Name: متعدد الطبقات لتركيب المدى الطويل المجهر الضوئي ورقة من الزرد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: تعلم تركيب أجنة سمك الزرد لمجهر الضوء الورقي طويل المدى باستخدام أنابيب FEP وأغاروز. تتيح هذه التقنية مراقبة التطور الجنيني لعدة أيام بدقة عالية دون إزعاج.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر جمعية ماكس بلانك، وبرنامج العلوم الحدودي الإنسان (HFSP) وبورنغير إنغلهايم فون للتمويل والدعم.

1. إعداد المواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنابيب FEP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف محطة إثراء الوقود أنبوب (الشكل 2A) من قبل بيغ السوائل (في الخطوات المذكورة أدناه) من خلال أنبوب وباستخدام حقنة مرفقة مع نهاية حادة قنية (الشكل 2B) ملاحظة 1:. استخدام القفازات في جميع أنحاء الداخلي ملاحظة 2: نوصي قطع الأنبوب في قطعة من كاليفورنيا. 1 متر في الطول وتنظيف تلك بالتوازي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أول تدفق أنبوب مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم بشكل متكرر. ثم نقل إلى أنبوب 50 مل أنبوب الطرد المركزي مليئة 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم وultrasonicate ذلك لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أنبوب البوليمر لحوض صغير مع DDH 2 O. طرد الأنبوب الأول مع [ده 2 O ثم مع 70٪ ETOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق نقل أنبوب محطة إثراء الوقود إلى أنبوب الطرد المركزي الطازجة مع 70٪ ETOH. مرة أخرى هذا ultrasonicate أنبوب الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أنبوب محطة إثراء الوقود تنظيفها إلى قطعمن حوالي 3 سم (طول نموذجي للاستخدام في تصاعد الزرد والتصوير) وتصويب عليها إذا لزم الأمر. تخزين أنابيب FEP تنظيفها في 50 مل أنبوب الطرد المركزي الطازجة مليئة ده 2 O (الشكل 2C). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون تريكين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون 0.4٪ تريكين عن طريق إذابة 400 ملغ تريكين (MS-222) في 97.9 مل DDH 2 O. بعد مسحوق قد حلت تماما، وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام 2.1 مل 1M تريس (الرقم الهيدروجيني 9.0). حماية الحل بعيدا عن الضوء. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3٪ ميثيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3٪ محلول ميثيل للطلاء الداخلي للأنابيب محطة إثراء الوقود كما هو موضح أدناه. تسخين E3 11 في زجاجة إلى ما يقرب من 60-70 درجة مئوية، وإضافة كمية مناسبة من مسحوق ميثيل. إضافة شريط التحريك وإثارة في 4 درجات مئوية. حالما يتم تبريد الحل وصولا الى أقل من 30 درجة مئوية، إضافة إلى حل تريكين ج النهائيoncentration من 100 ملغ / لتر. الحفاظ على اثارة في 4 درجات مئوية خلال الليل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1.5٪ و 0.1٪ الاغاروز في E3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب كمية مناسبة من نقطة انصهار منخفضة مسحوق الاغاروز في حجم محدد من E3 في قارورة زجاجية. تسخين الخليط في الميكروويف والتخلص منه مرة واحدة في حين، حتى يظهر الحل الاغاروز متجانسة، من دون أي بلورات المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 مل aliquots من 0.1٪ الاغاروز حل في 1.5 مل أنابيب رد الفعل. يمكن تخزين aliquots في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحل 1.5٪ إلى معطف طبق بتري البلاستيكية. يجب أن يكون سمك طبقة الاغاروز كاليفورنيا. 2 مم. بعد توطد الاغاروز، إضافة E3 المتوسطة على أعلى من طبقة لمنعها من الجفاف. يمكن تخزين طبق المغلفة في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الزرد (دانيو rerio) البالغين والأجنة في 28.5 درجة مئوية، والتعامل معها وفقا للبروتوكولات المعمول 11،12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأسماك الذكور والإناث في فترة ما بعد الظهر وفصلها باستخدام المفرق. إزالة المفرق في صباح اليوم التالي لآخر التزاوج من الأسماك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأجنة في صحن مليء E3 وفحصها باستخدام stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 24 HPF (أو المرحلة التنموية ذات الاهتمام الخاص بك)، حدد الجنين الزرد مضان للتعبير ونقل الإيجابية إلى طبق جديد مع E3 الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> dechorionate بعناية الأجنة باستخدام اثنين من ملقط حاد (أرقام 2D و 2E). استخدام ملقط لانتزاع أول وعقد المشيمه وملقط الثانية المسيل للدموع فتحه وتسحبه بعيدا ملاحظة 1: تنفيذ هذه الخطوة مع مساعدة من stereomicroscope. </li></ol></li></ol> 2. تصاعد متعدد الطبقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء أنبوب محطة إثراء الوقود <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق قنية نهاية حادة لحقنة. إدراج قنية بعناية لحوالي 3 ملم في واحدة من نهاية تنظيفها وقطع قطعة من. محطة إثراء الوقود أنبوب (أرقام 2F و 2G) ملاحظة 1: استخدام القفازات وتجنب الانحناء أو أي عصر من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع نهاية خالية من أنبوب محطة إثراء الوقود إلى 3٪ ميثيل وملء الأنبوب مع الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإفراج عن ببطء ميثيل بالضغط على حقنة. تجاهل الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.1.2 و2.1.3 باستخدام E3 ملاحظة 1: الأنابيب المغلفة بحاجة إلى أن تستخدم لتركيب على الفور. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الزرد إلى الاغاروز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين قسامة واحدة من 0.1٪ الاغاروز إلى 70 درجة مئوية في كتلة الحرارة. دوامة لفترة وجيزة أنبوب تفاعل وتحويلها إلى كتلة الحرارة لتعيين 38 ° C (الشكل 2H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ رد فعل أنبوب الخروج من كتلة الحرارة واتركها تبرد لفترة وجيزة. إضافة تريكين إلى تركيز النهائي من 133-200 ملغم / لتر ودوامة مرة أخرى (الشكل 2I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار واحد من الأجنة الزرد dechorionated وحوالة. ص إلى أنبوب تفاعل مع مسخن 0.1٪ الاغاروز باستخدام ماصة باستير الزجاج (أرقام 2J و2K) ملاحظة 1: في محاولة لنقل أقل قدر ممكن E3 إضافية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق الجنين مع المرفقة حقنة محطة إثراء الوقود أنبوب (الشكل 2L). وينبغي أن تملأ أنبوب تماما مع 0.1٪ الاغاروز، مع الجنين وضعه على مقربة من طرفي الأنبوب ومع رئيس لافتا نحو افتتاح أنبوب ملاحظة 1: تأكد من تناول بعض الاغاروز قبل تناول الأسماك. ملاحظة 2: سحب بلطف شديد على حقنة لتجنب الفقاعات ملاحظة 3: الحفاظ على أنبوب في اتجاه أفقي لتجنب تسرب محتواه (أرقام 2M و2N). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنبوب <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; الشكل 2. متعدد الطبقات المتزايدة للالأجنة الزرد. A) الإيثيلين البروبيلين المفلورة (محطة إثراء الوقود) أنابيب على أسطوانة كابل قبل التحضير. B) A المحاقن مع نهاية حادة قنية المرفقة. C) وتنظيفها وقطع أنبوب محطة إثراء الوقود. D، E) Dechorionation من 24 HPF الأجنة الزرد. F) ربط أنبوب إلى نهاية قنية حادة. G) والمحاقن مع قنية وأنبوب المرفقة. H) قسامة من 0.1٪ الاغاروز داخل أنبوب رد فعل حين نقله إلى كتلة الحرارة. الأول) vortexing لمن ذاب الاغاروز. J) من امتصاص الجنين dechorionated باستخدام ماصة الزجاج. K) نقل الجنين إلى الاغاروز ذاب. L) كمية من الجنين مع توضيح الاغاروز في أنبوب محطة إثراء الوقود. M، N) الجنين الزرد داخل أنبوب محطة إثراء الوقود . <stroنانوغرام&gt; O) قطع أنبوب بين العينة وقنية. P) يسد الأنبوب عن طريق استخدام طبق المغلفة الاغاروز. س) الجنين داخل أنبوب موصول. R) إعداد العينة النهائية في حامل معدني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا ل عرض صورة أكبر.</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شفرة حلاقة لقطع أنبوب قبالة قنية (الشكل 2O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العصا ببطء نهاية الأنبوب الذي يحتوي على الأسماك من خلال طبقة كاملة من 1.5٪ الاغاروز في طبق من البلاستيك لسد الأنبوب (الشكل 2P) ملاحظة 1: تجنب تشكيل فقاعات ومحاولة الحصول على سطح المكونات على التوالي من خلال عقد . أنبوب بالضبط عمودي على سطح الاغاروز ملاحظة 2: تدوير الأنبوب قليلا للحصول على المكونات لطيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على العينة التي شنت في أنبوب 1.5 مل التفاعل مع E3 لتجنب التجفيف. العينة هو نآه جاهزة للتصوير. قبل التصوير، والتحقق ما إذا كان السمك هو يجلس على قمة المكونات (أرقام 2Q و2R). تأكد من إضافة أيضا إلى تريكين المتوسطة داخل غرفة التصوير في نفس التركيز كما في المتوسطة المتزايدة. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+functional+imaging+at+cellular+resolution+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 10 (5), 413-420 (2013).</li>
<li>Swoger, J., Muzzopappa, M., López-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophoton%22%5BJournal%5D)">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J. Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2011).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J. Biophoton. , 1-11 (2012).</li>
<li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+for+real-time+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy for real-time developmental biology.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 566-572 (2011).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeller%2C+PJ+%22Cold+Spring+Harb.+Prot%22">Cold Spring Harb. Prot</a>. 2010 (5), (2010).</li>
<li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li>
<li>Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+sample+holder+for+single+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A versatile sample holder for single plane illumination microscopy.</a> J. Microsc. 10, (2013).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li>
<li>Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li>
<li>Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+histone+variant+H2A.F%2FZ+and+a+transgenic+H2A.F%2FZ%3AGFP+fusion+protein+for+in+vivo+studies+of+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 211 (12), 603-610 (2001).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricaine+%28MS-222%29%3A+effects+on+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تقنيات الفحص المجهري المتقدمة مثل المجهر ورقة ضوء تمكننا من تسجيل بيانات الصورة مع القرار الزماني والمكاني عالية على مدى عدة أيام، ولكن أيضا تتطلب تقنيات تركيب العينة إلى تحسين. نقدم بروتوكول مفصلة من متعدد الطبقات المتزايدة للفحص المجهري ورقة ضوء التطور الزرد. طريقة واضحة لتنفيذ ونستخدمها في مختبرنا على أساس يومي. أنابيب FEP المكونات الأساسية لاستراتيجيتنا هي تركيب أنابيب مصنوعة من الإيثيلين البروبيلين البوليمر المفلورة (محطة إثراء الوقود). قررنا استخدام محطة إثراء الوقود في المقام الأول بسبب معامل الانكسار لها من 1.338، والذي يشبه إلى المياه وبالتالي فهي مناسبة بشكل مثالي للفحص المجهري ورقة خفيفة مع أهداف المياه وغمس العينة التي تتطلب الوسط المائي. الأنابيب مع 0.8 ملم وقطرها الداخلي 0.4 مم سماكة الجدار تناسب الزرد النامية بشكل جيد للغاية، ويمكن استخدامها مع أصحاب عينة نموذجية مناسبة لل1.6 مم<html> والشعيرات الدموية هي خيارنا الاول لطريقة عرض في تصاعد مستمر. نحن اختبار لهم بدقة في منطقتنا الاجهزة المدمج المنزل وكذلك في النظام التجاري &quot;Lightsheet Z.1&quot; من قبل كارل زايس المجهر وجدت أن أنابيب FEP توفر الاستقرار على المدى الطويل، لها تأثير ضئيل فقط على الأداء البصري وnonfluorescent هي 10. و، ومع ذلك، فإنها لا تتناسب مع عينات للتطبيقات التي تتطلب معامل الانكسار مختلفة، مثل مسح العينة. تتوفر أنابيب فضلا عن رقائق مصنوعة من محطة إثراء الوقود في مجموعة متنوعة من أقطار وسمك. بالإضافة إلى ذلك، محطة إثراء الوقود يمكن ذاب في 260 درجة مئوية، وبالتالي تقدم احتمالات لا نهاية لها تقريبا لعينة الدعم حسب الطلب في تصاعد مستمر. أنابيب البوليمر تميل إلى أن يتم توفير غير المعقمة، وهذا هو السبب يتضمن البروتوكول تنظيف عدة خطوات لضمان أفضل جودة البصرية. طلاء مع ميثيل يضمن أن أي جزء من الجنين الزرد المتزايد تتمسك البوليمر. الحمار = &quot;jove_step&quot;&gt; والمتوسطة المتزايدة ويستند القرار ل0.1٪ الاغاروز على اختبارات مكثفة من معدل النمو والجمود في تركيزات مختلفة من الاغاروز وميثيل 10. تركيزات الاغاروز أعلاه 0.1٪ وأظهرت بالفعل تأثير شديد على معدل نمو 24 HPF الزرد. بالإضافة إلى ذلك نستخدم جرعات منخفضة من تريكين المخدرات التخدير. إمكانات كتل تريكين العمل، مما يحول دون نقل الإشارات بين الدماغ والعضلات ويمنع تقلصات العضلات 16. A تركيز 133-200 ملغم / لتر يضمن تجميد كافية من الزرد بين 24-72 HPF. ومع ذلك، تريكين والمخدرات التخدير أخرى اختبرنا جرعة تظهر الآثار الجانبية تعتمد مثل الوذمة القلبية. بالإضافة إلى الجرعة المطلوبة من تريكين يختلف مع المرحلة التنموية للجنين. لذا نوصي الحد من تركيز تريكين إلى المبلغ اللازم للمراحل التنموية التي يتم تصويرها. لضمان أفضل الاداءم، ومنع تشكيل السامة والمنتجات، وينبغي أن تستخدم محلول المخزون تريكين الطازجة أو مطلق، محمية من الضوء وليس يسخن فوق 30 درجة مئوية. التضمين في أنابيب FEP يسمح أيضا للتعديل من السهل المتوسطة المتزايدة لحساب احتياجات محددة. للالوقت الفاصل بين التصوير من القلب، ونحن نوصي باستخدام 3٪ ميثيل و 100 ملغم / لتر تريكين بدلا من 0.1٪ الاغاروز و 200 ملغم / لتر للتركيب. ميثيل هو أكثر لزوجة من 0.1٪ الاغاروز وبالتالي توفير أعلى الجمود من تلقاء نفسه ويحتاج إلى أقل تريكين استخدامها لضمان الحبس من الجنين. تريكين حساس لدرجات حرارة تتجاوز 30 درجة مئوية، ويمكن أيضا أن تضعف من المتوسطة في غرفة التصوير، مما يؤدي إلى انخفاض الأداء والوخز ممكن من الجنين. لذلك، تأكد من استخدام تريكين أيضا في التصوير المتوسطة التي تغمر العينة التي شنت. إذا تجاربك تتطلب استخدام أعلىدرجات الحرارة، نوصي تبادل المتوسطة في غرفة التصوير إما باستمرار باستخدام نظام نضح أو يدويا مع أنبوب والمحاقن بين اثنين من نقاط الوقت. الخطوات الحاسمة الخطوات الحاسمة خلال عملية تركيب العينة هي كمية من العينة في أنبوب والإدراج من المكونات الاغاروز. يحدد كمية الموقف المبدئي للجنين، والتي هي مرهقة للتغيير بعد ذلك. يجب أن تكون العينات المتعددة المتاحة لتركيب وينبغي رصد نوعية تصاعد مع stereomicroscope. إذا كان التوجه عينة ليست مرضية، وتغيير سرعة وضع العينة وتجنب الحركات اللاحقة من المكبس قد تساعد في كثير من الأحيان وهذا يلوي الجنين. الاغاروز المكونات 1.5٪ ضروري لتجنب تسرب من الاغاروز 0.1٪. يجب أن يكون سطح المكونات داخل الأنبوب شقة لعدم التأثير على التوجه عينة خلال التنمية. لتحقيق الأمواج جيدةالآس، سمك طبقات مختلفة من الاغاروز تحتاج لفحصها ويحتاج الأنبوب ليتم وضعه في الاغاروز العادي إلى السطح. الدورية للأنبوب قليلا وسحب الأنبوب النشرات بعناية المكونات من الطبق. يجب فحص جودة التركيب مع stereomicroscope قبل التصوير. التصوير Multiview واحدة ميزة كبيرة من ورقة المجهر ضوء التصوير multiview، والقدرة على تدوير العينة، واكتساب ض أكوام من زوايا متعددة، وبعد ذلك تسجيل وتلتحم بها. طريقة أنشئت لتسجيل ض مداخن في الفضاء 3D هو تسجيل القائم على حبة باستخدام الخرز الفلورسنت المحيطة العينة كعلامات الائتمانية 17. ولكن هذه الطريقة تعتمد على وسيط الصلبة تصاعد مثل 1.5٪ الاغاروز وبالتالي يبدو لتكون متوافقة مع تصاعد متعدد الطبقات المقدمة هنا. ولكن العديد من الحلول البديلة تعمل بالاعتماد على التطبيق. أولا، يمكن للالخرز الفلورسنتأن تدمج المكونات الاغاروز، والتي يجب أن تكون في مجال الرؤية أثناء عملية الاستحواذ. الثانية، مواقف مرحلة يمكن معايرة قبل التجارب الفعلية باستخدام 1.5٪ العمود الاغاروز مع حبات الفلورسنت. الثالث، علامات بديلة مثل نوى الفلورسنت يمكن استخدامها لتحديد موقف ض مداخن بالنسبة لبعضها البعض. تبخر نموذجية الاجهزة المجهري ورقة ضوء استخدام حجرة العينة المفتوحة، الأمر الذي يؤدي إلى تبخر لا مفر منه على المدى المتوسط. منذ المتوسط ​​هو ضروري لبقاء العينة، لتقييد تبخر المتوسطة المتزايدة ومعامل الانكسار الصحيح بين البصريات وعينة، ونحن نوصي اتخاذ واحد أو أكثر من التدابير التالية لمنع التبخر. الأولى، والمتوسطة في غرفة يمكن تبادلها باستمرار من قبل نظام الارواء. الثانية، والمتوسطة يمكن تعبئتها يدويا. ثالثا، يمكن تغطيتها الغرفة مع غطاء أو رقائق مرنة. <pالطبقة = &quot;jove_step&quot;&gt; امدادات الاوكسجين تم تطوير محطة إثراء الوقود البوليمر على تحمل مجموعة كبيرة ومتنوعة من المواد الكيميائية وبالتالي فهي قوية، خامل كيميائيا وnonpermeable إلى الغاز. في حالة تصاعد الأكسجين متعدد الطبقات يمكن ان تخترق إلا من خلال المكونات الاغاروز واجهة الاغاروز الهواء، ولكن يبقى أن يظهر إذا امدادات الاوكسجين في تركيب متعدد الطبقات أقل بشدة بالمقارنة مع 1.5٪ في تصاعد الاغاروز دون دعم أنبوب البوليمر. لكن، وكما تصاعد في 1.5٪ الاغاروز يمكن أن تستخدم إلا لمدة ساعتين تقريبا قبل يتأثر التشكل الزرد متعدد الطبقات تصاعد يبدو أن الحل الشامل للتصوير متفوقة على المدى الطويل. تصوير المراحل الأولى من التطوير متعدد الطبقات المتزايدة أصبح الآن لدينا تقنية التضمين القياسية للفحص المجهري ورقة ضوء الوقت الفاصل بين الزرد الأكبر سنا من 24 HPF. وبالاضافة الى ذلك، ونحن أيضا استخدام أنابيب البوليمر لتصوير الأجنة مرحلة مبكرة. البريدتبقى mbryos في chorions وتقام في أنبوب محطة إثراء الوقود مع القطر الداخلي من 1 ملم ومليئة E3. الزرد يمكن أن تتطور بحرية داخل المشيماء ومازال يمكن تصويرها بشكل جيد باستخدام المجهر رقة الخفيفة. توقعات وقدم عينة متعدد الطبقات تصاعد تطلق العنان لكامل إمكانات المجهر ضوء ورقة في الوقت الحقيقي البيولوجيا التطورية مع الزرد. يمكن بسهولة أن يتم اعتمادها لتقنيات الفحص المجهري أخرى مثل التصوير المقطعي البصري الإسقاط (الأراضي الفلسطينية المحتلة) والكائنات الحية الأخرى. ونحن نعتقد أن محطة إثراء الوقود أنابيب من الحجم العادي ليست سوى الخطوات الأولى نحو تقنيات التركيب عينة مصممة خصيصا لتلبية الاحتياجات المحددة.

لفهم الأحداث والتفاعلات المعقدة خلال مرحلة التطور الجنيني، والبحوث في البيولوجيا التطورية هو المزيد والمزيد من التحرك من المجهري للخلايا وحيدة وأجهزة لفي الجسم الحي التصوير من الكائنات بأكملها. تفشل تقنيات الفحص المجهري التقليدية عادة لتقديم القرار المكانية والزمانية لمتابعة الأحداث السريعة على مدى فترة طويلة من الزمن، وغالبا ما تسبب تبيض أو التأثيرات الضوئية في العينة 1. نحن وغيرنا وجدت ورقة المجهر الضوئي (الشكل 1) أن الأسلوب المثالي لفي الجسم الحي التصوير من الزرد 2-4. إضاءة العينة مع ورقة رقيقة من ضوء الليزر، ومتعامد على محور الكشف، ويقدم باجتزاء بصري سريع لقرار مكانية عالية وكذلك التقليل من الصور سمية 5. في نفس الوقت، ونتيجة لهذا الترتيب بصرية فريدة من نوعها، وتقنيات التركيب عينة التقليدية باستخدام أطباق بتري أو دوائر الثقافة ليست مناسبة. في ضوء نموذجيالمجهر رقة ثلاثة محركات متعدية ومحرك التناوب عقد العينة، بحيث يمكن وضعه على وجه التحديد، وتحولت وينظر إليها من أي اتجاه. في العينات للفحص المجهري ورقة الماضي الضوء وغالبا ما كان جزءا لا يتجزأ من 1-2٪ الاغاروز داخل الزجاج الشعرية 6،7. في هذه الحالة هو مقذوف الاسطوانة الاغاروز طدت مع العينة جزءا لا يتجزأ من الزجاج الشعرية في حجرة العينة مليئة المتوسطة مثل الماء للتصوير. الاغاروز لديها معامل الانكسار على مقربة من المياه وبالتالي فهي مناسبة تماما لفي الجسم الحي المجهري ورقة الخفيفة التي يسهل الإضاءة والكشف البصريات تصحيح الماء. يقتصر العينة في الاغاروز جامدة ويمكن تصويرها بشكل جيد لفترة قصيرة من الوقت، ولكن يعانون من ضعف بشدة التغييرات التخلق ونمو الجنين عند التصوير لعدة ساعات 7،8. على الرغم من حلول لتطبيقات أخرى تم تطويرها 9، وموسع على المدى الطويل الوقت الفاصل بين الزرد<html> إمكانية التصوير المجهري ورقة ضوء لا يمكن استغلالها باستخدام التقليدية 1.5٪ الاغاروز التضمين. لذا قمنا بتطوير استراتيجية جديدة للتصاعد في الجسم الحي المجهري ورقة ضوء الأجنة الزرد 10. هي التي شنت العينة في 0.1٪ الاغاروز مع 200 ملغم / لتر تريكين داخل أنبوب مصنوع من البوليمر واضحة بصريا المفلورة الإثيلين البروبيلين (محطة إثراء الوقود). الجنين جزءا لا يتجزأ من تطور عادة بسبب اللزوجة المنخفضة من المتوسط. في نفس الوقت، وأنبوب محطة إثراء الوقود يحصر المتوسطة وعينة لمدة التجربة. ونحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لتقنية جديدة وتركيب البيانات الحالية تعكس مزاياه عبر بروتوكول التقليدية. علينا أن نبرهن أنه مع أسلوبنا التنمية الزرد يمكن تصويرها بشكل مستمر مع القرار المكانية والزمانية عالية على مدى فترة من أكثر من يومين. 5IN &quot;FO: SRC =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. مبدأ المجهر رقة الخفيفة. يمكن ترجمتها A الزرد شنت في أنبوب مصنوع من الإيثيلين البروبيلين المفلورة (محطة إثراء الوقود) واستدارة من خلال البؤري للهدف الكشف. ومن المتوقع ورقة رقيقة من ضوء الليزر (ورقة الضوء) عن طريق الهدف الإضاءة في المستوى البؤري للهدف الكشف وينير سوى جزء البصرية رقيقة من العينة. يتم جمع إشارة مضان المنبعثة من الهدف كشف وتسجيلها على شريحة الكاميرا.

<table><tbody><tr><td>أنابيب الإيثيلين بروبيلين المفلورة (FEP)</td><td>Bola</td><td>S 1815-04</td><td>0.8 / 1.6 مم القطر الداخلي / الخارجي ، الأحجام الأخرى المتاحة</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo 1 مل حقنة</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9161406 V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican القنية ذات الاستخدام الواحد ، حادة</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9180109</td><td>0.8 مم × 22 مم ، أحجام أخرى متاحة ، يجب أن يتناسب القطر الخارجي للقنية مع القطر الداخلي لأنبوب</td></tr> <tr><td>FEP50 مل من مادة البولي بروبيلين أنبوب الطرد المركزي</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M NaOH &nbsp ؛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70٪ EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ميثيل السليلوز</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>يتم توفيره كمسحوق</td></tr><tr><td>E3 متوسط (لأجنة الزرد)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1.5 مل أنبوب التفاعل</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Agarose ، درجة حرارة تبلور منخفضة</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>يتم توفيره كمسحوق</td></tr><tr><td>طبق</td> <td>بتريGreiner</td><td>633180</td><td>بلاستيك ، 94 مم × 16 مم</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>مرادفات:&nbsp; إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات ، MS-222 ، TS 222 ، تريكايين ميثان سولفونات &nbsp ؛</td></tr><tr><td>10X / 0.3 W المجهر عدسة موضوعية</td><td>Leica</td><td>HCX APO L</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD كاميرا</td><td>Andor Technology</td><td>iXon 885 EMCCD</td><td></td></tr></tbody></table>

متعدد الطبقات لتركيب المدى الطويل المجهر الضوئي ورقة من الزرد

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

المجهر الضوئي ورقة هي تقنية التصوير المثالي لدراسة التطور الجنيني الزرد. بسبب الحد الأدنى الصور سمية والتبييض، ويناسب ذلك وخاصة على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير على مدى ساعات طويلة تصل إلى عدة أيام. ومع ذلك، هناك حاجة إلى استراتيجية مناسبة تركيب العينة أن يقدم كل من الولادة والتطور الطبيعي للعينة. متعدد الطبقات المتزايدة، وهي تقنية جديدة باستخدام التضمين المنخفضة تركيز الاغاروز في أنابيب واضحة بصريا، ويتغلب الآن هذا القيد وتطلق العنان لكامل إمكانات المجهر ضوء ورقة في الوقت الحقيقي البيولوجيا التطورية.

التصوير Multiday من اسماك الزرد الأوعية الدموية التنمية نستخدم 1 DPF تيراغرام (kdrl: GFP) 13 الزرد للتدليل على مزايا استراتيجية متعددة الطبقات المتزايدة على المدى الطويل المجهري ورقة الخفيفة. والهدف من ذلك هو صورة تطوير الأوعية الدموية في الزرد بأكملها على مدار أيام 2. وقد شنت الجنين الزرد في 0.1٪ الاغاروز داخل ميثيل المغلفة أنبوب البوليمر. هنا، لا يقتصر الزرد من تصاعد المتوسطة ويمكن أن تتطور بشكل طبيعي. يرفع رأسه، والذيل يمتد ويظهر تنتشر الأوعية الدموية دون عوائق (الشكل 3). <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> الشكل 3. التصوير Multiday للتنمية الأوعية الدموية الزرد. والأوعية الدموية من multilaشنت ريال يمني 1 DPF تيراغرام (kdrl: GFP) 13 الزرد يتطور دون عوائق في ضوء المجهر رقة على مدار يومين. ورقة ضوء الليزر 488 نانومتر متحمس مضان وتم الكشف عن إشارة باستخدام 10X/0.3 الهدف W وكاميرا EMCCD. تم الحصول عليها Z-المداخن على أربعة مناصب المتاخمة كل 10 دقيقة ومخيط مع فيجي 15 في وقت لاحق. وتظهر التوقعات كثافة اكبر من مجموعة فرعية من نقاط الوقت. شريط مقياس: 500 ميكرون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> التصوير من اسماك الزرد مرحلة التطور الجنيني المبكر هنا، علينا أن نظهر قدرة أنابيب محطة إثراء الوقود كوسيلة لدعم تصاعد للفحص المجهري ورقة ضوء مرحلة التطور الجنيني المبكر الزرد خلال اليوم الأول بعد الإخصاب. 8 HPF تيراغرام (H2A: GFP) أقيم 14 الجنين الزرد مع المشيمه لها سليمة داخل أنبوب E3 شغل مع طقطر nner من 1 ملم. أن النتائج في لقط طفيف في المشيمه. جميع العمليات التنموية خلال مرحلة التطور الجنيني لا تتأثر التركيب ويمكن تصور أمثل باستخدام المجهر رقة الخفيفة. في هذا المثال، ونحن تصوير العينة على مسار 12 ساعة (الشكل 4). يتغير شكل نموذجي خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، مثل استطالة متزايدة من صفار البيض وسماكة الأنسجة على طول خط الوسط، سيكون المظلوم عند استخدام التركيب التقليدية دون المشيماء في 1.5٪ الاغاروز. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> الشكل 4 التصوير في وقت مبكر من مرحلة التطور الجنيني الزرد A تيراغرام (H2A: GFP). يمر 14 الزرد خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر. تم الكشف عن ورقة ضوء الليزر 488 نانومتر GFP متحمس وإشارة مضانمع الهدف W 10X/0.3 وكاميرا EMCCD. تم الحصول عليها Z-أكوام من زاويتين كل 3 دقائق على مدار 12 ساعة. وتظهر التوقعات كثافة اكبر من تطبيع مجموعة فرعية من مرور الوقت. مرئية الضبابية في 19 HPF النتائج من الوخز الجنين خلال الاستحواذ، حيث تم استخدام أي مخدر. شريط مقياس: 150 ميكرون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a>

يمكن اتباعها لتطوير الزرد خلال الأيام مع المجهري ورقة الضوء عندما يتم تضمين الأجنة في أنابيب البوليمر واضحة بصريا مع منخفضة التركيز الاغاروز.

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تثبيت جنين سمكة الزيبرا لإجراء مجهر الصفيحة الضوئية في الجسم الحي لفترة طويلة. يتم تحقيق ذلك أولاً بتنظيف أنبوب من إيثيلين بروبيلين مفلور أو FEP وتغليفه بالميثيل سليلوز. بعد ذلك، يتم تغليف جنين سمكة الزيبرا المطلوب دراسته.بعد ذلك، يُنقل الجنين أولاً إلى أغاروز مُذاب، ثم إلى أنبوب FEP المطلي. وأخيراً، يتم إغلاق أسفل الأنبوب باستخدام سدادة aros والتحقق بعناية من توجيه الجنين المثبت. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر التطور غير المضطرب لأجنة zebra fish على مدار عدة أيام وبدقة مكانية وزمانية عالية من خلال مجهر الورقة الضوئية in vivo.إن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالتقنيات الحالية هي قدرتنا الآن على مراقبة أجنة أسماك الزيبرا لعدة أيام وليس لبضع ساعات فقط. ويمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى قيمة حول عملية التكون الجنيني طويلة الأمد لأسماك الزيبرا باستخدام مجهر الورقة الضوئية. كما يمكن تطبيقها على كائنات صغيرة أخرى مثل الكائنات البحرية الصغيرة.يمكن استخدامه أيضًا مع تقنيات مجهرية أخرى مثل التصوير المقطعي بالإسقاط البصري، أو المجهر ذو المجال الواسع، أو المجهر البؤري. قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن البروتوكول يتضمن خطوات حرجة زمنياً، كما يتطلب تحديد الموضع النهائي للجنين بعض الخبرة. لتحضير أنبوب FEP، ابدأ بتنظيفه عن طريق شطفه بشكل متكرر بمحلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 molar. ثم انقل الأنبوب إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter مملوء بمحلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.5 molar وعرّضه للموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق.انقل الأنبوب البوليمري إلى حوض صغير يحتوي على ماء مقطر منزوع الأيونات وقم بشطفه. ثم اتبع ذلك بشطف باستخدام إيثانول 70% قبل نقله إلى أنبوب طرد مركزي جديد. مع استخدام الموجات فوق الصوتية في الإيثانول.قم بمعالجة الأنبوب بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق قبل نقله إلى حوض صغير يحتوي على ماء مقطر منزوع الأيونات وشطفه. مجدداً. اقطع أنبوب FEB النظيف إلى قطع بطول ثلاثة سنتيمترات وقم بتسويتها إذا لزم الأمر. احفظ الأنابيب التي تم تنظيفها في أنبوب جديد سعة 50 milliliter مملوء بماء مقطر منزوع الأيونات.قم بتحضير المحلول المخزون من Trica. ومحلول ميثيل السليلوز (Methylcellulose) بتركيز 3% ومحلول Aros بتركيزين 1.5% و0.1% وفقاً لبروتوكول النص. قم بصهر الآغار (agarro) بتركيز 1.5% وصبّه في طبق بتري لتشكيل طبقة بسمك حوالي مليمترين.اجمع أجنة أسماك الزيبرا في المرحلة المطلوبة والتي أظهرت تعبيراً إيجابياً لجين الفلورة المختار، ثم انقلها إلى طبق جديد يحتوي على محلول E three تحت المجهر المجسم. وباستخدام ملقطين حادين، قم بإزالة الغشاء الكوريوني للأجنة بعناية، حيث يُستخدم الملقط الأول لتثبيت الغشاء الكوريوني والملقط الثاني لتمزيقه وسحبه لإجراء عملية التثبيت متعدد الطبقات. وباستخدام يدين مغطاتين بقفازات، قم بتوصيل كانيولا ذات نهاية غير حادة بحقنة.أدخل الكانيولا بعناية لمسافة ثلاثة مليمترات تقريباً في أحد طرفي قطعة نظيفة من أنبوب FEP. بعد ذلك، اغمس الطرف الحر لأنبوب FEP في Methylcellulose بتركيز 3% واملأ الأنبوب بالمحلول. ثم اضغط ببطء على المحقنة لطرد الميثيل سليلوز باستخدام وسط E three، وكرر خطوات الغمس والطرد.وفي هذه الأثناء، يتم تسخين حصة واحدة من 0.1%aros في كتلة تسخين حتى 70 °C. قم برج أنبوب التفاعل باستخدام جهاز الرج (Vortex) لفترة وجيزة قبل نقله إلى كتلة تسخين مضبوطة على 38 °C. وبعد التسخين، اترك الأنبوب ليبرد لفترة وجيزة ثم أضف trica ليصل التركيز النهائي إلى 133 إلى 200 mg/L وقم بالرج باستخدام جهاز Vortex.مرة أخرى، وباستخدام ماصة باستير زجاجية، انقل جنيناً مُغلفاً إلى أنبوب التفاعل الذي يحتوي على سائل aros المُسخن مسبقاً، مع نقل أقل كمية ممكنة من E three. وباستخدام أنبوب FEP والمحقنة المتصلة به، اسحب كمية صغيرة من سائل aros بلطف قبل سحب الجنين، ثم املأ الأنبوب بالكامل بسائل aros.يجب وضع الجنين عند أي من طرفي الأنبوب بحيث يكون الرأس متجهاً نحو الفتحة. ولتجنب تسرب المحتويات، حافظ على الأنبوب في وضع أفقي لسدّه. استخدم شفرة حلاقة لقطعه عن الكانيولا.بعد ذلك، مع إمساك الأنبوب بشكل عمودي، اغرس طرفه ببطء عبر طبقة 1.5%aros بالكامل وقم بتدويره قليلاً. ولتجنب الجفاف، احتفظ بالعينة المثبتة في أنبوب تفاعل سعة 1.5 milliliter مملوء بوسط E three قبل التصوير. تحقق من أن السمكة داخل أنبوب FEP في وضع مستقيم، بحيث يستقر رأسها مباشرة فوق السدادة من أجل التصوير.أضف مادة trica إلى الوسط داخل غرفة التصوير. يظهر هنا جنين سمكة زيبرا معدل وراثياً K-G-R-L-G-F-P بعد يوم واحد من الإخصاب، حيث تم تصويره على مدار يومين لمراقبة تطور الأوعية الدموية.لا يتقيد سمك الزيبرا بوسط التثبيت ويمكنه النمو بشكل طبيعي. فعلى سبيل المثال، يرتفع الرأس، ويمتد الذيل، ويظهر التبرعم الوعائي دون عوائق.يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 10 دقائق إذا تم تطبيقها بشكل صحيح وكانت جميع المواد متاحة. تذكر تنفيذ جميع الخطوات الرئيسية دون أي تأخير. حافظ على نظافة جميع المحاليل لأن الشوائب قد تؤثر سلباً على جودة الصورة النهائية.

multilayer-mounting-for-long-term-light-sheet-microscopy-of-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

توضح هذه المقالة تحضير العينة للفحص المجهري الفلوري للصفائح الخفيفة. كما يوضح طريقة لتركيب أجنة الزرد الحية للتصوير طويل الأمد ، مما يسمح بتسجيل أفلام طويلة الأمد للأجنة الحية في ظروف شبه فسيولوجية.

إعداد عينة الفحص المجهري للورقة الخفيفة: تركيب أجنة أسماك الزرد الحية للتصوير طويل الأمد

توضح هذه المقالة طريقة لتركيب أجنة الزرد الحية للتصوير طويل المدى. هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة وسهلة التنفيذ باستخدام أطباق الفحص المجهري العادية ذات القاع الزجاجي للتصوير على المجهر المقلوب. يتم إجراء التركيب في طبقات من الاغاروز بتركيزات مختلفة.

تركيب أجار متعدد الطبقات: تحضير أجنة أسماك الزرد الحية للتصوير طويل المدى باستخدام مجهر مقلوب

نقدم بروتوكولا لالتقاط ديناميكيات تجديد زعانف ذيل يرقات الزرد على نطاق كامل من الأنسجة باستخدام الفحص المجهري المجهري القائم على الحقل الساطع. تتيح هذه التقنية التقاط ديناميكيات التجديد بدقة خلية واحدة. يمكن تكييف هذه المنهجية مع أي مجهر مجسمة مزود بكاميرا CCD وبرنامج الفاصل الزمني.

التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

يعد الفحص المجهري الفلوري للصفائح الخفيفة &lt; p class = 'jove_content'&gt; أداة ممتازة لتصوير التطور الجنيني. يسمح بتسجيل أفلام بفاصل زمني طويل للأجنة الحية في ظروف فسيولوجية قريبة. نعرض تطبيقها لتصوير تطور عين الزرد عبر المقاييس المكانية والزمانية الواسعة ونقدم خط أنابيب للاندماج وتفكيك مجموعات البيانات متعددة المشاهدة.

باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين

هنا ، نقدم طريقة تركيب متعددة الاستخدامات تسمح بالتصوير بفاصل زمني طويل الأمد لنمو الجسم الخلفي لأجنة أسماك الزرد الحية دون الإخلال بالتطور الطبيعي.

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

توضح هذه المقالة طريقه لتحميل الاجنه الضعيفة الهشة للحصول علي المجهر البؤري المطول الفاصل الزمني. هذه الطريقة منخفضه التكلفة سهله الأداء باستخدام الاطباق المجهرية العادية بالزجاج السفلي للتصوير علي اي مجهر مقلوب. يتم تنفيذ التركيب في طبقات من اجنشا في تركيزات مختلفه.

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

نحن نصف الأدوات المحسنة لدراسة قلب حمار وحشي في الجسم الحي مع المجهر مضان ورقة الضوء. على وجه التحديد، نقترح خطوط القلب المعدلة وراثيا مشرق وتقديم تقنيات جديدة لطيف تضمين وشل الحركة التي تجنب عيوب النمو والقلب. كما يتم توفير خط أنابيب محتمل للحصول على البيانات وتحليلها يتكيف مع تصوير القلب.

المجهر ورقة خفيفة من ديناميات القلب السريع في أجنة حمار وحشي

تم وصف استراتيجية تحضير العينة لتصوير أجنة الزرد المبكرة داخل مشيمة سليمة باستخدام مجهر صفائح ضوئي. يحلل الاتجاهات المختلفة التي تكتسبها الأجنة داخل المشيمة في مراحل 70٪ من المشيمة والبراعم ويفصل استراتيجيات التصوير للحصول على دقة على نطاق خلوي في جميع أنحاء الجنين باستخدام نظام الورقة الضوئية.

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

في هذا التقرير ، نقترح تطبيق جديد للضوء علاج الأسنان راتنجات لقاعدة متزايدة من الأقطاب الكهربائية أو تحقيقات microdialysis في التجارب المزمنة. هذه المواد يسمح الترابط المباشر إلى الجمجمة.

تطبيق فاتح الشفاء الراتنج لاصق الأسنان أو تركيب لأقطاب مجسات Microdialysis في التجارب المزمنة

تعلم تركيب أجنة سمك الزرد لمجهر الضوء الورقي طويل المدى باستخدام أنابيب FEP وأغاروز. تتيح هذه التقنية مراقبة التطور الجنيني لعدة أيام بدقة عالية دون إزعاج.

متعدد الطبقات لتركيب المدى الطويل المجهر الضوئي ورقة من الزرد

استكشف المزيد من الفيديوهات