Summary
Overview
Les poussins (Gallus gallus domesticus) sont un outil précieux de recherche, non seulement pour l'étude des concepts importants dans le développement des vertébrés, les neurosciences et la biologie du cancer, mais aussi comme un système efficace dans lequel les virus se propagent. Bien que les œufs puissent être achetés auprès de fournisseurs externes et que le travail avec les poussins nécessite très peu de matériel spécialisé, une compréhension des procédures de manipulation appropriées est nécessaire pour le développement normal de l'embryon.
Cette vidéo donne un aperçu des principes de manipulation des œufs, y compris une explication des paramètres d'incubation qui peuvent profondément influencer le développement: la température, l'humidité, et la rotation de l'œuf. La plupart des expériences qui utilisent des œufs de poulet doivent avoir accès à l'embryon à l’intérieur de la coquille, ce qui est réalisé en découpant un petit trou refermable, ou "fenêtre". Ce processus est décrit en détail, étape par étape, ainsi que plusieurs autres techniques essentielles pour travailler avec des poussins, telles que le mirage et l’injection d'encre de Chine. Enfin, la vidéo passe en revue quelques utilisations pratiques de ces techniques de base pour la recherche scientifique de pointe.
Procedure
Les embryons de poulet sont un excellent modèle pour l'étude du développement embryonnaire des vertébrés, en partie parce qu'ils sont faciles et peu coûteux à entretenir. Contrairement à la plupart des organismes modèles, qui sont élevés en laboratoire, les œufs de poule fécondés sont achetés auprès d'un fournisseur externe. En outre, maintenir et travailler avec des œufs nécessite très peu de matériel spécialisé. Cette vidéo fournit une information générale sur l'acquisition et l'entretien d’œufs de poule, les techniques essentielles pour travailler avec des embryons en développement, et quelques applications pratiques de ces méthodes.
Avant de discuter du travail avec les poussins au laboratoire, revoyons comment les poules prennent soin de leurs œufs au poulailler. Bien que les œufs soient déjà fécondés quand ils sont pondus, le développement du poussin s'arrête lorsque les œufs sont exposés à des températures extérieures plus froides. Après la ponte d'environ 12 œufs, la poule s’assied sur le nid pour permettre au développement embryonnaire de reprendre. Au cours de leur incubation, la poule tourne les œufs pour les réchauffer uniformément et empêcher l'embryon de se coller à la coquille. Si tout va bien, 21 jours plus tard, maman aura une couvée de poussins.
Alors, comment les scientifiques recueillent-ils suffisamment d'œufs pour leurs expériences? Euh... cela pourrait prendre un certain temps. Cependant vu que les poulets sont largement domestiqués, les œufs fécondés peuvent être facilement obtenus à partir d'une écloserie ou d’un élevage. Les œufs peuvent même être commandés à des stades de développement spécifiques.
Une fois que les œufs arrivent au laboratoire, ils peuvent être entreposés entre 13 et 16 °C jusqu’à 5 jours. Lorsque vous êtes prêt pour que le développement commence, laissez les œufs se réchauffer à température ambiante, puis transférez les dans un incubateur à bascule à 37 °C avec 60% d'humidité jusqu'à ce qu'ils aient atteint le stade désiré.
La plupart des expériences effectuées sur des poussins nécessitent quelques étapes préparatoires, comme vérifier dès le début si les œufs que vous avez reçus ont été fécondés. Une approche simple consiste à utiliser une source de lumière ou un mire-œuf pour éclairer l'œuf. En utilisant cette technique, qui se dit mirer, les structures internes telles que les vaisseaux sanguins peuvent être visualisées afin de confirmer qu’un embryon est présent.
Laisser la coquille intacte améliore la survie du poussin, mais elle empêche l'accès à l'embryon. Pour résoudre ce problème, les chercheurs utilisent une technique appelée fenêtrage.
Commencez par poser les œufs sur leur côté et marquez le côté où l'embryon se développera. Pour éviter d'endommager le jaune lors de la découpe d'une fenêtre, une petite quantité d'albumine, ou blanc d'œuf, est enlevée pour éloigner l'embryon de la coquille. Pour ce faire, stérilisez d'abord la coquille en l'essuyant avec 70% d'éthanol. Une fois que la coquille a séché, apposez un morceau de ruban adhésif sur le bout de l'œuf. Ensuite, utilisez une aiguille stérile pour percer la bande de ruban et la coquille. Insérez l'aiguille vers le bas pour éviter d'endommager le jaune et retirez 5 ml d'albumine. Enfin, pour éviter les fuites d'albumine, scellez le trou avec un autre morceau de ruban adhésif.
Pour découper la coquille, placez un morceau de ruban adhésif sur la zone où vous envisagez de faire une fenêtre. En utilisant une paire de ciseaux, faites un petit trou dans la coque et commencez à découper une ouverture circulaire. Au cours de ce processus, la bande empêche la chute de fragments de coquille sur l'embryon.
Même après le fenêtrage, des embryons au stade précoce peuvent être difficiles à visualiser en raison de leur petite taille et de leur transparence. Pour améliorer le contraste entre l'embryon et le jaune d'œuf, de l’encre de Chine non-toxique diluée peut être utilisée. L'encre est injectée dans le jaune d'œuf sous l'embryon et se diffuse. L'embryon peut maintenant être visualisé sur le fond sombre grâce au contraste plus élevé. Après les manipulations expérimentales, la fenêtre doit être refermée avec du ruban adhésif et l'œuf replacé dans l'incubateur.
Maintenant que vous êtes familier avec les techniques de base pour travailler avec des œufs, nous allons voir comment ces méthodes sont utilisées pour mener des expériences sur des embryons de poulet.
Pour commencer, le mirage peut être utilisé pour identifier l'emplacement des structures embryonnaires dans des œufs intacts. Par exemple, les membranes externes de l'embryon de poulet sont couramment utilisées pour la propagation de virus. Pour infecter la membrane, le mirage est effectué pour localiser l'interface entre la cavité allantoïdienne et le sac d’air, afin d'injecter les virus directement dans la cavité allantoïdienne sans endommager l'embryon. Après quelques jours d'incubation, de grands nombres de particules virales peuvent être récoltées à partir du liquide allantoïdien.
Le fenêtrage d'œuf est une pratique extrêmement utile car il permet d'accéder à l'embryon pour l'expérimentation. De nombreuses expériences commencent avec l’administration d'ADN dans des tissus spécifiques par micro-injection. Les électrodes sont ensuite placées autour du tissu d'intérêt et un champ électrique est appliqué temporairement pour perméabiliser la membrane cellulaire et amener les acides nucléiques dans les cellules.
Lors de la réalisation d'expériences sur les embryons précoces, l’injection d’encre de Chine est particulièrement utile pour visualiser les tissus transparents. Ici, l’amélioration du contraste permet aux chercheurs de micro-injecter une solution d'ADN dans des régions de tissu spécifiques. En fin de compte, cette technique peut produire des cellules marquées individuellement, qui peuvent être suivies dans le temps pour suivre les divisions cellulaires.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l'entretien du poussin. Cette présentation couvre la manipulation et la maintenance de base des œufs de poulet, les techniques communes pour travailler avec des poussins et des exemples de comment ces méthodes sont appliquées en recherche biologique. Merci de nous avoir regardé!
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