Name: 인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-14T18:32:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 학습하세요 인간 전립선암 조직에서 암 줄기 세포를 분리하는 방법을. FACS를 이용한 형광 항체 라벨링과 세포 분류 기술로 암 줄기 세포의 분자적 특성을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 하리리 가족 재단과 TJ 마텔 재단에 의해 지원되었다.

1. 수확 및 수술 표본에서 인간의 전립선 암 조직의 처리 <ol><li> 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 1640 배지 15 ㎖를 50 ㎖이 함유 폴리스티렌 원추형 튜브를 준비한다. </li><li> 병리학 서비스 담당자가 프로토콜을 승인 한 기관 심사위원회에서 각각 전립선 및 완화 수술 표본에서 기본 및 전이성 전립선 암 샘플을, 수확. 전이성 샘플 차 수술 중 림프절 해부에서 얻을 수 있습니다, 다른 사람의 사이에서 하나의 전이성 병변의 진단 제거, 동안 고식적 수술 척수 압축 해제 등의 절차, 폐 동안 척추. <ol><li> 단계 1.1에서 첫 번째 50 ML의 폴리스티렌 원뿔 관에 임상 진단을 위해 필요하지 초과 대량 조직을 수확, 4 ℃에서 바로 저장 harvesteD 조직은 적어도 지역 4 ~ 5 ㎠의 두께에서 1-2 cm를 측정해야한다. </li></ol></li><li> 연구소 직원은 세포 현탁액의 조직 학적 검사와 세대를위한 준비에 병리 서비스에서 얻은 대량 조직을 처리합니다. <ol><li> 대량 조직의 처리는 최대한의 세포 생존을 보장하기 위해 수술 적 절제에서 24 시간을 초과 할 수 없습니다. </li><li> 멸균 메스와 집게와 생물 안전 캐비닛에서 작업, 거시적 종양 결절 2-4 mm 두께의 수평 조직 섹션을. 즉시 단계 1.1에서 두 번째 50 ㎖ 폴리스티렌 원뿔 튜브에 섹션을 저장합니다. </li><li> 거시적 결절이 전립선 샘플에서 가시화되지 않을 경우, 후부의 엽 (叶) 및 전환 영역에서 임의의 2~4밀리미터 두께 수평 조직 섹션을 수집합니다. </li></ol></li><li> 멸균 메스와 핀셋을 사용하여 수술 조직의 일부를 분리하고 이전 세대에서 10 % 포르말린에 고정세포 현탁액의 기. 보관 및 전립선 암 조직의 존재를 확인하기 위해이 물질을 조직 학적 분석. </li></ol> 2. 조직 섹션의 세포 현탁액의 생성 <ol><li> 멸균 생물 안전 캐비닛에서 작업, 멸균 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 1 ㎖를 포함하는 60 X 15mm 배양 접시에 조직 섹션을 전송합니다. <ol><li> 기계적으로 멸균 메스와 집게를 사용하여 샘​​플을 씹다. </li><li> 어떤 효소 digestions이 프로토콜에 없습니다. </li></ol></li><li> 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 1 ㎖ 현탁액을 전송합니다. <ol><li> 배양 접시에 1 ㎖를 추가하고 조직 절편이 완전히 보통 3 - 4 배, 해리 될 때까지 분쇄 단계를 반복합니다. </li><li> 모든 조직 섹션이 분해 될 때까지 순차적으로이 절차를 반복합니다. </li></ol></li><li> 5 ㎖의 혈청 학적 PI로 50 ml의 폴리스티렌 원뿔 관의 내용을 재현 탁pette 1 분 동안 최대 속도 (약 3,200 RPM)에서 소용돌이. </li><li> 35 μm의 셀 스트레이너를 통해 생성 된 현탁액을 필터 및 제 멸균 50 ML의 폴리스티렌 원뿔 튜브에 수집합니다. </li><li> 10 분 450 XG에서 원심 분리하여 펠렛을 생성합니다. </li><li> , 상층 액을 버린다 적혈구 세포 용해 완충액 5 ㎖로 펠렛을 재현 탁하고, RT에서 5 분을위한 솔루션을 품어. RT 450 XG에 5 분 동안 원심 분리하여 적혈구 세포 용해 버퍼를 제거합니다. </li><li> 상층 액을 버리고 5 % FBS로 보충 된 PBS 1X에 펠렛을 재현 탁하고, 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 실행 가능한 (트리 판 블루 음성) 세포의 수를 정량. 1 × 10 6 세포 / ㎖ 현탁액을 생성하고 더 이상 1 시간 이상 동안 얼음에 보관하지. <ol><li> 생존과 세포의 수율은 종양 표본 사이에 상당히 다를 수 있습니다. 전립선 설정에서 생존 능력 45~70%와 인터넷 사이의 범위 수거시적 종양 결절에서 두꺼운 수평 조직 섹션은 약 3 × 6 가능한 세포를 얻을 것으로 예상 할 수있다 2-4밀리미터을했습니다. </li></ol></li></ol> 3. FACS에 대한 세포의 항체 염색법 <ol><li> 아래 그림과 같이 다섯 15 ML의 폴리스티렌 원뿔 튜브 레이블을 지정합니다. 각각 조혈 및 내피 요소를 제외 CD45 및 CD31 항원 라벨을 사용합니다. <ol><li> 흠없는 </li><li> 의 IgG 2A의 κ-PE + IgG의 1 κ-FITC </li><li> HLAI-PE + IgG의 1 κ-FITC </li><li> 의 IgG 2A의 κ-PE + CD31-FITC + CD45-FITC </li><li> HLAI-PE + CD45-FITC + CD31-FITC </li></ol></li><li> 3.1 단계에있는 5 개의 튜브에 이전 섹션 (단계 2.7)에서 정량화 된 세포 현탁액을 배포합니다. 1:250의 희석에 항체를 추가하고 30 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 품어. </li><li> 4 ° C에서 3 분 450 XG에서 세포를 원심 분리하고, 상층 액을 버린다. </li&gt; <li> 멸균 1X PBS 각 펠렛을 재현 탁하여 세포를 씻으 4 ℃에서 3 분 450 XG에서 원심 분리 한 다음 10 % FBS와 보충 </li><li> 10 ㎍ / ㎖의 농도의 4를 함유하는 1X PBS를 1 ㎖ 용액 &#39;,6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)로 세포를 재현 탁. </li><li> 12mm X 75mm의 폴리스티렌 튜브에 35 ㎛의 여과기 모자를 통해 최종 솔루션을 필터링합니다. </li></ol> 4. FACS에 의한 전립선 암줄 기세포의 분리 <ol><li> 셀 정렬의 흐름 세포 계수기를 사용한다. </li><li> 튜브에서 # 1, # 2, # 3 세포를 사용하여 보정 컨트롤을 설정하고, # 4. </li><li> 전방 및 측면 산란 매개 변수를 사용하여 파편과 세포의 클러스터를 제외 게이트를 만듭니다. </li><li> 각각 튜브 # 3, # 4 관에서 현탁액을 사용하여 FITC와 PE 게이트를 설정합니다. </li><li> 퍼시픽 블루-A 채널을 사용 가능한 게이트 (DAPI 음성) 세포. </li><li> 관 # 5 폐기는 CD31 양성 및 CD45 양성 세포를 사용하여RPMI 2 ㎖를 10 % FBS와 보충을 포함하는 멸균 15 ML의 폴리스티렌 원뿔 튜브에 모두 HLAI 음성 및 HLAI 양성 인구를 수집합니다. </li><li> 원심 분리기 5 분 450 XG에서 세포 현탁액을 분류하고 10 % FBS와 보충 RPMI의 200 ~ 500 μL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 실행 가능한 (트리 판 블루 음) 세포를 정량화. </li></ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Magee, J. A., Piskounova, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+impact%2C+heterogeneity%2C+and+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: impact, heterogeneity, and uncertainty.</a> Cancer Cell. 21, 283-296 (2012).</li>
<li>Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+an+evolving+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: an evolving concept.</a> Nat. Rev. Cancer. 12, 133-143 (2012).</li>
<li>Valent, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+definitions+and+terminology%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details.</a> Nat. Rev. Cancer. 12, 767-775 (2012).</li>
<li>Visvader, J. E., Lindeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+current+status+and+evolving+complexities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: current status and evolving complexities.</a> Cell Stem Cell. 10, 717-728 (2012).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367, 645-648 (1994).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 3983-3988 (2003).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
<li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Res. 65, 10946-10951 (2005).</li>
<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer Cell. 22, 373-388 (2012).</li>
<li>Patrawala, L., Calhoun-Davis, T., Schneider-Broussard, R., Tang, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+of+prostate+cancer+cells+in+xenograft+tumors%3A+the+CD44%2Balpha2beta1%2B+cell+population+is+enriched+in+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization of prostate cancer cells in xenograft tumors: the CD44+alpha2beta1+ cell population is enriched in tumor-initiating cells.</a> Cancer Res. 67, 6796-6805 (2007).</li>
<li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PSA%28-%2Flo%29+prostate+cancer+cell+population+harbors+self-renewing+long-term+tumor-propagating+cells+that+resist+castration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The PSA(-/lo) prostate cancer cell population harbors self-renewing long-term tumor-propagating cells that resist castration.</a> Cell Stem Cell. 10, 556-569 (2012).</li>
<li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2013%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2013.</a> CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).</li>
<li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+CD44%2B+prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 신선한 인간의 전립선 암 조직에서 암줄 기세포의 분리에 대해 설명합니다. 몇 가지 중요한 고려 사항은이 프로토콜의 성공적인 결과에 영향을 미친다. 가능한 전립선 암 세포의 높은 숫자의 회복 수술 견본 조심 총 평가에 의존한다. 거시적 종양 결절이 관찰 10을 처리 할 때 우리의 경험에서, 종양 형성 전립선 세포의 성공적인 분리가 가장 확실하다. 그러나, 전립선 표본에서 파생 된 요즘 차 질환은 자주 다 초점 현미경입니다. 이러한 경우에, 가능한 시료 처리가 수확 전립선 암 세포의 가능성을 증가시키기 위해 이전 임상 생검 결과로 통지되어야 할 때. 잘 훈련 된 실험실 직원이 배수에서 전립선 암줄 기세포의 성공적인 분리를 보장하기 위해 자주 프로토콜을 수행하기 위해 우리의 경험, 그것은 필요가있다iple 임상 전립선 샘플. 우리는 여기에 세포 ...

종양 내 이질 암 (1)의 특징으로 간주됩니다. 실제로, 종양 내 이성의 몇 가지 메커니즘이 유전자 변이와 미세 환경과의 상호 작용을 포함하여 기술되었다. 또한, 일부 암은 직렬 이식 분석 2-5 종양 개시 용량과 자기 갱신의 특성을 나타내는 암 줄기 세포 (암줄 기세포)의 모집단으로 셀룰러 계층 구조를 포함 할 수있다. 초기에 혈액 6, 유방 7 뇌 8 악성 종양에 설명, 암줄 기세포는 전립선 암 9-12뿐만 아니라 다른 종양 유형 2-5에서 연구되고있다. 암줄 기세포는 일반적으로 이종 인구 2-5 내에서 세포 부분으로 간주됩니다. 따라서 암줄 기세포의 기능 및 분자 특성은 대량 집단에서 자신의 농축에 달려있다. 따라서, 지난 20 년간 여러 가지 사항이 충족CSC 농축 hodologies는 일반적으로 유동 세포 계측법에 의해 표시 인구의 분리를 포함하는 고안되었다. 또한, 암줄 기세포의 연구에 중요한 고려 사항은 인체 조직의 계층 적 조직 등의 문화 또는 면역 결핍 생쥐의 일련 계대으로 실험 조작에 의해 중단 될 수 있다는 것이다. 그 결과, 인간의 조직으로부터의 직접적인 CSC 추가 절연은 CSC 분야에서 중요한 방법으로 떠오르고있다. 전립선 암은 암 이환율 및 미국 및 세계 (13) 주변의 사망의 주요 원인이다. 따라서, 전립선 암줄 기세포의 분리 및 생물학적 특성은 상당한 관심입니다. 전립선 암줄 기세포는 이전 세포주, 환자 유래의 이종 이식, 낮은 통로 환자 파생 된 서스펜션 문화 9,10,12,14에서 풍성하게한다. 우리는 최근에 직접적으로 인간의 수술들에서 전립선 암줄 기세포의 분리를보고자신의 HLAI 음성 세포 표면 표현형 (10)의 미덕 amples. 여기서 자세하게는 이들 세포의 분리를 위해 구현 된 절차를 우리. 전립선 종양 수술 표본에서 수확 세포 현탁액으로 만들어집니다. 세포는 다음 HLAI에 대한 항체뿐만 아니라 간질과 생존 마커를 사용하여 염색하고, 암줄 기세포는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)에 의해 격리됩니다. 고립 된 암줄 기세포는 가능한 세포를 필요로하는 분석에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>60 mm, 15 mm 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>3295</td><td></td></tr><tr><td>35 & 마이크로; m 세포 여과기</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브</td><td>Crystalgen</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>Crystalgen</td><td>23-2265</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>HLA 클래스 I (W6 / 32) PE 항체</td><td>Abcam</td><td>ab43545</td><td></td></tr><tr><td>CD31 FITC 항체</td><td>eBioscience</td><td>11-0319-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45 FITC 항체</td><td>Abcam</td><td>ab27287</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a&kappa; PE 항체</td><td>BD Pharminogen</td><td>555574</td><td></td></tr><tr><td>IgG1&kappa; FITC 항체</td><td>BD Pharminogen</td><td>551954</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>d3571</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너 캡이 있는 12mm x 75mm 폴리스티렌 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Crystalgen</td><td>CG-BV1000</td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 버퍼 포르말린</td><td>Fisher</td><td>RBBP-0480</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

암 줄기 세포 (CSC) 모델은 상당히 지난 20 년간 재 방문하고있다. 이 시간 동안 암줄 기세포를 확인하고 직접 고립 된 인간의 조직에서 순차적으로 일반적으로 유동 세포 계측법에 의해 세포와 분별의 모집단의 항체 라벨링을 통해, 면역 결핍 쥐에 전파되었다. 그러나, 전립선 암의 유일한 임상 적 특징은 상당히 신선한 인간 종양 샘플에서 전립선 CSC 추가의 연구를 한정 하였다. 우리는 최근 자신의 HLA 클래스 I (HLAI) 음성 표현형의 미덕에 의해 직접 인체 조직에서 전립선 암줄 기세포의 분리를보고했다. 전립선 암 세포는 수술 표본에서 수확 기계적으로 분해된다. 세포 현탁액은 생성과 형광 복합 HLAI과 기질 항체가 표시되어 있습니다. HLAI 부정적인 세포의 모집단은 마지막으로 유동 세포 계수기를 사용하여 격리됩니다. 이 프로토콜의 주요 제한은 자주 현미경 및 다 초점 본성전립선 절제 표본의 기본 암. 그럼에도 불구하고, 고립 된 라이브 전립선 암줄 기세포는 면역 결핍 마우스에 이식하여 분자 특성 및 기능 검증에 적합하다.

<img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51332/51332fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51332/51332fig1.jpg" /> 그림 1. 인간의 전립선 암 종양의 수확과 인간 전립선 암의 특정 집단을 설명 줄거리 유동 세포 계측법. (A) 종양 결절 세포 현탁액을 생성하기 위해 수확. 처리 된 샘플의 종양의 콘텐츠는 종래의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 이용하여 확인된다. DAPI에 대해 긍정적으로 염색 (B) 세포는 생존 세포를 분리 제외됩니다. (C) HLAI 음성 게이트 제어 isotypic IgG의 1 κ-FITC와의 IgG 2A κ-PE 항체로 염색 된 세포를 기반으로 작성됩니다. HLAI ...

직접 인체 조직에서 암 줄기 세포 (암줄 기세포)의 분리는 생물학적 특성 분석을위한 필수입니다. 또한 어려운 단계를 문제 해결에 대한 팁을 제공하면서이 원고는, 인간의 조직에서 전립선 암줄 기세포의 분리를위한 방법을 설명합니다.

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

이 절차의 전체적인 목적은 FACS를 통해 인간 조직으로부터 전립선암 줄기세포를 분리하는 방법을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 수술 표본에서 채취한 전립선암 조직을 처리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 조직 절편으로부터 세포 현탁액을 생성하고, 세포를 형광 항체로 표지합니다.마지막 단계에서 전립선암 줄기세포를 FACS로 분리합니다. 최종적으로, 분리된 세포의 분자적 및 기능적 특성은 제노이식(xenotransplantation)과 유전자 발현 프로파일링을 통해 규명될 수 있습니다. 이 방법은 인간 샘플에서 유래한 암 줄기세포의 분자적 및 기능적 특성 규명을 용이하게 함으로써 전립선암 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.시연은 MD PhD 과정생인 Samuel Vidal, 석사 과정생인 Aiden Quinn, 그리고 jania가 진행하겠습니다. 저희 연구실의 A 연구진과 함께 진행합니다. 우선 임상 진단에 필요하지 않은 암 샘플의 과잉 벌크 조직을 15 mL의 배지가 들어 있는 50 mL 원추형 튜브에 수집하는 것으로 시작합니다. 해당 튜브를 즉시 4 °C에 보관하여 절제 후 24시간 이내에 처리하며, 이후 멸균 메스와 핀셋을 사용하여 생물안전작업대 내에서 작업을 수행합니다.암 조직 샘플 내의 거시적 종양 결절로부터 2~4mm 두께의 수평 조직 절편을 얻습니다. 이 절편들을 배지가 담긴 새로운 50mL 튜브에 넣습니다. 그 다음, 일부를 분리하여 10% formalin으로 고정함으로써 조직학적 분석을 통해 전립선암 조직의 존재를 확인하고, 종양 조직으로부터 세포 현탁액을 생성합니다.다음으로, 2~4 mm 크기의 조직 절편들을 각각 1 mL의 멸균 PBS가 담긴 60 x 15 mm 배양 접시에 옮깁니다. 멸균 메스와 포셉을 사용하여 샘플을 기계적으로 마쇄하고, 생성된 세포 현탁액을 하나의 멸균 50 mL 원심관에 모읍니다. 샘플 접시에 PBS 1 mL를 추가로 넣어 조직 절편이 완전히 해리될 때까지 이 과정을 3~4회 더 반복합니다. 그런 다음 5 mL 피펫을 사용하여 세포 용액을 혼합합니다.세포 용액을 최대 속도로 1분 동안 볼텍싱한 다음, 결과물인 세포 슬러리를 35 µm 세포 스트레이너를 통해 두 번째 멸균 50 mL 원추형 튜브에 여과합니다. 여과된 세포를 상온에서 450 ×g로 10분 동안 원심 분리합니다. 그 다음 펠릿을 5 mL의 적혈구 용해 버퍼에 재부유시킵니다.5분 후,

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연구

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의학

암 줄기 세포 (CSCs)이 malignancies의 숫자에서 확인되었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 인간의 췌장 선암의 xenografts에서 CSCs을 분리하는 알데히드 탈수소 효소의 활동과 CD44과 CD24 표현을 활용 흐름 cytometric 방법을 설명합니다. 이 가능한 전지는 다음 기능 분석 연구에 사용할 수 있습니다.

인간 췌장암의 Xenografts에서 줄기 세포의 분리

이 보고서에서는 종양에 침투 leukocytes의 고도 정화 인구를 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 복잡한 종양 조직에서 세포를 분리에 대한 수율과 순도를 향상시키기 위해 Miltenyi 생명 공학 프로토콜에서 적응하고 있습니다.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

이 기사에서는 인간 췌관 선암종(PDAC) 조직에서 췌장암 줄기세포(CSC)를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 이러한 CSC는 보다 효율적인 암 치료법을 개발하기 위해 CSC의 체외 자가 재생 능력에 대한 약물 치료의 기능적 효과를 연구하는 데 사용됩니다.

PDAC 줄기세포 분리: 췌장 종양에서 암 줄기세포를 분리하는 방법

췌장암 줄기세포(CSC)는 CSC 생물학을 연구하기 위한 강력한 도구이며 새로운 CSC 표적 치료법을 개발하기 위한 첫 번째 단계 역할을 할 수 있는 앵커리지 독립 구 배양 기술을 사용하여 체외에서 확장할 수 있습니다. 여기에서는 췌장 CSC의 확장, 분석 및 표적화를 위한 방법론이 제공됩니다.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

이 원고는 순환 종양 세포(CTC)에서 전립선암 환자 유래 이종이식편(PDX)을 생성하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. CTC에서 PDX 모델을 생성하면 전립선암을 연구하기 위한 대체 실험 모델을 제공합니다. 가장 흔하게 진단되는 종양이며 남성의 암으로 인한 사망 원인이 빈번합니다.

전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

뼈 육종 암 줄기 세포의 존재 (CSC 추가)는 최근에 발병에 연결되어있다. 이 글에서, 우리는 비 접착 조건에서 성장하는 암줄 기세포의 능력을 사용하여 기존의 골육종 (OS)의 인간 생체 검사에서 얻은 기본 세포 배양에서 암줄 기세포의 분리를 제시한다.

암의 설립은 인간 기존의 골육종에서 세포 배양 줄기

종양 재발과 치료에 대한 내성에서 암 줄기 세포의 역할을 이해하는 것은 지난 10년 동안 큰 관심사가 되었습니다. 이 논문은 두경부 편평 암종 세포주(HNSCC)에서 암 줄기 유사 세포의 하위 집단의 분리 및 특성화에 대해 설명합니다.

머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

이 방법론의 목적은 유세포분석및 서양세포분석과 서양계의 기능성 분석및 현상형 특성화를 사용하여, 구형 프로토콜을 사용하여 암 세포주 및 원발성 인간 종양 샘플에서 암 줄기세포(CSC)를 식별하는 것입니다. 얼룩.

부인과 및 유방암 종양에서 암 줄기 세포 구체 획득

인간의 1차 전립선 상피 세포를 사용하여, 우리는 스페로이드 기반 의 라벨 보유 분석법에 의해 줄기 유사 세포의 기능적 특성화의 새로운 바이오마커 없는 방법을 보고합니다. BrdU, CFSE, 또는 파 레드 2D 셀 라벨링에 대해 단계별 프로토콜이 기재되어; 3 차원 스페로이드 형성; 면역 세포 화학에 의한 라벨-유지 줄기 유사 세포 식별; 및 FACS에 의해 격리.

3차원 스페로이드 배양에서 줄기와 같은 세포의 분리

이 실험 프로토콜은 BCSC 표현형 및 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 시험 관 내 및 생체 내 분석뿐만 아니라 유방암 세포 및 조직 샘플에서 BCSC의 분리를 설명합니다.

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

이 프로토콜은 근치적 전립선 절제술에서 섬유아세포를 분리, 확장 및 불멸화하기 위한 포괄적인 절차를 제공합니다. 또한, 섬유아세포-종양 세포 누화의 기능적 효과를 평가하기 위해 개발된 분석법을 설명하며, 조건화된 배지를 사용한 치료와 공동 배양을 모두 활용합니다.

전립선암 관련 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

학습하세요 인간 전립선암 조직에서 암 줄기 세포를 분리하는 방법을. FACS를 이용한 형광 항체 라벨링과 세포 분류 기술로 암 줄기 세포의 분자적 특성을 연구할 수 있습니다.

인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

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