li>
<li>Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+RNA+synthesis+using+bromouridine+labelling+and+bromodeoxyuridine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies.</a> Cytometry. 14, 455-458 (1993).</li>
<li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+solid+phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-triazoles+by+regiospecific+copper%28i%29-catalyzed+1%2C3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+rift+valley+fever+virus+promotes+posttranslational+downregulation+of+the+TFIIH+subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Kalveram, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+inhibits+host+transcription+independently+of+the+degradation+of+dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR.</a> Virology. , (2012).</li>
<li>Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Rift+Valley+fever+virus+NSs+encoding+a+partial+truncation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation.</a> PLoS One. 7, e45730(2012).</li>
<li>Lihoradova, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Rift+Valley+Fever+Virus+MP-12+Strain+Encoding+NSs+of+Punta+Toro+Virus+or+Sandfly+Fever+Sicilian+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus.</a> PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181(2013).</li>
<li>Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toscana+Virus+NSs+Protein+Promotes+Degradation+of+Double-Stranded+RNA-Dependent+Protein+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase.</a> J. Virol. , (2013).</li>
<li>Schmaljohn, C., Nichol, S. In Fields Virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams and Wilkins. 1741-1789 (2007).</li>
<li>Le May, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagen-directed+attenuation+of+Rift+Valley+fever+virus+as+a+method+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development.</a> J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+Rift+Valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+viral+RNA+by+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. , e4002(2012).</li>
<li>Reich, E., Goldberg, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinomycin+and+nucleic+acid+function%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Actinomycin and nucleic acid function.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).</li>
<li>Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+of+fluorochromes+to+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De protocol beschrijft een methode om het effect van virale infecties aan gastheercel transcriptie gemeten via incorporatie van de uridine analoge EU in wording RNA. Deze werkwijze heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerdere methoden: het is snel, gevoelig, en niet afhankelijk van het gebruik van radioactieve isotopen. Verder kan de werkwijze worden aangepast om kwalitatieve gegevens opleveren door fluorescentiemicroscopie of kwantitatieve gegevens via stroomcytometrie door toepassing van vrijwel dezelfde rea...

<html> Traditioneel is transcriptionele activiteit werd gemeten door incorporatie van zowel radioactieve (3H-uridine) 1 of gehalogeneerde (BRU) 2 nucleosiden in ontluikende RNA. Deze uridine analogen worden door cellen, omgezet in uridine-trifosfaat (UTP) via nucleoside salvage pathway, en vervolgens opgenomen in nieuw gesynthetiseerde RNA. 3H-uridine kan worden gedetecteerd door autoradiografie, die tijdrovend of scintillatie tellen, die gespecialiseerde apparatuur vereist. Bovendien kan het gebruik van radioactieve isotopen niet praktisch zijn in een aantal laboratoria instellingen, waaronder high containment biosafety laboratoria. Bru kan worden gedetecteerd door immunokleuring met anti-bru antilichamen die hard permeabilisatie noodzakelijk kunnen de toegang van het antilichaam aan de kern of gedeeltelijke denaturatie van RNA, zoals RNA secundaire structuur kan een sterische hindering voor antilichaambinding te verzekeren. _content &quot;&gt; De hier beschreven protocol maakt gebruik van de recent ontwikkelde chemie op 3 om transcriptionele activiteit te meten in cellen geïnfecteerd met de stam RVFV MP-12. Instructies chemie gebaseerd op een zeer selectieve en efficiënte koper (I)-gekatalyseerde cycloadditie reactie tussen een alkyn en een azide groep 4,5. In dit protocol ontluikende RNA in geïnfecteerde cellen wordt eerst gemerkt door incorporatie van de uridine analoge EU. In een tweede stap wordt het opgenomen EU gedetecteerd door reactie met een fluorescerende azide. De belangrijkste voordelen van deze werkwijze zijn (1) dat zij niet het gebruik van radioactieve isotopen vereisen en (2) dat het niet hard permeabilisatie of denaturatie van RNA vereisen. met een molecuulgewicht van minder dan 50 Da, toegang van de fluorescerende azide wordt niet belemmerd door onvoldoende permeabilisatie of RNA secundaire structuur. Bovendien zijn de onderzoekers niet beperkt in hun keuze van primaire antilichamen bij het combineren van de detectie van RNA met een klasical immunostaining voor virale eiwitten. Twee verschillende werkwijzen zijn in dit protocol: een voor visualiseren transcriptie via fluorescentiemicroscopie (stappen 1-4), en een voor het kwantificeren transcriptie door flowcytometrie (stappen 5-8). Beide methoden combineren coderen van ontluikende RNA met intracellulair immunokleuring voor virale eiwitten, die zorgt voor een verband tussen transcriptionele activiteit en virale infectie van een cel per cel basis. De auteurs hebben met succes het protocol beschreven om transcriptionele activiteit te bepalen in cellen geïnfecteerd met de stam RVFV MP-12 6, cellen geïnfecteerd met verschillende MP-12 mutanten 7,8, 9 en cellen geïnfecteerd met virus Toscana (TOSV) 10. De hier beschreven protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met verschillende virussen en heeft het potentieel om te worden aangepast om immunofluorescentie kleuring van specifieke virale of cellulaire eiwitten omvatten.

<table><tbody><tr><td>5-ethynyl-uridine</td><td>Berry Associates</td><td>PY 7563</td><td>oplossen in DMSO voor 100 mM stock</td></tr><tr><td>12-mm ronde dekglasjes</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polystyreen buisjes</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycine D (ActD)</td><td>Sigma</td><td>9415</td><td>oplossen in DMSO voor 10 mM stock</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Rund Serum Albumine (BSA) </td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2323</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>C-8027</td><td>oplossen in H2O voor 100 mM stock</td></tr><tr><td>DAPI </td><td>Sigma</td><td>D-9542</td><td>oplossen in H2O voor 5 mg/ml stock</td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent azide (Alexa Fluor 594-gekoppeld)</td><td>Invitrogen</td><td>A10270</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent azide (Alexa Fluor 657-gekoppeld)</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>oplossen in H2O voor 500 mM </td></tr><tr><td>papierfilter</td><td>VWRbrand</td><td>28333-087</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde </td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine (MW &#8805; 70000)</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>oplossen in H2O voor 1.5 M stock, pH 8.5</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td></td><td></td><td>bijv. Olympus IX71</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td></td><td></td><td>bijv. BD Biosciences LSRII Fortessa</td></tr></tbody></table>

met click chemie aan het effect van de virale infectie meet op host-cel rna synthese

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Veel RNA virussen zijn geëvolueerd de mogelijkheid gastheercel transcriptie remmen als middel om cellulaire afweer omzeilen. Voor de studie van dergelijke virussen, is het daarom belangrijk om een ​​snelle en betrouwbare manier van meten transcriptionele activiteit in geïnfecteerde cellen. Traditioneel is transcriptie ofwel is gemeten door incorporatie van radioactieve nucleosiden zoals 3H-uridine gevolgd door detectie via autoradiografie of scintillatietelling, of opname van gehalogeneerde uridine analogen zoals 5-bromouridine (BRU) gevolgd door detectie door immunokleuring. Het gebruik van radioactieve isotopen, vereist echter speciale apparatuur en niet haalbaar in een aantal laboratoria instellingen waarbij de detectie van bru omslachtig kan zijn en lijden aan lage gevoeligheid. De chemie recent ontwikkelde klik, dat een koper-gekatalyseerde triazool vorming van een azide en een alkyn gaat, biedt nu een snelle en highly gevoelig alternatief voor deze twee methoden. Klikchemie is een tweestaps werkwijze waarbij ontluikende RNA wordt eerst gemerkt door incorporatie van de analoge uridine 5-ethynyluridine (EU), gevolgd door detectie van de label een fluorescent azide. Deze aziden zijn beschikbaar als verschillende fluoroforen, waardoor een breed scala van opties voor visualisatie. Dit protocol beschrijft een methode om transcriptionele onderdrukking te meten in cellen geïnfecteerd met het Rift Valley fever virus (RVFV) stam MP-12 met behulp van click chemie. Tegelijkertijd wordt de expressie van virale proteïnen in deze cellen bepaald door klassieke intracellulaire immunokleuring. Stappen 1 tot 4 detail van een methode om transcriptionele onderdrukking visualiseren via fluorescentie microscopie, terwijl stap 5 tot 8 detail van een methode om transcriptionele onderdrukking kwantificeren via flowcytometrie. Dit protocol is eenvoudig aanpasbaar voor gebruik met andere virussen.

De NSS eiwit van RVFV (Bunyaviridae familie, genus Phlebovirus) 11 remt gastheercel algemene transcriptie via twee verschillende mechanismen: (i) door het sekwestreren p44 subeenheid van de basale transcriptiefactor TFIIH 11 en (ii) bevordering van de proteasomale afbraak van p62 subeenheid van TFIIH 6. De RVFV MP-12 vaccinspanning 13 is gebruikt voor de in dit protocol beschreven experimenten sinds MP-12 stam kan worden behandeld in een bioveiligheidsniveau ...

Deze methode beschrijft het gebruik van klikchemie op veranderingen in gastheercel transcriptie meten na infectie met het Rift Valley fever virus (RVFV) stam MP-12. De resultaten kunnen worden gevisualiseerd kwalitatief via fluorescentie microscopie of verkregen kwantitatief via flowcytometrie. Deze methode kan worden aangepast voor gebruik met andere virussen.

Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de transcriptionele activiteit in virusgeïnfecteerde cellen te analyseren. Infecteer eerst de 293-cellen met het rift valley fever-virus, MP-12. Label de cellen vervolgens met het uridine-analoog 5-ethynyl-uridine, dat wordt ingebouwd in nascent RNA. Koppel daarna het ingebouwde 5-ethynyl-uridine aan een fluorescent azide om nieuw gesynthetiseerd RNA te visualiseren. De verkregen resultaten maakten het mogelijk om verschillen in de hoeveelheid nieuw gesynthetiseerd RNA tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen vast te stellen op basis van fluorescentiemicroscopie of flowcytometrie.In tegenstelling tot markering met tritiüm-uridine of 5-broomuridine, vereist deze click-chemiebenadering geen gebruik van radioactieve isotopen. Het is bovendien sneller en gevoeliger dan anti-broomuridine-immunokleuring. Het idee voor deze methoden komt voort uit onze behoefte aan een snelle en betrouwbare manier om transcriptiesuppressie te meten in cellen die zijn geïnfecteerd met verschillende rift valley fever virus, MP-12.Plaats ronde dekglasjes van 12 millimeter in elke put van een weefselkweekplaat met 12 putten. Zaai vervolgens 293-cell

using-click-chemistry-to-measure-effect-viral-infection-on-host-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Adenovirus deeltjes zijn ontworpen om zowel de onnatuurlijke aminozuur analoog azidohomoalanine of de azido suiker...

Chemoselectieve Wijziging van Viral oppervlakken via bioorthogonal Klik Chemie

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

This video demonstrates an assay to evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry into host cells and fusion with the endosome. The cells are incubated at a low temperature and then infected with HCV. The low temperature permits viral binding to host cells but inhibits internalization via endocytosis. The test antiviral compound is added, and the cells are incubated at physiological temperature. This shift to a higher temperature facilitates viral entry and allows...

An Assay to Evaluate the Effect of Test Compounds on Viral Entry and Fusion in Host Cells

In vitro assays om virusreplicatie te meten zijn sterk verbeterd door de ontwikkeling van recombinante RNA-virussen tot expressie luciferase of andere enzymen die in staat bioluminescentie. Hier hebben we detail een high-throughput screening pijplijn dat dergelijke recombinante stammen van mazelen en chikungunya virussen breed-spectrum antivirale middelen te isoleren van chemische bibliotheken combineert.

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

We beschrijven het gebruik van een fluorescerende reporter koepokkenvirus die real-time meting van de virale besmettelijkheid en genexpressie in staat stelt door middel van het podium-specifieke expressie van spectraal verschillende reporter fluoroforen. We detail een plaat gebaseerde methode voor het nauwkeurig vaststellen van de fase waarin het virus replicatie wordt beïnvloed in reactie op kleine molecule remming.

Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Methoden om de werkzaamheid en toxiciteit van RNA-moleculen die zich richten op post-integratie stappen van de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren, worden beschreven. Deze methoden zijn nuttig voor het screenen van nieuwe moleculen en het optimaliseren van de indeling van bestaande.

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie analyse gecombineerd met omgekeerde transcriptie (RT-qPCR) is wijd verbeid gebruikt voor het meten van het niveau van de RNA-virusinfecties. Hier presenteren we een directe RT-qPCR assay, die niet een RNA-zuivering hoeft, ontwikkeld voor de kwantificering van verschillende RNA virussen, met inbegrip van dengue virus.

Meten van Dengue Virus RNA in het Supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen door Real-time kwantitatieve Polymerase-kettingreactie

Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

Leer hoe je met click-chemie transcriptieactiviteit in virusgeïnfecteerde cellen analyseert. Deze methode gebruikt fluorescente aziden om nieuw gesynthetiseerd RNA in 293-cellen te visualiseren zonder radioactieve isotopen.

Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Meer video's verkennen