Name: Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-11T23:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Leer het redden van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA door zoogdiercellen te infecteren met een helpervirus en te transfecteren met plasmiden. Deze methode ondersteunt vaccinontwikkeling en therapeutisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Auteurs willen graag naar het verleden en de huidige leden te bedanken in de laboratoria van Drs. Peter Palese en Adolfo García-Sastre voor de ontwikkeling van NDV reverse genetics technieken en voor technische ondersteuning. Onderzoek in Newcastle disease-virus in AG-S laboratorium wordt gedeeltelijk gefinancierd door NIAD verlenen R01AI088770 en door het Department of Homeland Security Science &amp; Technology Center of Excellence voor opkomende en Zoonotic dierziekten (CEEZAD, award nummer 2010-ST-061-AG001). Onderzoek in LM-S laboratorium wordt gefinancierd door de NIH subsidies RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, de NIAID Centers of Excellence voor Influenza Onderzoek en Surveillance (HHSN266200700008C), en de Universiteit van Rochester Centrum voor Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C) .

1. Bereiding van zoogdiercellen (Figuur 4A, dag 1) Split HEp-2-cellen of A549 de dag voor transfectie in platen met 6 putjes. Dichtheid van de cellen moet 80-90% confluentie bereikt de volgende dag. Meestal kan een confluente 100 mm schaal worden verdeeld in 8 putjes (ongeveer 1 x 10 6 cellen per well). Voor elk virus worden gered, moet 2-4 verschillende bronnen zijn mogelijk en 2 extra bronnen voor de besturing pCAGGS-GFP en pCITE-GFP 18, gericht op transfectie en MVA-T7 infectie-efficiënties bewaken, respectievelijk. 2. Infectie van zoogdiercellen met de recombinante Modified Vaccinia Ankara virus dat het bacteriofaag T7 RNA polymerase (MVA-T7) (Figuur 4A, Dag 2) <ol><li> Warmen PBS 1x/BA/PS en media bij 37 ° C. </li><li> Was de cellen tweemaal met 1 ml PBS 1x/BA/PS. </li><li> Infect gekweekte zoogdiercellen met het MVA-T7 virus bij een multipliciteit van infectie (MOI) Van 1 pfu / cel in een eindvolume van 200 ul in PBS / BA / HS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Tijdens virale infectie incubatie bereiden de transfectie mix zoals beschreven in 3. </li></ol> 3. Transfectie van zoogdiercellen (Figuur 4A, Dag 2) <ol><li> Bereiding van Lipofectamine: Meng 1-2 ug LPF2000 met 250 ul per OptiMEM reddingspoging en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Voorbereiding van DNA: Maak een plasmide cocktail voor elke redding in 50 ul van OptiMEM. Voeg 0,4 ug pTM1-NP, 0,2 ug pTM1-P en 0,2 ug pTM1-L per buis. Voeg 1 pg van de volledige lengte cDNA kloon van NDV worden gered aan elke buis. Bereiden ook twee controle transfecties, een met 2 ug pCAGGS-GFP (tot transfectie-efficiëntie te controleren) en de andere met 2 ug pCITE-GFP (om te controleren T7 polymerase gedreven expressie door de MVA-T7). </li><li> Na de LPF2000-OptiMEM oplossing werd 5 min voorgeïncubeerd (stap 3.1), voeg 250pl van de oplossing van het DNA buizen (stap 3.2) en incubeer gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na incubatie met MVA-T7, verwijder de virusinoculum door aspiratie en te vervangen door de DNA-LPF2000 transfectiemengsel (stap 3.3). </li><li> Voeg 1 ml DMEM 10% FBS / PS elk gerecht. </li><li> Incubeer de geïnfecteerde / getransfecteerde cellen gedurende 6-8 uur (of overnacht) bij 37 ° C, 5% CO2 en vervang de transfectie media met 1,5 ml vers DMEM 10% FBS / PS. </li><li> Op 24 uur na transfectie, kan controleputjes onder een fluorescentie microscoop worden waargenomen transfectie efficiëntie (pCAGGS-GFP) en T7 polymerase activiteit (pCITE-GFP) (figuur 5A) beoordelen. Ga verder met de co-cultuur van de geïnfecteerde / getransfecteerde cellen met aviaire fibroblasten zoals hieronder beschreven. </li></ol> 4. Co-cultuur van zoogdiercellen met vogelcellen (Figuur 4A, Dag 3) Meestal een confluente 100 mm weefselkweek schotel van kip (CEF) or eend (DEFS) fibroblasten wordt gebruikt per twee getransfecteerd putten. Zorg ervoor dat u voor te bereiden, op voorhand, genoeg 100 mm weefselkweek gerechten van vogelcellen per alle reddingspogingen. Voor doeltreffende redding van het virus wordt DMEM 10% FBS / HS medium aangevuld met 5% van allantoïsvloeistof en 30 mM MgCl2. Op dit moment, 24 uur pi, zoogdiercellen kan beginnen met cytopathisch effect (CPE) door MVA-T7 infectie asevident in figuur 5A. <ol><li> Warmen PBS 1x en media tot 37 ° C. </li><li> Was zoogdiercellen, 2x met 1 ml PBS 1x. </li><li> Trypsinize zoogdiercellen met 0,2 ml EDTA-trypsine tot ze losgemaakt. Resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM 10% FBS / PS, 5% allantoïsvloeistof, 30 mM MgCl2 en overbrengen in een 100 mm weefselkweekplaat. Voeg 3 ml van dezelfde media. </li><li> Was vogelcellen, tweemaal met 4 ml PBS 1x. </li><li> Trypsinize aviaire cellen met 1 ml trypsine-EDTA en incubeer gedurende 1-2 minuten bij 37 ° C tot cellen los. Hersuspenderen the cellen toevoegen van 8 ml DMEM 10% FBS / PS, 5% allantoïsvloeistof, 30 mM MgCl2 en 4 ml van de cellen getrypsiniseerd de zoogdiercellen in de co-gekweekt 100 mm weefselkweekplaat een totaal volume van 8 ml (4 ml zoogdieren, 4 ml vogelcellen). </li><li> Schud de hand van de co-gekweekte cellen in de 100 mm schaal teneinde een gelijkmatige en dan weer in de incubator bij 37 ° C gedurende 3-4 dagen. De criteria voor het infecteren eieren 3 of 4 dagen na co-cultuur van zoogdiercellen en vogelcellen afhankelijk van hoeveel cytopathisch effect (celronding, dood, loslating van het oppervlak, enz..) Waargenomen in het MVA-T7 virale infectie. </li></ol> 5. Infectie van de kip met embryo&#39;s Eieren (Figuur 4A, Dagen 6-7) <ol><li> Na 3-4 dagen co-cultuur van zoogdiercellen en vogelcellen, verwijdert 1 ml van de weefselkweek supernatant en toevoegen aan een Eppendorf buis. </li><li> Centrifugeer de weefselkweek supernatant gedurende 1 min bij 12.000 rpm in een benchtop centrifuge om cellulair afval te verwijderen. </li><li> Kaars de eieren met behulp van een lichte candling box om de interface tussen de luchtzak en de allantoïsholte zien. Maak een merkteken op het raakvlak grens vermijden bloedvat lokalisatie. Spray 70% ethanol over de eieren om steriele omstandigheden vast te stellen. Maak voorzichtig een gat in de eierschaal op de gemarkeerde plaats en beënt 500 pl van de supernatant met een insuline (1 ml) spuit, richten de naald verticaal en direct in de allantoïsholte. (Figuur 4B). </li><li> Dicht de nick in de eischaal met gesmolten was of paraffine. </li><li> Incubeer de eieren gedurende 2-3 dagen bij 37 ° C. </li></ol> 6. Oogst van allantoïsvocht van besmette kip met embryo&#39;s Eieren (Figuur 4A, Dagen 8-10) <ol><li> Incubeer de besmette eieren 2-4 uur of overnacht bij 4 ° C om kippenembryo&#39;s te doden en stollen van het bloed. </li><li> Spuit de eieren met 70% ethanol (tot steriele omstandigheden te handhaven). </li><li> Tik op de apicale gedeelte van het ei, over de luchtspouw, met een lepel zorgvuldig. Zodra de eierschaal wordt gekraakt, verwijdert u de fragmenten met een tang en volledig het allantoïs membraan bloot. </li><li> Expose de allantoïsholte door het uitsnijden van het allantoïs membraan met een tang en schaar, schade aan de bloedvaten en de dooier vermijden. </li><li> Duw onderaan de embryo met een spatel en het verzamelen van de omhoog stromende allantoïsvloeistof (8-12 ml per ei) met een pipet 10 ml. Voorkom beschadiging van de dooier membraan. Breng de allantoïsvocht om een ​​15 ml centrifugebuis op ijs (gebruik een tube per ei). </li><li> Verduidelijken allantoïsvloeistof door centrifugeren gedurende 5 min bij 1500 rpm. Breng het supernatant naar een nieuwe buis zonder de pellet te verstoren. </li><li> WINKEL monsters bij 4 ° C gedurende 1 week, tot controle ervan aanwezigheid van NDV bij hemagglutinatie assay. </li></ol> 7. Hemagglutinatie (HA) Assay De aanwezigheid van virus in de Allantoic vloeistof uit besmette eieren kunnen macroscopisch worden bepaald door hun vermogen om kalkoen rode bloedcellen (RBC) hemagglutinate. Bij NDV ongeveer 10 6 plaque vormende eenheden (pfu) per ml nodig zijn om een positief signaal in de HA test geven. HA assays zijn in V-bodem 96-putjes uitgevoerd. Negatieve (PBS 1x, niet-geïnfecteerde allantoïsvloeistof) als positief (allantoïsvocht van elke NDV virus) controlemonsters moet altijd worden opgenomen in een HA-test te valideren. Om een ​​HA-test uit te voeren: <ol><li> Pipetteer 50 ul PBS 1x per putje in een V-bodem 96-well plaat. </li><li> Pipetteer 50 ul van de allantoïsvloeistof monsters in de putjes van de eerste kolom van de plaat. Voer 2-voudige seriële verdunningen door de rest van de plaat en de laatste extra 50 ul van putten in de laatste kolom verwijderen. </li><li> Doseer 50 ul van 0,5% kalkoen RBC in PBS 1x per well. Schud de plaat door te tikken. </li><li> Incubeer de plaat staan ​​bij 4 ° C (of ijs) fof 30-45 minuten of totdat een heldere pellet wordt gevormd in de negatieve controle wells. </li></ol>

<ol><li>Lamb, R. A., Parks, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLamb%2C+RA+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).</li>
<li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).</li>
<li>Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+Newcastle+disease+virus+from+cloned+cDNA%3A+evidence+that+cleavability+of+the+fusion+protein+is+a+major+determinant+for+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence.</a> J. Virol. 73, 5001-5009 (1999).</li>
<li>Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, T., Buchholz, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+lentogenic+Newcastle+disease+virus+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.</a> J. Gen. Virol. 80 (Pt 11), 2987-2995 (1999).</li>
<li>Nakaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.</a> J. Virol. 75, 11868-11873 (2001).</li>
<li>Zamarin, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy%3A+old+challenges+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy: old challenges and new directions.</a> Future Microbiol. 7, 347-367 (2012).</li>
<li>Park, M. S., Garcia-Sastre, A., Cros, J. F., Basler, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+V+protein+is+a+determinant+of+host+range+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range restriction.</a> J. Virol. 77, 9522-9532 (2003).</li>
<li>Park, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29-based+assay+demonstrates+interferon-antagonist+activity+for+the+NDV+V+protein+and+the+Nipah+virus+V%2C+W%2C+and+C+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W, and C proteins.</a> J. Virol. 77, 1501-1511 (2003).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+oncolytic+properties+of+recombinant+newcastle+disease+virus+through+antagonism+of+cellular+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancement of oncolytic properties of recombinant newcastle disease virus through antagonism of cellular innate immune responses.</a> Mol. Ther. 17, 697-706 (2009).</li>
<li>Vigil, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reverse+genetics+to+enhance+the+oncolytic+properties+of+Newcastle+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus.</a> Cancer Res. 67, 8285-8292 (2007).</li>
<li>Swayne, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+paramyxovirus+type+1-avian+influenza-H7+virus+as+a+vaccine+for+protection+of+chickens+against+influenza+and+Newcastle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Recombinant paramyxovirus type 1-avian influenza-H7 virus as a vaccine for protection of chickens against influenza and Newcastle disease.</a> Avian Dis. 47, 1047-1050 (2003).</li>
<li>Park, M. S., Steel, J., Garcia-Sastre, A., Swayne, D., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+viral+vaccine+constructs+with+dual+specificity%3A+avian+influenza+and+Newcastle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8203-8208 (2006).</li>
<li>Carnero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+human+immunodeficiency+virus+gag+expression+by+newcastle+disease+virus+vectors+for+the+induction+of+potent+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses.</a> J. Virol. 83, 584-597 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+type+I+interferon+secretion+through+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+measles+virus+hemagglutinin+stimulates+antibody+secretion+in+the+presence+of+maternal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Induction of type I interferon secretion through recombinant Newcastle disease virus expressing measles virus hemagglutinin stimulates antibody secretion in the presence of maternal antibodies.</a> J. Virol. 85, 200-207 (2011).</li>
<li>DiNapoli, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus%2C+a+host+range-restricted+virus%2C+as+a+vaccine+vector+for+intranasal+immunization+against+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal immunization against emerging pathogens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9788-9793 (2007).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+respiratory+syncytial+virus+by+a+recombinant+Newcastle+disease+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Protection against respiratory syncytial virus by a recombinant Newcastle disease virus vector.</a> J. Virol. 80, 1130-1139 (2006).</li>
<li>Bukreyev, A., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus as a vaccine vector for humans.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 46-55 (2008).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., Zuniga, E. I., Rosario, D., Garcia-Sastre, A., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+type+I+interferon+response+by+the+nucleoprotein+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the type I interferon response by the nucleoprotein of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 80, 9192-9199 (2006).</li>
<li>Jennings, S., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weber, F., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thogoto+virus+ML+protein+suppresses+IRF3+function%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Thogoto virus ML protein suppresses IRF3 function.</a> Virology. 331, 63-72 (2005).</li>
<li>Kochs, G., Garcia-Sastre, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+anti-interferon+actions+of+the+influenza+A+virus+NS1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein.</a> J. Virol. 81, 7011-7021 (2007).</li>
<li>Munoz-Jordan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+alpha%2Fbeta+interferon+signaling+by+the+NS4B+protein+of+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses.</a> J. Virol. 79, 8004-8013 (2005).</li>
<li>Cardenas, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+virus+VP35+protein+binds+double-stranded+RNA+and+inhibits+alpha%2Fbeta+interferon+production+induced+by+RIG-I+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling.</a> J. Virol. 80, 5168-5178 (2006).</li>
<li>Mibayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+retinoic+acid-inducible+gene+I-mediated+induction+of+beta+interferon+by+the+NS1+protein+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of retinoic acid-inducible gene I-mediated induction of beta interferon by the NS1 protein of influenza A virus.</a> J. Virol. 81, 514-524 (2007).</li>
<li>Kopecky-Bromberg, S. A., Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, R. A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+open+reading+frame+%28ORF%29+3b%2C+ORF+6%2C+and+nucleocapsid+proteins+function+as+interferon+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame (ORF) 3b, ORF 6, and nucleocapsid proteins function as interferon antagonists.</a> J. Virol. 81, 548-557 (2007).</li>
<li>Rose, K. M., Elliott, R., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+coronavirus+delays+expression+of+a+subset+of+interferon-stimulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine coronavirus delays expression of a subset of interferon-stimulated genes.</a> J. Virol. 84, 5656-5669 (2010).</li>
<li>Roth-Cross, J. K., Martinez-Sobrido, L., Scott, E. P., Garcia-Sastre, A., Weiss, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+alpha%2Fbeta+interferon+response+by+mouse+hepatitis+virus+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the alpha/beta interferon response by mouse hepatitis virus at multiple levels.</a> J. Virol. 81, 7189-7199 (2007).</li>
<li>Andersson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crimean-Congo+hemorrhagic+fever+virus+delays+activation+of+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response.</a> J. Med. Virol. 80, 1397-1404 (2008).</li>
<li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li>
<li>Kato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Sendai+virus+multiplication+from+transfected+cDNA+or+RNA+with+negative+or+positive+sense%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense.</a> Genes Cells. 1, 569-579 (1996).</li>
<li>Durbin, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+human+parainfluenza+virus+type+3+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA.</a> Virology. 235, 323-332 (1997).</li>
<li>Zhao, H., Peeters, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> J. Gen. Virol. 84, 781-788 (2003).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).</li>
<li>Calain, P., Roux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rule+of+six%2C+a+basic+feature+for+efficient+replication+of+Sendai+virus+defective+interfering+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.</a> J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).</li>
<li>Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-deficient+vaccinia+virus+encoding+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+for+transient+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.</a> Virology. 210, 202-205 (1995).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+review.+New+mammalian+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Product review. New mammalian expression vectors.</a> Nature. 348, 91-92 (1990).</li>
<li>Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+of+mononegavirales%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics of mononegavirales.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).</li>
</ol>

Adolfo García-Sastre is een uitvinder van octrooien op recombinante NCD-virussen die eigendom zijn van de Icahn School van Geneeskunde bij de berg Sinaï.

Verschillende factoren moeten worden beschouwd om goede resultaten te bereiken, terwijl het redden van NDV. Ten eerste, de volledige lengte cDNA construct voor gebruik moet worden ontworpen om de functionele integratie van de nieuwe transgenen / wijzigingen in het NDV genoom toestaan. Dat betekent, zoals hierboven vermeld, dat (i) geschikte gen uiteinde (GE), intergene (IG) en gen start (GS) sequentie worden toegevoegd indien nodig, (ii) er zijn geen vermeende GE of GS sequenties in de vreemde gen, en (iii) de volledige...

Newcastle Disease Virus (NDV), een aviaire paramyxovirus die behoren tot het genus Avulavirus 1, is een economisch relevant en dus op grote schaal onderzocht en bewaakt zoönoseverwekker, die ernstig kan beïnvloeden pluimveehouderij over de hele wereld. Hoewel het niet een menselijk pathogeen, NDV is ook grondig bestudeerd buiten het veld dierenarts zowel als model paramyxovirus en vanwege zijn zeer interessant, natuurlijke oncolytic eigenschappen 6. Onderzoek naar NDV sterk geprofiteerd van de ontwikkeling van reverse genetics technieken voor enkelstrengs, niet-gesegmenteerde negatieve-sense RNA-virussen, voor het eerst beschreven voor hondsdolheid virus door Conzelmann en coleagues 2. Een verscheidenheid van genetisch gemodificeerde NDVs, dragen vreemde genen of aanpassingen van hun wild-type genoom zijn uitgebreid bestudeerd sinds die tijd. Werken met deze recombinante virussen is cruciaal geweest om verschillende virulentiefactoren karakteriseren niet alleen van NDV, maar ook van andere relevante human ziekteverwekkers zoals influenza A virus 7 - of de opkomende Nipah virus 8. Voorts zijn verschillende studies het gebruik van deze technieken voor de aangeboren antitumorale activiteit van NDV 6,9,10 verbeteren, meestal door het verbeteren van de immunostimulerende eigenschappen van het virus onderzocht. Andere betrokken onderzoeksgebied op recombinante NDVs heeft de generatie van kandidaat-vaccins tegen andere virale ziekten zoals influenza geweest 5,11,12, 13 HIV, mazelen 14, SARS 15 of dat door de respiratoire sincytial virus (RSV) 16. Tussen de verschillende opmerkelijke voordelen van NDV zijn het gebrek aan reeds bestaande immuniteit in humane populaties, de stabiliteit van het vreemde genetische inserts, weinig recombinatory activiteit en de hoge veiligheidsprofiel combinatie met de bovengenoemde natuurlijke immunostimulerende eigenschappen 17. Opvallend is ook het potentiële gebruik van recombinant bivalente vaccins in poultry, beschermend tegen zowel NDV en hoogpathogene aviaire influenza virussen 11,12. Dit kan een uitstekende manier om de kansen van de laatste verspreiding van wilde naar gedomesticeerde dieren, ook als bijdrage aan een mogelijke inter-specifieke sprong van de gevreesde vogelgriep bij de mens te voorkomen te verminderen zijn. Ten slotte heeft reporter expressie NDV gebruikt voor de evaluatie van aangeboren immuunresponsen evenals de identificatie van interferon antagonist gecodeerd door meerdere virussen 18-27. Het proces van terugwinning van een recombinant, niet-gesegmenteerde negatieve RNA virus bestaat hoofdzakelijk op kunstmatig dwingen een virale replicatiecyclus in een producerende cel door transfectie van cDNA dat codeert voor de minimale infectieuze moleculaire machinerie, bekend als ribonucleoproteïne of RNP (figuur 2). De RNP&#39;s bestaan ​​uit het virale polymerase (P en L eiwitten), de nucleoproteïne (NP) en de volledige lengte antigenoom RNA van het virus. Dit RNA + antigenoom the template nodig voor het genereren van de complementaire RNA-genomen, die ook samen met de rest van de eiwitten van het virale RNP, recapituleert hetzelfde infectieuze complex dat een natuurlijk virus zou vrijgeven aan het cytoplasma van de cel na infectie (Figuur 2A ). Vanaf deze stap verder, kan de virale cyclus natuurlijk doorgaan en recombinante virions, inkapselen de gemodificeerde genomen, worden gegenereerd (Figuur 2B). Opmerkelijk, transfectie van de genomische cDNA in plaats van het antigenome cDNA sterk vermindert of volledig afschaft redding efficiëntie 2,28-30. Zelfs wanneer antigenome cDNA getransfecteerd, de efficiëntie van de inkapseling van recombinante RNA in RNP&#39;s in getransfecteerde cellen is waarschijnlijk erg laag. Hierdoor redding protocollen voor NDV bevatten vaak verschillende stappen voor de amplificatie van het aantal virale deeltjes die vrijkomen uit de oorspronkelijk getransfecteerde cellen door coculturing hen permissieve cellen en / of deinfectie van bebroede eieren. Vóór de redding, kan het cDNA worden gemanipuleerd met standaard kloneringswerkwijzen om de gewenste wijzigingen genereren. Hoewel specifieke mutaties van de verschillende genproducten en regulerende sequenties van het virus onomwonden worden bereikt Zo veel gepubliceerde werk recombinant NDV is de toevoeging van een nieuwe transcriptie-eenheid vereist in het NDV genoom. Net als andere leden van de familie paramyxovirus, het NDV-genoom codeert acht verschillende eiwitten in zes transcriptionele eenheden die differentieel uitgedrukt afhankelijk van hun locatie ten opzichte van het 3&#39;-uiteinde in een dalende helling kritiek voor de virale levenscyclus 1. Hierdoor moet de locatie van de nieuwe transcriptie-eenheid in het genoom zorgvuldig worden gekozen om een ​​evenwicht tussen expressie van het transgen en aantasting van virale replicatie te bereiken. Insertie van P en M-genen is het meest gebruikt, though andere sites zijn ook getest 13,31. Ongeacht het inzetstuk, het klonen in NDV-cDNA moet een aantal regels om een ​​rescuable construct gegenereerd: (i) nieuwe gen worden opgenomen in de NDV-genoom onder controle van de geschikte signalen voor het virale RNA-afhankelijke RNA polymerase. Deze sequenties moeten stroomopwaarts van de nieuwe open leesraam (ORF) worden toegevoegd zodat de polymerase kan het einde van de vorige gen (GE) en het begin van de nieuwe transgen (GS) herkent, gescheiden door een nucleotide sequentie intergene (IG) . Toevoeging van een geldige Kozak (K) sequentie eukaryotische ribosomale translatie verbeteren wordt ook aanbevolen voor een betere vreemde eiwit expressie 32, (ii) de efficiënte replicatie van NDV, zoals voor de meeste leden van de familie Paramyxoviridae, is afhankelijk van de lengte genoom wordt veelvoud zes 33, daarom elke inbrengen in de NDV heeft deze &quot;regel van zes&quot; te volgen. Eventueel required extra nucleotiden kunnen stroomafwaarts worden toegevoegd de nieuwe ORF, en (iii) de volgorde van de transgen moet worden gecontroleerd om te vinden mogelijke GE en GS achtige sequenties die redding efficiëntie, transgene expressie en / of levensvatbaarheid virus zou kunnen schaden. Indien aanwezig moet deze sequenties worden verwijderd door stille mutagenese. Het genereren van recombinant volledige lengte cDNA volgende genoemde regels is de eerste stap om efficiënt produceren genetisch gemodificeerde NDV zoals hier beschreven. In het systeem alle DNA constructen onder controle van de T7 RNA polymerase promoter (Figuur 3). Deze cytoplasmatische polymerase in trans door co-infectie met een recombinant gemodificeerd Vaccinia Ankara virus (MVA-T7) 34. Figuur 3A tonen de pNDV-B1 plasmide, dat de volledige lengte antigenome cDNA 5 codeert. Figuur 3B toont pTM1 plasmiden die NP, P en L ORF. Plasmiden pCITE-GFP, dat codeert, under de T7-promoter, het Green Fluorescent Protein (GFP) en pCAGGS GFP 18, die dezelfde ORF codeert onder de kippen beta-actine promotor 35, worden gebruikt als controles. In dit protocol tonen we de procedure te redden recombinant NDV uit het cDNA van de lentogene NDV-stam Hitchner B1 5 (figuur 4).

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>CORNING Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Elke leverancier</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>35% Bovine Albumine (BA)</td><td>Sigma</td><td>232-936-2</td><td>Elke leverancier</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>CORNING Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td>Elke leverancier</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine (PS) 100x</td><td>CORNING Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>Elke leverancier</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>Elke leverancier</td></tr><tr><td colspan="4"> Cellijnen A549-cellen (catalogusnummer CRL-185), HEp-2-cellen (catalogusnummer CRL-185), kippenembryofibroblasten (catalogusnummer CRL-12203) en eendenembryofibroblasten (catalogusnummer CCL-141) zijn verkrijgbaar bij de American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). Alle cellijnen worden onderhouden in een 37 &deg;C incubator met 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Bevruchte kippeneieren Bevruchte kippeneieren kunnen worden verkregen bij Charles River Laboratories, Specific Pathogen Free Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) en worden op 37 &deg;C bewaard. De levensvatbaarheid van de embryo's wordt beoordeeld met een eierkaars. Eieren worden geïnfecteerd wanneer ze 8-10 dagen oud zijn. Zowel infectie als oogst van de allantoïsche vloeistof gebeurt onder steriele omstandigheden. Alle eieren worden geautoclaveerd en weggegooid volgens standaard bioveiligheidsprotocollen in het laboratorium. Turkse rode bloedcellen (RBC) Turkse RBC kunnen worden gekocht bij Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA) en worden bewaard bij 4 &deg;C. Om RBC voor HA-test voor te bereiden, was je 5 ml van de commerciële stock met 45 ml PBS 1x in een 50 ml conische buis. Centrifugeer gedurende 5 min bij 1.000 rpm en gooi voorzichtig het supernatant weg. Verdun het gepelletiseerde RBC 1:1.000 in PBS 1x voor een uiteindelijke concentratie van 0,5-1,0%. Gewassen RBC kunnen enkele dagen worden bewaard bij 4 &deg;C. Plasmiden Plasmidenpreparaten worden verkregen met elk commercieel verkrijgbaar maxiprep-kit volgens de instructies van de fabrikant, verdund in ddH20 tot een uiteindelijke concentratie van 1 &mu;g/µl en bewaard bij -20 &deg;C. DNA-concentratie en -zuiverheid worden beoordeeld door spectrofotometrie bij 260 en 280 nm. Preparaten met een 260/280-verhouding hoger dan 1,8 worden beschouwd als van acceptabele kwaliteit voor het redden. Plasmide-DNA-kwaliteit wordt ook routinematig gecontroleerd door agarosegelchromatografie. Virussen Het beschreven protocol voor het redden van de lentogeen NDV-stam Hitchner B1 kan worden uitgevoerd onder bioveiligheidsniveau (BSL) 2-omstandigheden. De gemodificeerde Vaccinia Ankara die de T7 RNA-polymerase (MVA-T7) tot expressie brengt, werd beschreven34 en verkregen van Dr. Bernard Moss. Dit virus wordt gekweekt in confluente monolagen van kippenembryofibroblasten en getiteerd in zoogdier (A549 of HEp-2) cellen. NDV-stammen worden gekweekt in bevruchte kippeneieren en getiteerd door IFA met behulp van polyklonaal serum dat is opgewekt tegen gezuiverde virionen. Al het besmette materiaal moet veilig worden gesteriliseerd en worden weggegooid volgens standaard bioveiligheidsprocedures. Weefselkweekmedia en oplossingen: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal bovien serum (FBS) en Penicilline/Streptomycine (P/S): 445 ml van DMEM, 50 ml van hitte-geïnactiveerd FBS, 5 ml van 100x commerciële P/S-oplossing. Bewaar bij 4 &deg;C. 10x Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS): 80 g van NaCl, 2 g van KCl, 11,5 g van Na2HPO4.7H2O, 2 g van KH2PO4. Voeg ddH2O toe tot 1 L. Stel de pH in op 7,3. Sterieliseer door autoclavering. Bewaar bij kamertemperatuur. 1x PBS: Verdun 10x PBS 1:10 met ddH2O. Sterieliseer door autoclavering en bewaar bij kamertemperatuur. 100x Ca/Mg : 1,327 g CaCl2.2H2O, 2,133 g MgCl2.6H2O en voeg ddH2O toe tot 100 ml. Autoclaveer en bewaar bij kamertemperatuur. 1x PBS/BA/PS: 50 ml van 10x Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclaveer en wanneer afgekoeld tot kamertemperatuur, voeg 5 ml 100x Penicilline/Streptomycine 3 ml 35% Bovine en 5 ml van 100x Ca/Mg toe. Bewaar bij 4 &deg;C. </td></tr></tbody></table>

redding van recombinant newcastle disease virus uit cdna

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), het prototype lid van de Avulavirus geslacht van de familie Paramyxoviridae 1, is een niet-gesegmenteerde negatieve-sense, enkelstrengs, omhuld RNA-virus (Figuur 1) met potentiële toepassingen als vector voor vaccinatie en behandeling van menselijke ziekten. Een grondige verkenning van deze toepassingen is pas na de oprichting van reverse genetics technieken om recombinante virussen van plasmiden die hun volledige genoom als cDNA 2-5 te redden mogelijk geworden. Virale cDNA kan gemakkelijk worden gemodificeerd in vitro met gebruikmaking van standaard klonering procedures om het genotype van het virus te veranderen en / of nieuwe transcriptie-eenheden omvatten. Redding van dergelijke genetisch gemodificeerde virussen een waardevol hulpmiddel om factoren die verschillende stadia van de infectie, en maakt de ontwikkeling en verbetering van vectoren voor de expressie en afgifte van antigenen begrijpenvoor vaccinatie en therapie. Hier beschrijven we een protocol voor de redding van recombinant NDVs.

Redding van NDV is een gevestigde procedure routinematig uitgevoerd in laboratoria die toegang tot de volledige cDNA van het virus. De intrinsieke stochastische aard van de methode maakt het moeilijk om 100% rescue efficiëntie. Controle op de eerste stappen van de werkwijze, speciaal de transfectie-efficiëntie en infectie met MVA-T7, helpt mogelijke problemen. Figuur 5A toont standaard transfectie en transfectie / infectie-efficiënties die genoeg om succesvol NDV redding zijn identificeren. Na het ronde...

Newcastle Disease Virus (NDV) is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren om nieuwe vectoren te ontwikkelen voor vaccinatie en therapie, onder anderen. Deze studies zijn mogelijk gemaakt door technieken om recombinant virus te redden van cDNA, zoals hier beschreven.

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Het algemene doel van deze procedure is het redden van recombinant Newcastle-virus of NDV uit gekloond DNA. Dit wordt bereikt door eerst zoogdiercellen te infecteren met een helpervirus dat T zeven polymerase codeert, en vervolgens die cellen te transfecteren met plasmiden, die de minimale replicatiemachinerie van het virus coderen onder controle van de T zeven-promotor. De tweede stap is het co-cultiveren van de getransfecteerde zoogdiercellen met vogelcellen, die afkomstig zijn van de natuurlijke gastheren van het virus.De nieuw gegenereerde varianten die vrijkomen uit de zoogdiercellen zullen de vogelcellen infecteren voor een eerste ronde van amplificatie. Vervolgens wordt het supernatant van de co-cultuur geïncubeerd in geënt kippeneieren voor verdere groei van het geredde virus, de laatste stap is het verzamelen van de LAN-toische vloeistof uit de geïncubeerde eieren. Uiteindelijk wordt een eenvoudige Hemagglutinine-test gebruikt om de aanwezigheid van NDV in de LAN-toische vloeistof en het succes van het reddingsproces te tonen.Recombinante virussen die met deze methode worden gered, kunnen inzichten bieden in verschillende factoren die de infectie beïnvloeden en kunnen ook worden gebruikt als vectoren voor de levering van antigenen voor vaccinatie en antitumorale therapie. Om te beginnen splitst u zoogdierlijke hep twee of a 5 49-cellen de dag voor transfectie in zes putjes, de dichtheid van de cellen moet de volgende dag 80 tot 90% confluency bereiken. Voor elk virus dat gered moet worden, neem twee tot vier verschillende putjes op. Neem ook twee extra putjes op voor de controles PCA's, GFP en pite, GFP gericht op het bewaken van transfectie- en MVAT zeven-infectie-efficiënties respectievelijk. Was de cellen twee keer met één milliliter verwarmd PBS, infecteer vervolgens de gekweekte zoogdiercellen met het MVA T zeven-virus bij een multiplicity of infection van één PFU per cel. In een eindvolume van 200 microliters in PBS, laat de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur incuberen tijdens de virale infectie-incubatie, bereid de transfectiemix voor zoals beschreven in de geschreven tekst nadat de lipectomie-optimale oplossing is bereid en vijf minuten is gepre-incubeerd.Een 250 microliters van de oplossing in de DNA-buizen en incubeer gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur na incubatie met MVAT zeven, verwijder het virus-inoculum door aspiratie en vervang het met de DNA lipo-transfectiemix. Voeg één milliliter DMEM 10%FBS toe aan elke schotel. Incubeer de geïnfecteerde getransfecteerde cellen gedurende zes tot acht uur bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide.Vervolgens vervangt u het transfectiemedium door 1,5 milliliter vers DMEM 10%FBS. Na 24 uur post-transfectie kunnen controleputjes worden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop om de transfectie-efficiëntie en T zeven-polymerase-activiteit te beoordelen voordat u doorgaat met co-cultivering van de geïnfecteerde getransfecteerde zoogdiercellen met vogelfibroblasten. Meestal wordt een confluënt 100 millimeter weefsel gekweekt schotel van kippen- of eendenembryofibroblasten gebruikt per twee getransfecteerde putjes. Zorg ervoor dat u van tevoren voldoende voorbereidt.100 millimeter weefsel kweekschotels van vogelcellen per alle reddingspogingen voor efficiënte redding van het virus. DMEM 10%FBS-medium wordt aangevuld met 5%elan-toische vloeistof en 30 millimolar magnesiumchloride. Na het wassen van de zoogdiercellen twee keer met verwarmde een XPBS probeert u de cellen met 0,2 milliliter EDTA-trypsine totdat ze loskomen.Resuspendeer de cellen in één milliliter van het aangevulde DMEM en breng over naar een 100 millimeter weefsel kweekschotel bij drie milliliter van hetzelfde medium. Na het wassen van de vogelcellen twee keer met verwarmde een XPBS probeert u de cellen met één milliliter EDTA-trypsine en incubeert u gedurende één tot twee minuten bij 37 graden Celsius tot de cellen loskomen. Resuspendeer de vogelcellen door acht milliliter van het bereide medium toe te voegen.Voeg vervolgens vier milliliter van de trypsiniseerd vogelcellen toe aan de zoogdiercellen in de co-cultuur 100 millimeter weefsel kweekschotel voor een totaal volume van acht milliliter. Schud de co-gecultiveerde cellen in de 100 millimeter schotel voorzichtig om een uniforme verdeling te garanderen en plaats ze vervolgens in de incubator bij 37 graden Celsius voor drie tot vier dagen. Eieren worden geïnfecteerd wanneer alle co-gecultiveerde cellen worden aangetast door het cytopathische effect van de MVAT zeven virale infectie.Op dit punt verwijdert u één milliliter van het weefsel kweeksupernatant en voegt het toe aan een eind DPH-buis centrifuge. Centrifugeer het weefsel kweeksupernatant gedurende één minuut bij 12.000 RPM in een tafelcentrifuge. Om cellulair puin te verwijderen, kaars de eieren met behulp van een licht kaarsbox om de interface tussen de luchtzak en de Alan Toic-holte te zien.Maak een markering op de interfacegrens ter vermijding van bloedvatlokalisatie. Spuit 70% ethanol over de eieren om steriele omstandigheden te creëren. Maak voorzichtig een gat in de eischaal op de gemarkeerde plek.Vervolgens inoculeert u 500 microliters van de snat met een 1 milliliter spuit, waarbij de naald verticaal en direct in de Alan Toic-holte wordt gericht. Dicht de snede in de eischaal met gesmolten was of paraffine. Incubeer de eieren gedurende twee tot drie dagen bij 37 graden Celsius.Incubeer de geïnfecteerde eieren gedurende twee tot vier uur of een nacht bij vier graden Celsius om het kippene embryo te doden en het bloed te laten stollen. Spuit de eieren met 70% ethanol om steriele omstandigheden te handhaven. Tik voorzichtig de apicale sectie van het ei over de luchtholte met een lepel.Zodra de eischaal is gebarsten, verwijdert u de fragmenten met een pincet en legt u de LAN-toische membraan volledig bloot. Leg de LAN-toische holte bloot door het ENT-toische membraan met

rescue-of-recombinant-newcastle-disease-virus-from-cdna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Redding van influenza A-virussen uit het plasmide DNA is een fundamentele en essentiële experimentele techniek die het mogelijk maakt influenza onderzoekers recombinante virussen te genereren om meerdere aspecten in de biologie van influenza virus te bestuderen en om te worden gebruikt als potentiële vectoren of vaccins.

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

De reverse genetics systeem voor de Rift Valley koorts virus MP-12 vaccinstam is een handig hulpmiddel voor het creëren van extra MP-12 mutanten met verhoogde verzwakking en immunogeniciteit. We beschrijven het protocol te genereren en karakteriseren NSS mutante stammen.

Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

Redding van recombinant arenavirussen uit gekloneerde cDNA's, gegeven voor een reverse genetische benadering stelt onderzoekers de rol van specifieke virale genproducten, evenals de bijdrage van de verschillende specifieke gebieden en residuen te onderzoeken, om verschillende aspecten van de biologie van arenavirus . Ook reverse genetics technieken FDA-goedgekeurde cellijnen (Vero) voor vaccinontwikkeling verschaft nieuwe mogelijkheden voor het genereren van effectieve en veilige vaccins ter...

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

De afgelopen 15 jaar hebben honden-adenovirus type 2 (CAV2)-afgeleide vectoren hun efficiëntie bewezen om cellen in vitro en in vivo te transduceren en worden ze veel gebruikt voor vaccinatie en gentherapie. Hier beschrijven we een procedure om CAV2-vectoren te construeren, produceren en zuiveren, wat leidt tot virale suspensies met een hoog titer.

Productie en zuivering van niet-Replicatieve Canine adenovirus type 2 afgeleide vectoren

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

De recente epidemie van het Zikavirus wijst op het belang van het opzetten van omgekeerde genetische benaderingen om vaccins en/of therapeutische strategieën te ontwikkelen. Hier beschrijven we het protocol om een infectieus recombinant Zikavirus te redden van een volledige cDNA-kloon, geassembleerd in een bacterieel kunstmatig chromosoom onder controle van het humaan cytomegalovirus onmiddellijk-vroege promotor.

Redding van recombinante Zika virus uit een bacteriële kunstmatige chromosoom cDNA kloon

Hier bieden we een gedetailleerde procedure voor de productie, zuivering en kwantificering van high-titer recombinant Newcastle disease virus. Dit protocol levert consequent &gt; 6 × 109 plaquevormende eenheden/ml op, wat virushoeveelheden oplevert die geschikt zijn voor in vivo dierstudies. Aanvullende kwaliteitscontroletests om de veiligheid in vivo te waarborgen, worden beschreven.

Productie van High-titer Recombinant Newcastle Disease Virus uit Allantoic Fluid

Dit protocoldocument beschrijft de methodologie van embryonale micro-injectie van een RCAS(A)-retrovirus met kippenlenzen als een hulpmiddel voor het bestuderen van de in situ functie en expressie van eiwitten tijdens de ontwikkeling van lenzen.

Micro-injectie van recombinant RCAS(A)-retrovirus in embryonale kippenlens

Dit artikel presenteert een vereenvoudigde methode voor het bereiden van 4 hemagglutinatie-eenheden antigeen voor serologische tests van het virus van de ziekte van Newcastle. Door de hemagglutinatietiter van het antigeen nauwkeurig te bepalen, in combinatie met een strengere back-titratiemethode en een goed gedefinieerd aanpassingsproces, verbetert het de testefficiëntie, vermindert het valse positieven en verbetert het ziektetoezicht bij pluimvee.

Optimalisatie van antigeenpreparaat voor hemagglutinatie-inhibitietest van Newcastle Disease Virus-serologie

Leer het redden van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA door zoogdiercellen te infecteren met een helpervirus en te transfecteren met plasmiden. Deze methode ondersteunt vaccinontwikkeling en therapeutisch onderzoek.

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Meer video's verkennen