Name: 삼투 물 투수 계수 (P 측정 F) 구형 세포 : 예를 들어 식물 절연 원형질체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: 배우세요 식물 원형질체에서 삼투 물 투수 계수(Pf)를 측정하는 방법으로 수송체 기능을 연구합니다. 이 기법은 세포막 수분 조절 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 연구 (FNRS) C 과학적위한 벨기에 기금 보조금, 이스라엘 과학 재단 예루살렘 FC에 Interuniversity 명소 폴란드 프로그램 - 벨기에 과학 정책 및 &quot;Recherches Concertées 드 Communauté 프랑세즈 드 Belgique - 작업&quot;(에 의해 지원되었다 MM (부여 # 12분의 1,311)에 ISF) 및 NM (부여 # 12분의 1,312)이다.

솔루션의 1 준비 <ol><li> 준비 등장 (600 mOsm) 및 저장성 10 밀리미터의 KCl, 1 mM의 염화칼슘 등을 포함 (500 mOsm) 솔루션 8 M 2 - (N-모르 폴린) -ethanesulphonic 산 (MES), 산도 5.7의 적절한 양의 삼투압을 조절 D-소르비톨 : 등장과 저장성 용액 440 밀리미터 540 밀리미터. osmometer 사용 (목표 값의 3 % 이내) 용액의 삼투압을 확인한다. </li><li> 다음 효소를 포함하는 &#39;효소 믹스&#39;의 건조 재고 준비 : 0.55 g의 셀룰라아제, 0.1 g의 pectolyase, 0.33 g 폴리 비닐 피 롤리 돈 K 30, 0.33 g의 BSA (아래의 표 참조 1) 소용돌이에 의해 건조 분말을 혼합, 5.7 mg을 분취을하고 -20 ° C에 저장합니다. </li></ol> 애기 장대 엽육 원형질체의 2 절연 <ol><li> 약 6 방울과 페트리 접시 (10cm)를 준비 (약합니다. 30 μL 각) 등장 성 용액을. </li><li> 껍질 배축 (하단) 애기 장대 잎의 표피, C다음 솔루션을 만지고 아래로 노출 된 배축면 삭제 등장 솔루션에 사각형을 배치, 약 4 × 4mm 2의 제곱으로 벗겨 잎 유타. </li><li> , 165 μL에 1.5 ㎖의 튜브에 등장액 (/ w w 3.3 %)의 효소 믹스 14.4 mg을 녹이고 용해까지 분간 정도 피펫 팅하여 부드럽게 섞어 같은 배양에서의 효소 용액의 몇몇 유사한 방울을 배치 요리. </li><li> , 28 ° C로 설정 수욕에서 접시를 떠, 파라 필름의 한 라운드로 뚜껑을 밀봉 접시를 닫고 20 분 동안 품어 방울 효소 용액에 잎 조각을 전송합니다. </li><li> 접시에 등장 솔루션보다 몇 방울 (각 효소 용액 드롭 당 2 방울)를 추가합니다. 새로운 등장 솔루션 강하 각 잎 조각을 전송 한 후, 순차적으로, 두 번째 드롭에 (멀리 효소 솔루션을 씻어). , 집게를 사용하여 가장자리로 조각을 들어 올려는 원형질체를 분리합니다 (티백 등) 두 번째 드롭에 흔들.1.5 ML 튜브로 (잘립니다 100 μL 피펫 팁 사용) 원형질체와 방울을 수집합니다. </li></ol> (3) 저장성 도전 분석 : 애기 장대 엽육 세포 붓기 <ol><li> 저장성 용액으로 등장 성 용액 및 다른 열 하나의 열을 작성하여 관류 시스템 (그림 1A)를 준비합니다. 아래쪽 입구 매니 폴드 (도 1b)에 튜브 끝까지 채워 용액 일부 유량 (제 저장성 후 등장 성), 밸브를 개방하자. 더 갇혀있는 기포가 없는지 확인하고 밸브를 닫습니다. </li><li> (, 또한도 1c의 챔버의 개략도를도 1b 참조) 내에서 슬라이드 플렉시 글라스 챔버 용 바닥을 만들기 위해, 실리콘 그리스 (표 1)를 이용하여, 커버 슬립을 봉쇄. 원형질체, 코트 &quot;끈&quot;(그리스 링 내에서 커버 슬립의 위쪽을 향 노출 된 표면을) 챔버 바닥을 만들려면 그또는 폴리-L-라이신 (물 중 0.1 % 표 1) 양의 차지 베어링 프로타민 설페이트 (표 1 물을 1 %)와. 2 분 린스 - 3 - 1 대기, 피펫 팁을 사용하여 커버 슬립을 통해이 &#39;접착제&#39;를 확산 4 회 등장 성 용액으로하고, 나머지 솔루션을 멀리 흔들. </li><li> 등장 성 용액으로 챔버까지 채 웁니다. 이어서, 잘려 피펫 팁을 사용하여, 챔버 함유 용액 원형질체의 방울을 추가하고 3 기다려 - 원형질체가 정착하기위한 4 분. 투명 커버 (그림 1D, 1E)와 챔버 (아래에 공기 방울을 트래핑 방지) 솔루션 표면을 만져을 커버. </li><li> (빠른 속도를 거꾸로 현미경 테이블에 (! 부드럽게) 슬라이드를 놓고 관류 시스템 (튜브!에 공기 방울을 차단할) 펌프에 연결 / 분 1 ML에서 일정 관류의 등장 솔루션 흐름을 켭니다 4 ml / 분)까지 이용 될 수있다. </li><li> 기록을 위해부피 변화는 반전 20X 현미경 대물 렌즈와 PC 컴퓨터에 연결된 CCD 비디오 카메라와 함께 사용된다. 선택한 부동의 원형질체의 60 초 비디오 동영상을 기록 할 수 ImageJ에 소프트웨어의 &#39;CMU 1394 카메라 드라이버&#39;플러그인 (이 두 소프트웨어 조각의 다운로드 주소를 특정 재료의 표 참조)을 사용하여 (아마도 바닥에 붙어있는) 한 이미지 / 초 (1 Hz에서)의 속도로. 등장 성 용액의 15 초 워시 기록 (이 기준을 구성한다)를 시작, 45 초간 저장성 용액으로 전환 (재관류의 개시부터 총 60 초를 완​​료). TIF 형식으로 동영상을 저장합니다. 참고 : 최대 규모의 경계 (그림 2A)에서 모양과 잘 집중 셀 형상 구형 : 다음 기준을 충족 가능한 한 많은 세포로보기 필드를 선택합니다. </li></ol> ImageJ에 사용 셀 볼륨 변경의 4 분석 참고 :를 분석하기 위해팽윤 셀의 이미지의 시리즈는 &#39;이미지 탐색기&#39;를 열고 (자이 Draye가 작성) ImageJ에 소프트웨어 14 &#39;원형질체 분석기&#39;플러그인을 사용합니다. 첫 시점에서 선택 원형질체부터 &#39;원형질체 분석기&#39;플러그인 자동 원형질체 엣지 (윤곽)을 감지하고 (플러그인 아래 PfFit 분석 프로그램과 함께 사용할 수있는) 실험 기간 동안 자신의 지역 시간 코스를 계산할 . <ol><li> ImageJ에를 시작합니다. 그들이 전개로 영화를 열려면 드롭 다운 메뉴에 연속적으로 다음, ImageJ에 패널에 &#39;파일을&#39;클릭 &#39;가져 오기&#39;다음 &#39;이미지 탐색기&#39;. 선택한 동영상을 강조 표시하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 한 다음 &#39;원형질체 분석기&#39;를 클릭 왼쪽. 실험 기간 동안 크게 움직이지 남아 원형질체를 식별하기 위해 (원형질체 이미지 하단의 슬라이더를 사용하여) 동영상을 검색 - 이러한 분석됩니다. 위로 첫번째 IMA에GE는 마우스를 사용하여, 다음 등장 생 매개 변수 &#39;의 표에&#39;OK &#39;를 클릭 선택 원형질체 (그림 2B) 주위에 (ImageJ에 그리기 도구에서 선택) 원을 그립니다. </li><li> 원형질체 검출 알고리즘을 실행하려면, 드롭 다운 메뉴에서 다음, 원형질체 이미지 상단 패널 &#39;프로세스&#39;를 &#39;지역&#39;을 클릭합니다. 영화 전반에 걸쳐 선택한 원형질체 (그림 2C)의 주위에 녹색 동그라미를 검사합니다. 엑셀 파일의 &#39;결과&#39;를 저장합니다. ImageJ에를 종료합니다. 참고 : 빨간 점이 나타납니다 경우 (나쁜 윤곽에 맞게 표시하기 - 일반적으로 인해 가난한 이미지 대비로)를 다른 매개 변수로 다시 실행. </li><li> 각 셀에 속하는 라인 분리하는 (- 두 개 이상의 셀이 동시에 분석 된 경우 - 분석은 프레임 단위로 수행되므로, 좌우 될 것이다), 엑셀, 셀 번호 열 ( &#39;오브젝트&#39;에 의해 저장된 데이터를 정렬 ). </li><li> dete하려면, P (F)의 실제 값을 획득하기위한 화소 간 μm의 변환율을 rmine 동일 20X 현미경 대물 렌즈를 통해 마이크로 미터 눈금자 이미지 스냅. 통치자의 이미지를 따라 (ImageJ에 그리기 도구에서 선택)은 줄을 드래그하여 ImageJ에 메인 패널의 맨 아래에있는 자 길이 화소 수에 상응를 참조하십시오. 2 μM로 엑셀 파일의 임의의 화소 영역 값을 변환한다. 텍스트 파일로 (각 셀 별도로) (두 개의 숫자 열 만) 지역 시간 코스를 저장합니다. 참고 :이 볼륨 맞는 &#39;PfFit&#39;프로그램에 입력됩니다. </li></ol> 5 ImageJ에와 matlab에 프로그램 P f를 맞추기를 사용하여 실험 상공 회의소에서 삼투압 변화의 속도를 모델링 <ol><li> 등장 성 용액 ( &#39;표시 염료&#39;를 생산하는) 100 ㎖에 2 mg을 크실렌 cyanol (표 1, 아래)를 추가합니다. </li><li> 표시 염료과 비 염색 시간과 (3.1)를 관류 시스템을 준비합니다ypotonic 솔루션입니다. </li><li> 커버 슬립 (전 원형질체와 같이)로 커버하고 현미경 스테이지에 배치하고 부드럽게 표시 염료와 챔버를 작성하여 플렉시 글라스 챔버의 바닥에 실리콘 그리스를 사용하여 커버 슬립을 밀봉합니다. </li><li> 관류 시스템과 펌프에 실을 연결하고 리터의 ml / 분에서 일정한 관류에 대한 표시 염료 흐름을 켭니다. </li><li> 1 Hz에서의 속도로 60 초 동영상을 기록합니다. 표시 염료의 15 초에 녹음을 시작, 45 초 동안 저장성 용액으로 전환합니다. 촬영을 중지합니다. 표시 염료 (최소 30 초)을 세척, 새로운 영화를 시작합니다. 6 회 모든 동영상을 저장 - 5를 반복 </li><li> 변화 투과율의 평균 시간을 구하는 과정 지표 염료 투과율의 비디오 이미지를 분석하는 소프트웨어를 ImageJ에 사용한다. <ol><li> ImageJ에 시작, &#39;파일&#39;, 다음 &#39;열기&#39;를 클릭하고, 동영상을 검색해보세요. 각 영화의 경우, 10 픽셀 폭 넓은 수직 그릴영화의 1 차 이미지의 아무 곳이나 사각형입니다. 다음 드롭 다운 메뉴에서 &#39;잘라 내기&#39;를 클릭, ImageJ에 메인 패널에 &#39;이미지&#39;를 클릭합니다. </li><li> &#39;몽타주 만들기&#39;를 &#39;스택&#39;와 (열 60 행 일) : 그들은 전개로 다시 &#39;이미지&#39;를 클릭, 한 행에 (60 초 동영상) 60 프레임을 정렬하려면, 다음 드롭 다운 메뉴에서 연속적으로 클릭합니다. 어디서나 이미지의 전체 행을 따라 한 픽셀 높은 수평 사각형을 그리고 ImageJ에 메인 패널에서 &#39;분석&#39;을 클릭 한 다음 드롭 다운 메뉴에서 &#39;플롯 프로필&#39;을 클릭합니다. NOTE : (도시 생략) 나타난다 창 A &#39;몽타주 플롯&#39;및 투과율 데이터의 목록은 메뉴에서 개방 될 수있다. 영화의 각각의 이미지가 자사의 10 픽셀 폭 넓은 사각형 결과적으로 &quot;타임베이스&quot;에서 발생하는 열 투과율 값을 기준으로이 목록에 표시됩니다 (이미지 일련 번호)는 10 배 이상이다. </li><li> 투과율 DAT의 목록을 복사Excel 파일에 (영화 당 하나의 목록). 표시 염료 홍조의 여러 영화에서 얻은 투과율 시간 코스 평균값. 0.1 이미지 일련 번호를 곱하여 실시간베이스를 생성합니다. 텍스트 파일에 평균화 시간 코스 (두 열)을 저장한다. NOTE : 평균화하기 전에, 필요한 경우, 임의의 요철을 거부, 개별 시간 과정을 플롯. 동영상이 표시 염료의 정상 상태 투과율의 적어도 5 초 최종 포함되어 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 삼투압 시간 코스의 다양한 매개 변수를 계산하기 위해 matlab에 피팅 프로그램 P f를 맞춤 ( &#39;표시 맞추기&#39;패널, 그림 3)를 시작합니다. NOTE : 욕 용액의 공지 된 초기 및 최종 농도에 기초하여, 상기 용액의 변화 삼투압 농도의 타임 코스를 가정하면, (인디케이터 염료 투과율부터 차례로 계산) 농도의 시간 경과로부터 계산된다 같은 역학을 따른다염료 농도. P F 맞춤 무료로 사용할 수있는 프로그램입니다. P f를 맞춤 프로그램을 사용자에게 익숙하게하는 데 도움이 보충 파일로 정돈를 통해 액세스에 대한 자세한 설명과 정의와 P f를 맞춤 사용 설명서 &#39;:&#39;PfFit_Installer_web.exe은 &#39;에서 다운로드 할 수 있습니다. </li><li> &#39;표시 맞추기&#39;패널에서 표시 염료 투과율 ( &#39;표시 데이터 파일&#39;도 3A)의 평균 시간 코스의 데이터를 가져 수동으로 현재 실험 매개 변수와 매개 변수 &#39;폭&#39;과 &#39;의 초기 추측을 삽입 t_half 표시 염료 농도의 시간 과정의 플롯 (실제 데이터와 맞는 그림 4A)를 볼 실행 &#39;&#39;표시 염료 농도 (그림 3B의 시간 과정을 설명. 클릭 &#39;, 그리고 모델 (계산) 목욕 삼투압 (그림 4B) 참고 :. AG데이터 OOD 착용감이 필수적이다 (추천 :도 3에 도시 된 숫자로 시작). </li></ol> 6 matlab에 피팅 프로그램 P f를 맞추기를 사용하여 P f를 결정 주 : 사실과 완벽 osmometer 11 같은 원형질체의 동작에 관한 기본적인 가정 사항에 더하여, P (F)의 판정이 P의 f는 P (F)의이 역학 시간을 기초 것을 시간에 따라 변경 될 수 있다는 가정에 달려 세포 부피 변화의 과정과 그 세 파라미터를 설명하는 데 충분하다 : P 좋 (P (F)의 초기치), 경사 PF (P (F)의 선형의 변화율)과 지연 (욕의 개시로부터 기간 세포 부피 변화의 시작까지 삼투압 변화). 다른 모델은 null 값 (11)을 포함하여 다른 이들 매개 변수의 조합 및 해당 값을 포함하여, 테스트 할 수 있습니다. P <suB&gt; 맞추기 수득 이러한 파라미터의 최적의 조합을 검색 f를 - 계산에 의해 - 셀 부피 변화 (11), 계산의 실험 시간 코스의 가장 충실하게 재현, 차례로, 셀 형상 영역의 임포트 시리즈에서 (참고 또한 보충 &#39;P f를 맞춤 사용 설명서&#39;). <ol><li> &#39;볼륨 맞추기&#39;패널 (그림 5)로 전환합니다. 임포트 영역 데이터 파일 (분석 원형질체,도 5a의 &#39;영역&#39;의 시간 경과와 함께 텍스트 파일)을 선택한다. 매개 변수 소스로 &#39;마지막 표시 피팅&#39;을 선택합니다 (그림 5B, 대안은 &#39;P f를 맞춤 사용 설명서&#39;를 참조). 참고 :이 매개 변수 (그림 5D)는 다음 절차를 피팅 된 볼륨에 대한 욕 농도의 삼투압 변화를 다시 생성하는 데 사용됩니다. </li><li> &#39;볼륨 맞추기&#39;패널 (그림 5C)에서 초기화 (에 대한 초기 추측) P의 F 매개 변수를 입력 : P의 F, 경사 PF 및 지연 (추천 : 모델 &#39;클래스&#39;를 선택했다 각각 1, 1, 30,)로 시작 (추천 : II와 마르크로 시작 세 가지 매개 변수에 대한 &#39;검사&#39;)가 장착된다. 다음 중간 그림 (그림 5E)를 안구하고 필요한 경우 지연 매개 변수와 레코드의 길이를 조절, &#39;실행&#39;을 클릭합니다. </li><li> 맞는 품질을 평가하고 적합 오류를 기록하는 결과 그래프 (그림 6)를 검사합니다. 약간의 각을 접어 초기화 매개 변수를 변경하고 &#39;- &#39;Run를 다시. 참고 : 프로그램이 걸리면 때 낙심하지 마십시오 - 그냥 프로그램을 다시 시작! </li><li> 맞는 오류의 가장 낮은 값을 목표로, 초기화 매개 변수의 서로 다른 조합을 시작으로이 절차를 여러 번 반복합니다. </li><li> 화면에서 직접 맞는 결과 목록을 복사 또는 t에서 찾을그는 &#39;_FIT_Vol_Results.txt&#39;파일을 생성 PfFit. </li></ol>

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</ol>

우리는 공개할 것이 없습니다.

여기서 설명하는 다른 세포에 구면도 원칙적으로 적용 절연 식물 원형질체의 P f를, 예를 들면., 개구리 난 모세포 (11)를 측정하기위한 간단하고 매우 효율적인 절차이다. 이 방법은 세포에 침투 챌린지에 응답하여 상기 P F의 측정에 기초한다. 이러한 접근 방식에 기초하여 상기 다른 방법과는 대조적으로, 그러나, 삼투압의 해법의 변화, 즉, 기저 세포 부피가되는 등장 성 용액으로부터 일정한 목욕 재관류 동안, 순간이지만 점진적 아니다 설립. 또한,이 방법은 흡인 피펫을 수반하므로 원형질체에 대한 외란을 최소화하지 않는다. 여기에 제시된 방법은 다른 식물이나 조직으로부터 원형질체의 다양한에서 측정을 할 수 있습니다. 그러나 때문에 관련된 계산 만 구면 세포를 분석 할 수있다. 번째의 또한, 효소 격리전자 원형질체 및 용액의 삼투압은 (예를 들어, 토마토 엽육 원형질체의 효소 적 분리는 ...

세포막에 걸쳐 물 흡수와 흐름은 셀룰러 및 전체 공장 수준 모두에서 식물의 존재에 대한 기본적인 요구 사항입니다. 세포 수준에서, 아쿠아 포린 (AQPs)는 세포막 1-3의 삼투 투수 계수 (P의 F)의 조절에 중요한 역할을한다. 지금까지 여러 가지 방법으로 다른 식물 기관에서 원형질체의 내생 P f를 측정에 사용되어왔다 (즉 뿌리, 엽육, endodermis 등., 쇼몽 등. 4 검토). P f를 측정하는 방법 중 하나는 삼투 도전 원형질체을 노출하고 그 부피 변화의 초기 속도를 모니터링 할 수있다 (예., 체적 변화의 초기 선형 단계의 기울기). 두 가지 방법은 이전에 용액의 순간 과거에이 방법에 기초하여 설명 모두 기초 하였다. 첫 번째는 immobiliz 구성마이크로 피펫으로 흡입 원형질체를 보내고 용액 흐름 5 및 6 마이크로 피펫을 사용하여 다른 하나의 용액으로부터 원형질체를 전송하는 두 번째 스위칭. 빠른 용액 교환 매우 시작에서 화상 획득을 허용 한 마이크로 피펫 흡입 및 마이크로 피펫 전사 방법은, 가능성 원형질체에 대한 물리적 스트레스를 수반, (부피 변화의 초기 선형 위상을 포착하기 위해) 및 특수 장비 및 전문가 미세 조작을 필요로한다. 여기서 설명한 방법은 더 미세 조작을 수반하지 않고 목욕 관류 순시 없을 때 P (F)의 유도를 허용하는, 세포에 교란을 최소화한다. 효소 분해 한 후, 등장 성 용액에 잠긴 원형질체는, 전하의 상호 작용에 의해 coverslip에 유리 플렉시 글라스의 바닥 (일명 플라스틱 유리 또는 방풍) 챔버에 고정된다. 그리고, 일정 기간 동안 관류 목욕,등장 성 용액은 원형질체에 hypoosmotic 도전을 생성하는 저장성 용액에 의해 멀리 플러시됩니다. 원형질체의 팽윤 비디오 기록하고, 목욕 관류의 시간 과정 및 세포 종창의 시간 경과에 대한 정보를 조합하여, P의 F는 화상 처리 및 커브 피팅 절차에 의해 결정된다. 이 방법의 장점은, 실험이 매우 효율적임을 아르는 단일 분석에서 동시에 몇 개의 셀을 모니터하는 것이 가능하고, 특별한 장비 나 특별한 기술이 미세 조작을 필요로하지 않는다는 것을, 즉. 이 방법에 대한 몇 가지 응용이 가능하다. 예를 들면, 엽육 같은 다른 조직 및 식물의 세포의 다양한 네이티브 P (F)의 결정 및 아라비돕시스 잎 07 옥수수 잎 엽육 또는 루트 피질 세포 8-10 또는 현탁 배양 세포 (11, 12)에서 시쓰 세포 번들. additi에서에, 이러한 난자 전지 (11)로서 구형 동물 세포의 P의 F를 결정하는 것이 가능하다. P의 F 기여도의 판정과, 또 다른 예는 원형질체 (예 네이즈의 유전자 또는 다른 유전자에 영향을 미칠 수있는 그들)에서의 유전자의 일시적 발현으로 AQP 활성의 시험을 포함한다; 이 PEG 변환 및 결정 SlTIP2하여 애기 장대 엽육 ​​원형질체의, 예, 토마토 AQP SlTIP2의 표현 (13) f를 P를 2 관련. 마지막으로, (등 약물, 호르몬,) 다른 분자 / 물질 P의 F에 미치는 영향의 검토도 AQP 차단제 HgCl 2 (7)의 예를 들면, 검사 할 수있는 솔루션에 추가됩니다. 다음 프로토콜은 애기 장대 엽육 ​​세포와 그들의 P (F)의 결정의 원형질체의 분리에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>KCl</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247-1</td><td><a href="http://www.chemimpex.com/">http://www.chemimpex.com</a> 모든 출처, 항문 등급</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>11718006</td><td><a href="http://www.merck.com/">http://www.merck.com</a> 모든 출처, 항문 등급</td></tr><tr><td>2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)</td><td>시그마</td><td>15152002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com 모든 출처, 항문 등급</td></tr><tr><td>D-소르비톨</td><td>시그마</td><td>18032003</td><td>http://www.sigmaaldrich.com 모든 출처, 항문 등급</td></tr><tr><td>셀룰라아제</td><td>Worthington, Lakewood, NJ, USA</td><td>LS002603</td><td><a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com</a></td></tr><tr><td>Pectolyase</td><td>칼란,&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Phonix, AZ, 미국</td><td>8006</td><td><a href="http://www.karlan.com/">http://www.karlan.com</a></td></tr><tr><td>폴리비닐-피롤리돈 K 30 (PVP)</td><td>시그마</td><td>81420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td><a href="https://my.labguru.com/catalog/materials/216">소 혈청 알부민(BSA)</a></td><td>시그마</td><td>A9418-5G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http:// www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>프로타민 황산염</td><td>시그마</td><td>P4380</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>시그마</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>크실렌 시안올</td><td>시그마</td><td>X4126</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>실리콘 진공 그리스 헤비</td><td>머크</td><td>107921</td><td><a href="https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.? SecurePage=true& SEO_ErrorPageOccurred=true& attachments=CoA">https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.? SecurePage=true& SEO_ErrorPageOccurred=true& 첨부 파일=CoA</a></td></tr><tr><td>도립 현미경&nbsp;</td><td>니콘</td><td>이클립스 TS100/TS100F</td><td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>BIO-RAD</td><td>EP-1 Econo&nbsp; 펌프</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>그레이스케일 디지털 카메라</td><td>사이언 코퍼레이션</td><td>CFW-1308M</td><td><a href="http://www.scioncorp.com/">http://www.scioncorp.com</a></td></tr><tr><td>CMU 1394 카메라 드라이버' ImageJ</td><td>카네기 멜론</td><td></td><td>용 플러그인<a href="http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html">http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html</a> 무료 소프트웨어</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> 무료 소프트웨어</td></tr><tr><td>Econo Gradient Pump Fittings Kit</td><td>BIO-RAD</td><td>731-9006</td><td><a href="http:// www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>커넥터, 매니폴드</td><td>DirectMed</td><td></td><td><a href="http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html? ACTION=S">http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html? ACTION=S</a></td></tr><tr><td>뷰렛 주입 세트(열)</td><td>Welford</td><td>IF-BR-001</td><td>http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61</td></tr><tr><td>튜빙</td><td>TYGON</td><td>R-3603</td><td><a href="http://www.usplastic.com/">http://www.usplastic.com</a></td></tr><tr><td>3M 포장 스카치 테이프 1'', clear</td><td>Viking Industrial, UK</td><td>VKMONO25</td><td><a href="http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#. UuvqOftdy_8">http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#. UuvqOftdy_8</a> 투명 접착 테이프(셀로테이프 등)는 괜찮을 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

삼투 물 투수 계수 (p 측정<sub&gt; f</sub&gt;) 구형 세포 : 예를 들어 식물 절연 원형질체

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

AQP 규제 메커니즘을 공부하는 것은 세포 및 전체 공장 수준 모두에서 물 관계의 이해에 매우 중요합니다. 삼투 투수 계수 식물 원형질체에서 (P에 F), 예컨대 개구리 난 모세포와 같은 다른 세포 구형도 원칙의 적용을위한 판단이 매우 간단하고 효율적인 방법이 여기에서 제시 하였다. 분석의 첫 번째 단계는 적절한 등장 성 용액 챔버로 효소 분해에 의해 관심의 식물 조직으로부터 원형질체의 분리이다. 두 번째 단계는 삼투 도전 세이로 구성 챔버의 바닥면에 고정화 된 원형질체는 저장성 용액하여 등장액으로 일정한 관류 시작하고 그 다음에 제출된다. 세포 부종 비디오 기록이다. 세 번째 단계에서, 이미지는 부피 변화를 수득 오프라인 처리되어 부피 변화의 시간 코스는 osmola의 변화의 시간 경과와 상관챔버 관류 매체의 RITY, P의 F를 산출하기 위해, matlab에 ( &#39;PfFit&#39;)로 작성된 커브 피팅 절차를 사용하여.

다른 AQPs의 활성을 P의 F를 결정하고, 비교하기 위하여, 애기 장대 잎의 엽육 원형질체가 사용된다. 이 원형질체 낮은 기저 (배경)의 P F 레벨 7을 갖는 것으로하고, 재현성 P f를 측정 가능하도록 기능적 발현 시스템이 될 수있다. 육주 애기 공장에서 성숙한 잎에서 원형질체는 고립 된 세 유전자는 애기 장대에서 AQP 유전자를 구축 (AtPIP2 1)과 옥수수 (ZmPIP1 2 및 ZmPIP2 4) (개별적으로) 일시적했다 PEG 변환을 사용하여 표현 방법 15. 동기화에 대한 변화의 이벤트를보고 하나의 셀에 두 개의 플라스미드의 일시적 발현은 다른 식물 시스템에 이전에 100 % 성공률을 보였다 결과에 자신의 성질에 관계없이 셀에인가하고 기반 플라스미드 다수의 동시라고 가정15, 16는, 이들은 형질 전환 된 원형질체 <...

세포의 삼투 투수 계수 (P의 F)를 측정하는 것은 아쿠아 포린의 규제 메커니즘 (AQPs)를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 제시된 구면 식물 세포 원형질체에서 P F 형 결정은 원형질체 분리 욕조와 일정한 관류 동안 삼투 도전 결과로서 부피 변화의 초기 레이트의 수치 분석을 포함한다.

삼투 물 투수 계수 (P 측정<sub&gt; F</sub&gt;) 구형 세포 : 예를 들어 식물 절연 원형질체

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

다음 실험의 전반적인 목표는 식물 원형질체의 삼투압 투과성 계수(PF)를 결정하여 아쿠아포린의 기능에 대해 알아보는 것입니다. 축 방향 표피가 없는 잎에서 조각을 잘라내어 등장성 용액에 올려 놓습니다. 조각을 효소 용액에 옮기고 섭씨 28도에서 20분 동안 배양한 다음 새로운 등장성 용액으로 배양합니다.다음으로, 팁이 잘린 용액을 함유한 프로토플라스트를 수집합니다. 두 번째 단계로 실험실을 준비합니다. 실리콘 그리스를 사용하여 슬라이드 바닥에 커버 슬립을 부착합니다.그런 다음 챔버 바닥을 양전하를 띤 접착제로 코팅하고 챔버를 등장성 용액으로 채웁니다. 그런 다음 분리된 원형질체를 챔버에 추가하고 챔버를 현미경 스테이지에 섬세하게 배치합니다. 그 후, 원형질체는 저장성 용액에 노출되는 동안 부종 시간 경과를 포착하기 위해 비디오를 녹화합니다.다음으로, 팽윤 시간 경과를 cur fitting 절차를 포함한 소프트웨어에 의해 수치적으로 분석하고, 예를 들어, 다른 아쿠아포린 유전자의 발현에 의해 유도된 PF의 차이를 나타내는 수치 분석 결과를 기반으로 각 protoplast의 PF를 결정한다. 이 방법은 아쿠아포린의 기능 조절과 같은 세포막 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 토착 또는 유전자 변형 식물 수생 식물의 투과성, matic water에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.또한 ide에 노출된 관심 출처와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전에 필요한 등장성 및 고긴장 용액을 준비하고 삼투압을 확인하십시오. OSM oter를 사용하여 각 솔루션의 삼투압은 목표 값의 3% 이내여야 합니다.10cm 페트리 접시에 등장성 용액 약 6방울을 채웁니다. ABBA 바다표범을 벗기거나 토끼 잎 표피를 내리고 껍질을 벗긴 잎을 약 4 x 4mm의 정사각형으로 자릅니다. 등장성 용액 위에 작은 조각을 놓고 노출 된 축 방향 면이 아래를 향하게하고 용액에 닿도록 떨어 뜨립니다.다음으로, 1.5 밀리리터 튜브에 165 마이크로리터의 등장성 용액에 5.7 밀리그램의 효소 혼합물을 용해시키고 용해될 때까지 1분 정도 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 동일한 페트리 접시에 유사한 효소 용액을 여러 방울 떨어뜨립니다. 잎 조각을 효소 용액에 옮깁니다. 방울.접시를 닫고 퍼필 한 라운드로 뚜껑을 밀봉합니다. 섭씨 28도로 설정된 수조에 접시를 20분 동안 띄웁니다. 20분 후, 집게를 사용하여 접시에 등장성 용액을 몇 방울 더 떨어뜨립니다.각 잎 조각을 가장자리로 들어 올려 새로운 등장 용액 Drop으로 옮긴 다음 순차적으로 두 번째 방울로 옮깁니다. 두 번째 방울에서 잎 조각을 흔들어 100마이크로리터 피펫 팁을 잘라 원형체를 방출합니다. 프로토플라스트가 있는 방울을 1.5ml 튜브에 모읍니다.한 컬럼에 등장성 용액을 채우고 다른 컬럼에 저장성 용액을 채워 풍성 시스템을 준비합니다. 밸브를 열어 약간의 저장성 용액이 흐르도록 하여 튜브를 입구 매니폴드까지 채웁니다. 갇힌 기포가 없는지 확인한 후 밸브를 닫으십시오.등장성 용액에 대해 반복합니다. 실리콘 그리스를 사용하여 커버 슬립을 밀봉하여 플렉시 유리 슬라이드 내의 챔버 바닥을 만들고 챔버 바닥을 프로토플라스트에 대해 끈적하게 만들고 프로타민 설페이트 또는 폴리 L 라이신이 함유된 양전하로 코팅합니다. 피펫 팁을 사용하여 이 접착제를 커버 슬립에 펴 바릅니다.1-2분 정도 기다립니다. 등장성 용액으로 3-4회 헹구고 남은 용액을 털어냅니다. 등장성 용액으로 챔버를 채웁니다.그런 다음 잘라낸 피펫 팁을 사용하여 용액이 포함된 프로토플라스트 한 방울을 챔버에 추가합니다. 그리고 원형질체가 가라앉을 때까지 3-4분 정도 기다립니다. 용액 표면에 닿는 투명 덮개로 챔버를 덮습니다.아래에 기포가 갇히지 않도록 하십시오. 도립 현미경 테이블 위에 슬라이드를 부드럽게 놓고 관류 시스템과 튜브의 기포를 보호하는 펌프에 연결합니다. 분당 1밀리리터로 일정한 관류를 위해 등장성 용액 흐름을 켭니다.볼륨 변화를 기록하려면 가능한 한 많은 구형 셀이 있고 가장 큰 둘레에 초점이 잘 잡힌 셀 윤곽이 있는 보기 필드를 선택합니다. 선택된 움직이지 않는 원형질체의 62번째 비디오를 초당 1개 이미지 또는 1헤르츠의 속도로 녹화합니다. 등장계 용액을 15초 동안 세척하는 것으로 녹음을 시작하고 45초 동안 긴장성 용액으로 전환합니다.에서 Tiff 형식으로 동영상 저장팽창 세포의 일련의 이미지를 분석하려면 이미지 J 소프트웨어에서 이미지 탐색기 및 프로토플라스트 분석기 플러그인을 사용합니다. 이미지를 시작 J.To 동영상을 열고 이미지 J 패널에서 파일을 클릭한 다음 가져오기를 펼칠 때 드롭다운 메뉴를 연속적으로 클릭합니다. 그런 다음 이미지 탐색기.선택한 동영상을 강조 표시합니다. 그것을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 왼쪽. protoplasts 분석기를 클릭합니다.첫 번째 이미지에서 마우스를 사용하여 선택한 원형질체 주위에 원을 그립니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. protoplasts 감지 알고리즘을 시작하는 것으로 보이는 검출 매개변수 표에서 protoplasts 이미지의 상단 패널에 있는 local을 클릭합니다.그런 다음 처리합니다. 드롭다운 메뉴에서 동영상 전체에서 선택한 원형질체 주위의 녹색 원을 검사합니다. 하단 슬라이더를 사용하여 결과를 Excel 파일에 저장합니다.분석은 프레임 단위로 수행됩니다. 따라서 셀이 두 개 이상인 경우 Here의 각 셀에 속하는 선을 분리하기 위해 정렬이 필요합니다. 세 가지 시간 코스는 픽셀에서 제곱 마이크로미터로 변환된 면적 값으로 정렬하기 전과 후에 Excel 시트에 표시됩니다.그런 다음 각 시간 코스를 별도의 텍스트 파일로 내보냅니다. 이 절차를 시작하려면 챔버를 관류 시스템과 펌프에 연결하고 분당 1밀리리터의 일정한 관류 속도로 표시기 다이 흐름을 켜고 1헤르츠의 속도로 62번째 비디오를 녹화합니다. 15초 동안 표시기 다이로 녹음을 시작한 다음 하이퍼토닉 솔루션으로 전환하십시오.45초 동안 녹음을 중지합니다.표시기와 같은 높이입니다. 다시 30초 이상 죽습니다. 새로운 영화를 시작하기 전에 기록을 하고 영화를 분석하기 위해 5-6개의 영화를 저장하십시오.변화 인디케이터 다이 투과율의 평균 시간 경과를 얻으려면 이미지 J 클릭 파일을 시작하십시오. 그런 다음 영화를 열고 찾습니다. 각 동영상에 대해 동영상의 첫 번째 이미지 아무 곳에나 10픽셀 너비의 세로 사각형을 그리고 이미지 J 기본 패널에서 이미지를 클릭합니다.그런 다음 드롭다운 메뉴에서 자르기를 클릭합니다. 60개의 프레임을 한 행에 정렬하려면 이미지를 클릭한 다음 드롭다운 메뉴에서 스택을 펼치고 몽타주를 만들 때 연속적으로 클릭합니다. 이미지의 전체 행을 따라 아무 곳에나 1픽셀 높이의 수평 사각형을 그리고 Image J 기본 패널에서 분석을 클릭합니다.그런 다음 플롯 프로파일을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 투과율 데이터 목록을 Excel 파일에 복사합니다. 지표 다이 플러시의 Sero 영화에서 얻은 투과율 시간 코스의 평균을 구합니다.이미지 일련 번호에 0.1을 곱하여 실시간 베이스를 생성합니다. 평균 시간 코스를 텍스트 파일에 저장하여 삼투압 시간 코스의 다양한 매개변수를 계산합니다. 사용 가능한 MATLAB 피팅 프로그램 PF fit을 사용합니다.무료입니다. 이 프로그램의 다운로드 및 사용에 대한 자세한 내용은 프로토콜 텍스트에서 확인할 수 있습니다. 표시기 맞춤 패널에서.지표 염료 투과율의 평균 시간 경과 데이터를 가져옵니다. 현재 실험 매개 변수를 수동으로 입력하면 개미 H로 매개 변수의 초기 추측을 입력합니다.지표 염료 농도의 시간 경과를 설명하는 것도 변경 될 수 있습니다. 실행을 클릭하여 시간 경과, 지표, DAI 농도 및 모델링된 수조 삼투압의 플롯을 봅니다.물에 대한 좋은 적합은 물 투과 계수를 결정하는 데 필수적입니다. 볼륨 맞춤 패널로 전환합니다. 영역의 데이터 파일을 가져오려면 선택합니다.마지막 지표 피팅을 매개변수 소스로 선택합니다. 모델 클래스를 선택합니다. 두 가지로 시작하십시오.PF 매개 변수 pf 느린 PF 및 지연은 예를 들어 그림과 같이 초기화해야 하지만 다른 값도 가능합니다. Mark는 세 가지 매개변수가 모두 적합한지 확인합니다. 실행을 클릭합니다.그런 다음 중간 수치를 주시하고 필요한 경우 지연 매개변수와 레코드의 길이를 조정합니다. 결과 그래프를 검토하여 피팅, 품질을 평가하고 피팅 오차를 기록합니다. 초기화 매개 변수를 각각 몇 배씩 변경하고 다시 실행하십시오.물 투과성 계수 또는 pf를 결정하기 위해 가장 낮은 맞춤 오차 값을 목표로 초기화 매개변수의 다양한 조합으로 시작하여 이 절차를 여러 번 반복하고, 토끼 opsys 잎의 다른 아쿠아포린 메실 원형질체의 활성을 비교하고, 토끼의 아쿠아포린 유전자를 가진 3개의 유전자 구조로 분리 및 별도로 형질전환했습니다. OPSYS 및 MAZE. 원형질체는 강화된 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 벡터로 co-ran에 의해 표지되었습니다. 저장성 챌린지에 노출되었을 때 세포 부피 변화의 시간 경과를 각 세포에 대해 구하고, 저장성 챌린지 동안 목욕 삼투압 변화의 시간 경과를 얻었으며, 각 세포에 대한 PF 값을 도출했습니다.PF FIT 프로그램을 사용하여 3개의 아쿠아포린 각각으로 형질전환된 프로토플라스트의 PF 값이 GFP 단독으로 형질전환된 대조 세포의 PF보다 유의하게 높은 것을 관찰했습니다. 이 기술을 완전히 익히면 제대로 수행되면 며칠 안에 수십 개의 세포를 분석할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 하이토닉 분석을 받은 분리된 프로토플라스트 또는 다른 초점 세포에서 SMO 투수성을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.남은 질문이 있으시면 주저하지 마시고 저희에게 연락해 주십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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