Overview
Ceanorhabditis elegans è un potente strumento per aiutare a capire come gli organismi si sviluppano da una singola cellula in una vasta gamma interconnessa di tessuti funzionanti. I primi lavori in C. elegans hanno tracciato il lignaggio e la struttura cellulare completa a livello di microscopia elettronica, consentendo ai ricercatori una visione senza precedenti della connessione tra geni, sviluppo e malattia. Apprezzare lo sviluppo stereotipato e il programma riproduttivo di C. elegans è essenziale per utilizzare questo organismo modello al suo massimo sperimentale.
Questo video ti darà una sbirciatina nello sviluppo di un verme dalla fecondazione alla schiusa e ti guiderà attraverso le fasi della vita delle larve appena nate nel suo viaggio verso la maturità riproduttiva. Il video descriverà in dettaglio come sono stabiliti gli assi principali, quali cellule fondatrici danno origine a quali tessuti nell'embrione in via di sviluppo e come discriminare tra i quattro stadi larvali. Infine, imparerai come impostare una croce genetica e visiteremo alcune applicazioni che manipolano lo sviluppo e la riproduzione di C. elegans a beneficio sperimentale.
Procedure
Caenorhabditis elegans è un organismo multicellulare anatomicamente piccolo e geneticamente semplice con un modello di sviluppo invariante. Nonostante il fatto che altri organismi, come i vertebrati, abbiano programmi di sviluppo più variabili, la ricerca sullo sviluppo e la riproduzione dei vermi ha prodotto importanti informazioni sui meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo in una vasta gamma di specie, compresi noi. Un buon apprezzamento dello sviluppo dei vermi e del suo ciclo di vita è fondamentale per il successo degli esperimenti genetici.
Innanzitutto, impariamo a conoscere gli aspetti chiave dello sviluppo dei worm. Dopo la fecondazione, il primo evento importante è una divisione cellulare asimmetrica durante la quale viene stabilito l'asse anteriore-posteriore. L'asse dorso-ventrale è stabilito tra lo stadio a due celle e lo stadio a quattro celle, e l'asse sinistro-destro è stabilito poco dopo lo stadio a quattro cellule.
Sei cellule fondatrici appaiono durante i primi cinque cicli di divisione cellulare. Questi sono AB, MS, E, C, D e P4. In ogni verme, queste stesse cellule fondatrici daranno sempre origine agli stessi tessuti specifici.
I discendenti cellulari di AB alla fine daranno origine a neuroni e tessuto faringeo. La SM dà origine a muscoli, faringe e neuroni. Le cellule derivate da E diventano tessuto intestinale. C dà origine a muscoli, neuroni e pelle. Le cellule del fondatore D diventano muscoli della parete corporea. E, infine, la cellula P4 darà origine alla linea germinale
Le interazioni cellula-cellula sono fondamentali per determinare questi destini cellulari finali. Ad esempio, l'interazione di ABp con P2 è importante per dare origine a neuroni e cellule epiteliali. L'interazione di ABa con EMS è necessaria per la formazione di cellule faringee. L'interazione tra il lato posteriore di EMS e P2 allo stadio a quattro cellule è essenziale per la cellula E prodotta dalla cellula EMS per differenziarsi in cellule intestinali.
Seguendo le poche divisioni precoci, quando l'embrione raggiunge approssimativamente lo stadio di 30 cellule, viene deposto l'uovo di verme. Ulteriori divisioni cellulari portano ad un aumento del numero di cellule e alla formazione di organi. Infine, il piccolo verme inizia a muoversi all'interno del guscio d'uovo e, poco dopo che la sua faringe inizia a pompare, l'uovo si schiude.
Un aspetto importante dello sviluppo di C. elegans è l'apoptosi, o morte cellulare programmata, che porta alla rimozione selettiva di alcune cellule. Durante la fase embrionale dello sviluppo del verme, 113 cellule muoiono a causa dell'apoptosi.
Dopo aver esaminato lo sviluppo embrionale, impariamo poi a conoscere il ciclo di vita di un verme appena nato. Il ciclo di vita di C. elegans comprende quattro stadi larvali – L1, L2, L3, L4 – che sono seguiti dall'età adulta. In determinate condizioni ambientali, come la scarsità di cibo, le larve L1 o L2 tardive arrestano ed entrano in un programma di sviluppo alternativo, chiamato stadio dauer. I dauer possono rimanere in questa fase per molti mesi, ma al momento della disponibilità di cibo rientrino nel normale programma di sviluppo.
I vermi hanno due sessi: gli ermafroditi autofecondazioni e i maschi. Gli ermafroditi hanno una coda appuntita e sono entrambi più larghi e più lunghi dei maschi di pari età. Sotto un microscopio sezionante, i maschi si distinguono facilmente per il loro corpo snello, ma la differenza più profonda è la coda distintiva del verme maschio che porta l'apparato copulatorio.
La linea germinale ermafrodita produce sia ovociti che spermatozoi, mentre la linea germinale maschile produce solo spermatozoi. La linea germinale contiene cellule staminali sulla punta distale, che si muovono verso l'estremità prossimale per produrre gameti maturi.
Attraverso l'autofecondazione, un ermafrodita adulto produce una progenie ermafrodita geneticamente identica con due cromosomi sessuali. Occasionalmente, la non disgiunzione, che è il fallimento dei cromosomi di separarsi correttamente nella linea germinale ermafrodita, si traduce in progenie maschile con un solo cromosoma sessuale. L'alta temperatura aumenta la frequenza degli eventi di non disgiunzione
Si pensa che la riproduzione sessuale sia la forza trainante della diversità genetica. Anche se l'accoppiamento avviene a bassa frequenza, l'autofecondazione è la principale modalità di riproduzione in C. elegans in natura. Un'importante domanda senza risposta nella biologia dei vermi è perché i maschi sono stati preservati attraverso l'evoluzione.
Ora che hai imparato un po 'sullo sviluppo e sul ciclo di vita di C. elegans, vediamo come possiamo praticamente applicare questa conoscenza per impostare incroci genetici. Prima di iniziare, è importante pianificare attentamente la strategia genetica.
La tecnica asettica è importante per evitare la contaminazione batterica e fungina. Non lasciare asciugare le piastre, poiché i ceppi di vermi potrebbero essere impossibili da recuperare. Il giorno dell'impostazione di un accoppiamento, preparare più piastre con una macchia concentrata di batteri al centro della piastra. Etichettare la targhetta con i nomi e la data del ceppo. Per impostare un accoppiamento, metti tre ermafroditi L4 o giovani adulti e dodici L4 o giovani maschi adulti su ogni piatto. Incubare alla temperatura appropriata e controllare le piastre quattro giorni dopo per la progenie incrociata. La presenza di circa il 50% di maschi è la prima indicazione che la croce ha funzionato. Scegli la progenie incrociata ermafrodita L4 poiché questi non si sono ancora accoppiati con nessun maschio sul piatto. Seguili attentamente per assicurarti che il fenotipo osservato corrisponda al fenotipo atteso.
La comprensione del ciclo di vita e dello sviluppo di C. elegans ha contribuito ad affrontare importanti questioni fondamentali nella biologia cellulare.
L'apoptosi nella linea germinale è parte integrante dell'oogenesi, dell'embriogenesi e dell'organogenesi in molti organismi, compresi gli esseri umani. Molti regolatori dell'apoptosi sono conservati tra esseri umani e vermi. Pertanto, C. elegans è un sistema unico per capire perché così tante cellule germinali muoiono durante l'oogenesi in diverse specie.
Le uniche linee di cellule staminali in buona fede in C. elegans sono le cellule staminali germinali sulla punta distale. Questi sono stati usati come paradigma per capire come vengono mantenute le nicchie delle cellule staminali e come le cellule si impegnano nella differenziazione.
Molti nematodi parassiti che infettano gli esseri umani passano attraverso l'arresto larvale che è simile allo stadio dauer in C. elegans. Dopo l'infezione, riprendono lo sviluppo. Molte colture agricole sono anche invase da nematodi parassiti che arrestano. Una migliore comprensione dei meccanismi di dauer porterà a terapie migliori contro questi nematodi.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE allo sviluppo e alla riproduzione di C. elegans. In questo video, abbiamo esaminato lo sviluppo embrionale, le specifiche del destino cellulare e il ciclo di vita di C. elegans. La ricerca in queste aree ha prodotto importanti informazioni sui meccanismi dell'apoptosi, delle cellule staminali e dei nematodi infettivi.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con la tua ricerca su C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
