Name: 16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶ 16S rRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング法。環境サンプルから微生物叢の組成と多様性を解析し、微生物生態学への深い洞察を提供します。ベンチトップシーケンサーを用いた効率的な手法です。

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>jove_content<ここで紹介する手法の開発は、Genome CanadaとGenome Quebec、Environment Canada STAGEプログラム、および内部NRC資金を含むさまざまな資金源で行われました。

フュージョン法による1の16SrRNA遺伝子アンプリコンライブラリの準備<ol><li>プライマー（フォワード、F343-IONA-MIDXX解凍：5&#39;-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 &#39;;、R533-IonP1リバース：5&#39;-CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT A TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;;ボールド：イオントレント特定のアダプター;斜体：シーケンシングの実行の開始時に信号強度を較正するためのキーであり、正規のフォント：鋳型特異的なプライマーであり、X ... X：10 bpのバーコード、いくつかのバーコード配列については表1を参照）、2倍HotStartTaqプラスマスターミックスとサンプル。穏やかに混合されるべきであるマスターミックスを除いて、使用前に十分に混合します。 </li><li>リバースプライマー0.5μM、0.4ウシ血清アルブミン（BSA）のmg / mlのおよび1×HotStartTaqプラスマスターミックスをPCRミックス（20μlの反応）を準備します。 Eにマスターミックス18.5μl添加ACH PCRチューブ。 </li><li>一緒に配列決定されるサンプルごとに異なる​​バーコードがフォワードプライマー（20mMの0.5μl）を追加します。 PCRチューブにサンプルを1μl（1-10 ngの/μl）を添加。 </li><li> PCR装置にチューブを配置し、次のプログラムを実行します。95℃で5分間初期変性; 45秒間、30秒、72℃30秒、55℃、95℃の25サイクル; 10分間72℃で最終伸長。 PCR産物を4℃に保っCO / Nまたは使用するまで凍結することができる。 </li></ol> 2アンプリコン精製、定量およびプーリング<ol><li>利用可能な最大の櫛を使用して、2％アガロースゲルを準備します。よく空の各試料を分離、ゲル上での反応や負荷に6×ゲルローディング色素5を添加する。 50分間70 Vでゲルを実行します。 </li><li>ゲルの写真を撮るとバンド（250bpの周りが期待サイズ：190 bpの産物を加えた63塩基対のアダプターおよびバーコード）を切断清潔なメスを使用しています。 </li><li&gt;は切除したバンドを計量し（ たとえばと、キアクイックゲル抽出キット）PCR産物のゲル抽出および精製を進める。 </li><li>ピコグリーンで各PCR産物を定量化し、5×10 9分子/μL（約1 ngの/μL）での保存溶液を得るために、希釈液を作る。いくつかのサンプルがより低い増幅を示された場合は、以降の操作に適した最低濃度は1.57×10 7分子/μL（26 PM）であることを念頭に置いて、より低い濃度に希釈液を調整します。 </li><li>希釈した各PCR産物のプール10μlのサンプルを、等モルのプールを得た。計画されたシーケンシングの実行ごとに1つの別のプールを準備します。使用するまで、プールされたPCR産物は、冷凍庫に保つことができる。 </li></ol> 3エマルジョンPCRおよびシーケンシング<ol><li>エマルジョンPCR法を実行します。 <ol><li> 25μlの容量で26 PMにプールされたPCR産物を希釈する。イオンPGMテンプレートキットからの試薬を解凍する。 </li><li>エマルジョンPCRミックスを調製する（キットに提供される試薬）をPCRフード内やベンチにプールされたPCR産物と球粒子（提供）を追加します。完全に混合し、フィルターカートリッジに混合物を挿入し、慎重に乳化油（付属）でトップ。 </li><li>ゆっくりと自動化されたエマルジ ​​ョンPCR装置（ 例えば、イオンワンタッチ2計器）上のフィルターカートリッジと負荷が逆になります。適切なプログラムを選択し、手順を開始する。 </li></ol></li><li> PCRが完了した自動化されたエマルションの後、採血管からの上清を除去し、チューブの底に球粒子を取り出す。 （キットに付属）洗浄溶液100μl中球を再懸濁し、ライブラリ定量化のための2.0μlのアリコートを取る。 </li><li>図書館定量化を実行します。 <ol><li>アダプターB&#39;-ファム2μlの（5&#39;-FAM -CTでSSPEバッファー（150mMのNaCl、10mMののNaPO 4、1mMの硫酸ナトリウム-EDTA）100μlをミックスG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 &#39;）プローブとアダプターA-Cy5を2μlの（5&#39;-Cy5の -CCAのTCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3&#39;）プローブ。ステップ3.2で撮影2.0μlのアリコートにこの混合物の52μLを加え、定量化のためのブランクとして残り52μlに（テンプレートキットから）の洗浄溶液2μlを加える。 </li><li> 2分間、次いで37℃で、2分間95℃でインキュベートする。 1.5ミリリットルチューブ内での混合物を転送します。 </li><li> RTで3分間15,500×gでTEX緩衝液（10mMのTris、1mMのEDTA、0.01％トリトンX-100、pH8.0）を1.0mlのは、ミックス遠心分離して下さい。上清を除去し、各チューブに20μlのままにしておきます。この洗浄操作を2回繰り返します。 </li><li> 、TEXバッファー180μl添加し、ペレット化した粒子を再懸濁し、500μlの量子ビットチューブに移す。 </li><li>量子ビット装置を用いて、FAMと​​Cy5用の蛍光を測定し、イオンコミュニティウェブサイトで利用可能な計算機を使用して、正球の割合を算出。 </li></ol></li><li>自動化された濃縮システム（ 例えば、イオンワンタッチエンリッチメント·システム）を使用して（増幅されたDNAを含む）は、正球について球粒子の残りを豊かにする。 <ol><li>提供さ8ウェルストリップの適切なウェルにおけるピペットで試薬：まあ1：ステップ3.2から球体粒子;さて2：予め洗浄のMyOneストレプトアビジンC1ビーズ（13μl）を;さて図3、図4および5：洗浄溶液（テンプレートキットで提供される）; 6さて：空;さて7：溶融オフ溶液（125 mMのNaOHを、0.1％のTween 20）;さて8：空。 </li><li>ピペッティングアームの先端と試料採取用の0.2ミリリットルチューブを取り付けます。楽器を起動します。濃縮の終了時に、溶液（提供）を中和する10μlのを追加します。濃縮されたビーズは、最大15日間4℃に保つことができる。 </li></ol></li><li>シークエンシング装置を初期化します。 <ol><li>シーケンシングの実行の詳細を指定して、シークエンシング機器に接続し、シーケンシングの実行計画を準備します。 </li><li> Installの洗浄溶液＃2（イオンPGM配列決定キットで提供される）、洗浄溶液＃1（350μlの100mMのNaOH）で、自動pH緩衝液（付属）。 </li><li>初期化手順を開始して、それぞれの50mlチューブでのdATP、dGTPをdCTP及びdTTPのヌクレオチド（提供）を追加メッセージが表示されたら。配列決定装置上にチューブをねじ込み、初期化手順を続行します。初期化が完了すると、すぐに実行手順を開始する。 </li></ol></li><li>配列決定のためのサンプルを準備し、チップをロードします。 <ol><li> 1.5分間15,500×gで遠心分離することにより、チューブの底にステップ3.4から濃縮球を収集します。正確に3μLを残して上清を取り除きます。 </li><li> （配列決定キットで提供される）の配列決定プライマーの3μl加え、粒子を再懸濁させ、上下にピペッティングすることによって十分に混合して。 2分間、次いで37℃で、2分間95℃でインキュベートする。 </li><li>ポリメラーゼ1μlの（付属）を追加し、よく混ぜincub5分間RTで食べた。 30分以内にシークエンシングチップ上の酵素球の混合物をロードするために進んでください。 </li><li>インキュベーションの間、シーケンサー上でシーケンシングチップをロードして、チップの品質チェックを行う。遠心分離することにより、チップから液体を取り出し、ゆっくりと酵素球ミックス（7μl）をダウンピペッティングとチップ内の気泡の導入を回避することにより、チップ内のサンプルをロードします。 </li><li>マイクロ遠心、1分間のチップを3回遠心します。各遠心分離、チップの向きを変更し、各実行間に上下にピペッティングして混ぜる。 </li><li>機器内のチップをロードし、実行を開始します。 </li></ol></li></ol> 4。基本シーケンスデータ解析<ol><li>配列データ·サーバに接続し、FASTQファイルをダウンロードします。 （ 表1の例を参照）プライマーおよびバーコード情報を含むタブ区切りの「オリゴ」ファイルを作成します。名言からGreengenes参照ファイルをダウンロードホ·ウェブサイト（ <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline</a> ）。 </li><li> Mothurを起動して、分析を実行します。 <ol><li>次のコマンドを使用して、FASTA及び品質ファイルにFASTQファイルを変換しますfastq.info（FASTQ = test.fastq） </li><li> 、trim.seqs（FASTA = test.fasta、オリゴ= barcode.txt、qfileにより= test.qual、qwindowaverage = 20、qwindowsize = 50、minlength = 150：各シーケンスのグループメンバーシップを決定し、次のコマンドを用いて配列をトリミングkeepforward = T） </li><li>さまざまなオプションが所望のストリンジェンシーに応じて変更することができる</li><li>次のコマンドを使用してgreengenes分類法における配列の分類：classify.seqs（FASTA = test.trim.fasta、方法=王、グループ= test.groups、テンプレート= gg_99_otus.fasta、分類学= gg_99_otus.tax、カットオフ= 50） </li></ol></li></ol>

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<li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+resemblance+methods+differ+in+their+ability+to+detect+biologically+relevant+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns.</a> Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).</li>
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<li>Milani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+fecal+microbiota%3A+an+optimized+Ion+Torrent+16S+rRNA+gene-based+analysis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol.</a> PLoS ONE. 8, e68739(2013).</li>
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<li>Petrof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stool+substitute+transplant+therapy+for+the+eradication+of+Clostridium+difficile+infection%3A+%27RePOOPulating%27+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut.</a> Microbiome. 1, 3(2013).</li>
<li>Whiteley, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+16S+rRNA+Ion+Tag+and+community+metagenome+sequencing+using+the+Ion+Torrent+%28PGM%29+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform.</a> J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6, 1621-1624 (2012).</li>
<li>Kozich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).</li>
<li>Hamady, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+UniFrac%3A+facilitating+high-throughput+phylogenetic+analyses+of+microbial+communities+including+analysis+of+pyrosequencing+and+PhyloChip+data%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data.</a> ISME J. 4, 17-27 (2010).</li>
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<li>Rastogi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR-based+toolbox+for+the+culture-independent+quantification+of+total+bacterial+abundances+in+plant+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments.</a> J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).</li>
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<li>Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+alignment+quality%2C+distance+calculation+method%2C+sequence+filtering%2C+and+region+on+the+analysis+of+16S+rRNA+gene-based+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000844(2010).</li>
<li>Links, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperonin-60+universal+target+Is+a+barcode+for+bacteria+that+enables+de+novo+assembly+of+metagenomic+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data.</a> PLoS ONE. 7, e49755(2012).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

<html>ここで紹介する方法は、簡単で安価であり、多くの研究室が、メタゲノムシーケンシングの力にアクセスすることを可能にする必要があります。それが使用されるシーケンシングプラットフォームに応じて異なるが、一回のライブラリは、プロセスの大部分が自動化されていると非常に少ないハンズオン時間は、必要とされる構成されている。ここで使用されるシーケンシングプラットフォーム（イオントレントPGM）のために、完全な手順は、作業の2日以内に行うことができます。 36サンプルのPCR増幅：25ドル、ゲル精製および36サンプルのピコグリーンDNA定量：125ドルを、エマルジョンPCRは、1プールされたアンプリコン試料について、以下のように（2013年9月）を書いている時点では、上記の詳細な例に関連する試薬の費用であった：550ドルまたはサンプルあたり15ドルまたは品質フィルタリング読み取りあたり0.0015ドル、合計250ドル、$ 150と配列決定試薬。この価格は、機器、サービス契約、機器の減価償却費、技術者の給与および実験室スペースの使用は含まれていません。 10トン &quot;&gt;最も重要なステップの一つは、ピコグリーン定量化は、ここで使用された。試料のそれぞれのために読み込みますが、他の方法が適しているかもしれません、しかしあまり正確で同様の数を取得するために、等モル比ですべての製品をプールすることである（ 例えば、UV定量、ゲルベースの定量化）。どんなに正確な定量とプーリングを行うことによって、ある程度の変動は、サンプル当たりの読取りの数が存在し、 表2に詳細に典型的な実験では、4,380から32,750の範囲であるサンプル（40〜50以上）の多数を処理した場合、10338の平均読み出すとともに、単一列のゲル精製、厳しいサイズカットオフ（ 例えば、AMPureビーズ）を有するビーズを用いてプレートまたは精製ゲル精製によって置き換えることができる読み取り。 現在までに、16S rRNA遺伝子のために最も使用される次世代シークエンシング技術は、このプロトコルで使用される454ザ·イオン·トレントシークエンシング技術は、概念的に非常に似てい454へと両方の技術は、配列決定エラーの同じタイプの傾向がある。当然のことながら、それはイオントレントシーケンシングは、454 10に非常に類似の配列決定の結果をもたらしたことが示された。最近では、多くの研究者は、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシング18,19のためのイルミナ技術の使用を検討している。いずれの場合も、この方法で最近記載のように、これらの配列決定技術のために必要なアダプタとバーコードと一致するように融合プライマー配列を変更することにより、イルミナMiSeqまたは454 GSジュニアのような他のベンチトップのシーケンサーのための現在のプロトコルを適合させることが容易であるイルミナMiSeq 19。代わりに、研究者は、手順1と、ここで詳細なプロトコルの2に従い、エマルジョンPCRおよび配列決定が実行されるであろうシーケンシングセンターにプールされたアンプリコンを送信することができます。 16S rRNA遺伝子をトリミングし、分類されたMothurを使用して、他の多くの分析が上に行うことができますし、読み取り16S rRNA遺伝子アンプリコン。例えば、ベータ多様性で概説した手順を用いて、各サンプルペア間Unifrac距離を計算することによって評価することができる<a href="http://unifrac.colorado.edu/">http://unifrac.colorado.edu/</a> 20。アルファ多様性指数と、各サンプルの操作分類学的単位の数はAmpliconNoise 21のようQIIME内のツールを使用して、またはHuse らによって概説された手順を用いて算出することができる。22とMothur内で利用できる。 ここで使用したプライマーは、16S rRNA遺伝子の可変領域3及び4を増幅したが、他の多くの領域が標的化され得る。本研究では、16S rRNA遺伝子は、植物材料から増幅し、プライマーの選択は、葉緑体16S rRNA遺伝子23,24の増幅を避けるために行われた。製品の長さ、分類学上のパワーと有用性25,26の任期が異なる利用可能な他のプライマー、多種多様があります。しかし、すべての場合において200-400 bpが確実に種レベルで分類することができない16S rRNA遺伝子の読み取り、および分析は、属、より高い分類学的レベルに制限されています。種レベル情報がCpn60ととのrpoB遺伝子27,28のように、必要な場合に他の遺伝子は、より適切である可能性があります。分析ツールのパワーシーケンシングおよび増加するコストの今後の大幅な滴が散弾銃のメタゲノミクスにより16S rRNA遺伝子シーケンシングを交換することが可能になるかもしれないが、それまでの16S rRNA遺伝子配列決定は、環境微生物学のゴールドスタンダードのまま。

それは、環境試料中に含まれる遺伝情報の全体を対象としてメタゲノム配列決定は、非常に強力な技術です。ショットガン配列決定、大インサートライブラリおよびアンプリコンシークエンシングを含むメタゲノムシーケンシングのさまざまなフレーバーがあります。アンプリコンシークエンシングは、比較的、安価で高速で生成することができるという利点は、一般的に整列させることができる、単一のゲノム領域から読み取り提供しています。また、アンプリコンの配列決定のためのデータ分析のワークフローは、ほとんど標準化されている。それはPCRに基づいているので、それはせいぜい、このアプローチは、半定量的になり、不完全特異性、不完全な被覆およびプライマー1,2を付勢する、に関連するすべてのバイアスを有している。いくつかのゲノム領域は、機能的遺伝子を含むアンプリコン配列決定のために標的とすることができるが、最も人気のあるオプションは、コミュニティプロファイルを生成するために、そのような16S rRNA遺伝子などのマーカー遺伝子を使用することである。伝統的に、16S rRNA遺伝子アンプリコンsequencingを大腸菌でクローニングを含め、労働集約的な技術を用いて実施した大腸菌 、コロニーピッキングと孤立プラスミド上サンガー配列決定に続いてプラスミド抽出し、、結果的に、ほとんどの研究は、サンプルあたり100未満のクローンを分析した。大規模な配列決定反応の並列化と、最も重要なのは、宿主内で遺伝子断片を挿入しなくても、テンプレートのクローンを分離：次世代シーケンシングは、2つの主要な進歩をもたらした。これは途方もなく、16S rRNAの遺伝子アンプリコンシークエンシング3のための「ルネサンス」で、その結果、すぐに戻って多くの環境微生物学研究のルーチン機能としてある16S rRNA遺伝子アンプリコンのシーケンシングを簡素化している。 2005 4ロシュ454シークエンシングの登場以来、いくつかの他の次世代シーケンシング技術が市場に登場している（ 例えば、イルミナ、ソリッド、PacBio）。より最近では、ベンチトップ配列の導入RSは、小さなラボに大シーケンシングセンターに一回の排他的シーケンシング能力をもたらした。ファイブ卓上マシンは現在入手可能である：454 GSジュニア、イオントレント個人ゲノムマシン（PGM）とプロトン、およびイルミナMiSeqとNextSeq 500これらすべてのシーケンサーはあまり提供していますが、ほとんどのフルよりも実行し、ドル当たり少ない拠点ごとに読み込むスケールのシーケンサは、彼らは迅速な、より柔軟であり、その低買収し、実行コストは小さな大学の研究室のために彼らは手頃な価格になります。研究のこのタイプは一般的に、配列決定の極端な深さを必要としないため、ベンチトップ·シーケンサーは、環境微生物学研究における小さなゲノムおよび低複雑メタゲノムシーケンシングアンプリコンに特に適している。例えば、それは一般的に、16S rRNA遺伝子配列決定研究のための数は、サンプルごとに読み取ることが合意されている〜1,000百万がデータセット5を読み込むのと同じパターンを生成することができます読み取るように、最優先事項ではありません。と言われたので、ベンチトップ次世代generatio<html> nはシーケンサはまだ〜10のGBP（イルミナMiSeq）〜10月15日のGBP（イオントレントプロトン）、〜2のGBP（イオントレントPGM）、〜35 Mbpの（454 GSジュニア）の最大収率で、シーケンス·大量のデータを生成するほとんどの環境微生物学研究のために十分以上のものですと〜100のGBP（イルミナNEXT SEQ 500）。 ベンチトップ型シーケンサーを用いて16S rRNAのアンプリコンの次世代シークエンシングは、近年、さまざまな環境に適用されている。例えば、イオン·トレントPGMは、コミュニティのために使用されているオイルサンドの炭化水素で汚染された北極土壌8,9の養殖システム7は 、再循環により、特に高いpH及び低い透過6を持っていたウラン鉱山尾鉱、採掘の影響を受ける堆積物の分析と汚染された土壌12に植え柳の根圏の、ヒトおよび動物の体の13〜16と嫌気性消化槽17のアサバスカ川10,11からバイオフィルム、。 この貢献私たちの具体的jove_content &quot;&gt;ベンチトップ次世代シーケンサー（イオントレントPGM）を使用して、社内で16S rRNA遺伝子アンプリコンを配列決定するために私たちのアプローチ。DNA抽出後、16S rRNA遺伝子が含まれているドメインレベルの細菌のプライマーを用いて増幅しているシークエンシングアダプターとユニークな、試料特異的配列（バーコード）。アンプリコンを精製し、等モル比で定量し、プールした。プールされたサンプルは、その後クローン的エマルジョンPCRで増幅され、配列決定されているが、得られた配列は、公的に利用可能なバイオインフォマティクスツールを用いて分析している（ たとえば、Mothur）。

<table><tbody><tr><td>Ion 314 チップキット v2</td><td>Life Technologies</td><td>4482261</td><td></td></tr><tr><td>イオン PGM シーケンシング 200 キット v2</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 4482006</td><td></td></tr><tr><td>イオン PGM テンプレート OT2 200 キット</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>4480974</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq Plus マスターミックスキット</td><td>Qiagen</td><td>203646</td><td></td></tr><tr><td>プライマーとプローブ</td><td>IDT</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>BSA 20 mg/ml</td><td>ロシュ</td><td>10,711,454,001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne ストレプトアビジン C1</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ <td>65001</td><td></td></tr></tbody></table>

16sリボソームrna遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

微生物生態学の主要な問題の一つは、「そこには誰？」この質問は、さまざまなツールを使用して答えることができますが、長期的な金の規格の一つは、ドメインレベルのPCRによって生成された16SリボソームRNA（rRNAの）遺伝子アンプリコンを配列決定することですゲノムDNAから増幅する反応。伝統的に、これはクローニングおよびサンガー（キャピラリー電気泳動）PCRアンプリコンの配列決定によって行った。次世代シークエンシングの出現は、途方もなく簡略化し、16S rRNA遺伝子配列決定配列決定の深さを増加している。ベンチトップ·シーケンサーの導入は今、小さなラボ数日で、社内で自分の16S rRNAの塩基配列決定を行うことができます。ここでは、ベンチトップ型の次世代シーケンサーを用いた16S rRNA遺伝子アンプリコン配列決定のためのアプローチが詳述されている。環境DNAは、最初の配列決定アダプターとバーコードが含まれているプラ​​イマーを用いてPCRによって増幅される。次いで、それらを、エマルジョンPCRを介して球状粒子に結合されている。粒子がlである使い捨てチップ上oaded及びチップは、シークエンシングが行われた後、配列決定装置に挿入される。配列はFASTQ形式で取得し、ろ過し、バーコードは読み取るのサンプル·メンバーシップを確立するために使用されているされている。濾過し、ビニングされ、その後、さらに公的に利用可能なツールを用いて分析する読み取ります。読み込み例分析はMothurが指定されているソフトウェアパッケージ内の分類探知アルゴリズムで分類された。ここに概説された方法は、簡単な、安価で簡単であり、継続的なゲノム革命から利用するようにより小さなラボを助けるべきである。

シリカゲル上での精製後、PCR増幅の25サイクルで、増幅産物を水50μl中に0.2〜10.0 ngの濃度で通常である。これは出発DNA濃度、サンプルの種類、使用する精製キットによって大きく異なる場合があります。これは、全てのサンプルが同じサイクル数を用いて増幅されるべきであることを念頭に置いて、キメラ形成を回避し、増幅偏りを減少させるために可能な限り最低にPCRサイクルの数を維持することが推奨される。ポリクローナルの数が読み込み最小限に抑え、空の球と読み込みの数を最大にするために、量子ビットの比は0.1と0.3の間であるべきであるとFAM蛍光がイオントレントPGM上の314チップを使用した200を超えるべきである、平均出力は約ある0.3〜0.5 Mは良い品質はMothurの結果のフィルタリングの後に読み込まれます。 表2は、36の多重化は、environを含む実行の手順の各ステップの後に読み込むの数の典型的な内訳を示し精神的サンプルは16SのV3-4領域を標的とするプライマーを用いて増幅し、Mothurを用いて分析した。 Mothurでは、trim.seqs手順は品質フィルターと理由と共に品質のフィルターを通過しなかった配列を含む「* .scrap.fasta」を渡された配列を含む「* .trim.fasta」ファイルを生成するシーケンスヘッダにおける拒絶反応のために。 「オリゴ」ファイルにバーコードが供給されると、このコマンドは、バーコード配列に基づいて、すべての系列のグループメンバーシップを含む「* .groups」ファイルが生成されます。 classify.seqs手順は、Excelで開くことができる「.tax.summary」を生成する。このファイルには、（列のように）サンプルのそれぞれについて、分類学的所属（行数）の要約が含まれています。このファイルは、下流の統計分析のために使用することができ、さまざまな分類学的レベルでのコミュニティの組成物を視覚化する。 「.taxonomy」ファイルは、詳細な分類学的が含まれています各シーケンスのために所属。すべての36の試料にわたる門/クラスレベルで平均コミュニティ組成物は、 図1に示されている。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> すべてのサンプル間で門/クラスレベルで1の平均群集組成図。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;">フォワード</td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr heighはt = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Sample05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Sample06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> CTGACCGAAC </td><td>サンプル10 </td></tr></tbody></table> Mothurで使用するため、表1の例」オリゴ」ファイル 。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> ＃の読み込み</td><td style="width:123px;">前のステップの％ </td><td style="width:107px;">平均。サンプル当たり</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;">井戸の数</td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;">ビーズとウェルズ</td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88.20パーセント</td><td align="center"> 30947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;">テンプレートとビーズ</td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99.90パーセント</td><td align="center"> 30910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;">モノクローナルビーズ</td><td align="center"> 826805 </td><td align="center"> 74.30パーセント</td><td align="center"> 22967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;">良質の読み取り（シーケンサからの出力） </td><td align="center"> 782204 </td><td align="center"> 94.60パーセント</td><td align="center"> 21728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;">峠Mothurフィルター（最小平均50bpのウィンドウ上の20の品質スコア、最小150bpの長さ） </td><td align="center"> 372168 </td><td align="center"> 47.60パーセント</td><td align="center"> 10338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> GreenGenesにおける門のレベルで分類された（50％信頼閾値） </td><td align="center"> 342171 </td><td align="center"> 91。90％ </td><td align="center"> 9505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> GreenGenes家族レベルで分類された（50％信頼閾値） </td><td align="center"> 316512 </td><td align="center"> 92.50パーセント</td><td align="center"> 8792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> GreenGenes属レベル（50％信頼閾値）で分類</td><td align="center"> 289899 </td><td align="center"> 91.60パーセント</td><td align="center"> 8053 </td></tr></tbody></table> 1イオントレント314のチップ上に多重化さ36環境試料のための典型的な実験から生成された読み取りの表2数。

微生物群集の特徴を明らかにすることは、環境微生物学における長年の目標でした。次世代のシーケンシング法により、最小限のコストと労力で、これまでにない深さで微生物群集の特性評価が可能になりました。ここでは、ベンチトップシーケンサーを使用して細菌の16SリボソームRNA遺伝子を配列決定するアプローチについて詳しく説明します。

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

この手順の全体的な目的は、ベンチトップシーケンサーを用いて、環境試料から増幅した16 S-R-R-N-A遺伝子の配列を決定することです。これは、まず修飾プライマーを用いて16 S-R-R-N-A遺伝子を増幅させることで達成されます。第2ステップでは、増幅産物を精製し、定量してプールします。次に、アンプリコンプールを、エマルジョンPCRでクローン増幅されたシーケンシング spheres に結合させ、ベンチトップシーケンサーでシーケンシングを行います。最終ステップは、得られたシーケンスデータセットを解析することです。最終的に、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングを用いて、環境試料中の微生物コミュニティの組成と多様性を決定します。DGGやクローニングシーケンシングなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、微生物コミュニティの組成と多様性について、より深く明確な視点を得られることです。この手法は、微生物生態学における重要な問いの一つである「そこに誰がいるのか」という疑問を解決するのに役立ちます。まず、フォワードプライマーとリバースプライマー、2X hot start tac plus master mix、およびサンプルを準備します。フォワードプライマーとリバースプライマーの配列は、示されているテンプレートに適合しています。この配列には、Ion Torrent専用のアダプターが含まれています。シーケンシング開始時に信号強度を校正するためのシーケンシングキーです。テンプレート特異的プライマーと10 bpのバーコードを用いて実行してください。その後、使用前にプライマーとサンプルを十分に混合してください。PCR反応液を調製します。1反応あたり、0.5 µMのリバースプライマー、0.4 mg/mLのBSA、および1X hot start tac plus master mixを含む20 µLの混合液を用意します。次に、各PCRチューブに18.5 µLのマスターミックスを分注し、同時にシーケンシングを行う各サンプルに、異なるバーコードを含む20 mMのフォワードプライマーストック溶液を0.5 µLずつ添加します。次に、PCRフード外で、1〜10 ng/µLの濃度のサンプルを1 µL、PCRチューブに加えます。初期変性を95 °Cで5分間行うプログラムを設定します。その後、95 °Cで30秒間のサイクルを25回繰り返します。55 °Cで30秒間、および72 °Cで45秒間。最終伸長反応は72 °Cで10分間で行います。チューブをPCR機にセットし、プログラムを開始します。最終的なPCR産物は、使用するまで4°Cまたは-20°Cで保存できます。利用可能な最大のコームを使用して、2%アガロースゲルを作製します。次に、各PCR反応液に6xゲルローディングダイを5µL混ぜ合わせ、各サンプルの間に空のウェルを挟んでゲルにロードします。ゲルを70 Vで50分間電気泳動します。泳動後、ゲルの写真を撮影し、メスを用いてバンドを切り出します。各バンドは約250 bpになると予想され、これには190 bpの産物と、アダプターおよびバーコードを構成する63 bpが含まれています。次に、切り出したバンドを計量し、PCR産物のゲル抽出および精製を行います。Kayak Quick Gel Extraction Kitなどのキットを使用し、その後、PicoGreenを用いて各PCR産物を定量し、5 × 10⁹ molecules/µL（約1 ng/µL）のストック溶液となるよう希釈します。一部のサンプルで増幅効率が低い場合は、必要に応じて濃度を調整しますが、1.57 × 10⁷ molecules/µLを下回らないようにしてください。各希釈PCR産物を10 µLずつ混合して、サンプルの等モルプールを作成します。予定しているシーケンシングランごとに個別のプールを準備してください。混合したPCR産物は、エマルションを行うまで冷凍庫で保存可能です。まず、混合PCR産物をion PGMテンプレートキットの試薬を用いて、26 pM、全量25 µLに希釈します。次に、PCRクリーンベンチ内でエマルションPCRの調製を行います。プールしたPCR産物とスフィア粒子は、ベンチ上での作業時に混合できます。溶液を十分に混ぜ合わせ、混合液をフィルターカートリッジに挿入し、その上にエマルションオイルを慎重に加えます。次に、フィルターカートリッジをゆっくりと反転させ、自動エマルションPCR装置にセットします。その後、適切なプログラムを選択し、処置を開始します。自動エマルションPCRの完了後、回収チューブから上清を取り除き、チューブ底部のスフィア粒子を回収します。再懸濁します。球状粒子を100 µLの洗浄液に懸濁させ、ライブラリー定量用に2 µLのアリコートを採取します。PCR産物をシーケンスするには、シーケンスランの詳細を指定したシーケンスランプランを作成します。次に、装置を開き、「initialize」をクリックし、プロンプトが表示されたら、洗浄液2、洗浄液1、および自動pH緩衝液をシーケンス装置にセットします。次に、初期化手順を継続し、指示が出たら D-A-T-P-D-G-T-P-D-C-T-P および DTTP ヌクレオチドを、それぞれ対応する 50 milliliter チューブに加えます。その後、チューブをシーケンシングマシンにねじ込んで固定し、初期化手順を続行します。初期化手順が完了したら、直ちにサンプルロード手順を開始し、シーケンシングのためのサンプル調製を行います。エマルションPCRで濃縮したスフェアを15,500 ×gで1.5分間遠心分離し、チューブの底にスフェアを回収します。次に、S natinを除去し、チューブ内に正確に3 µLを残します。続いて、シーケンシングプライマー3 µLをチューブに加え、ピペッティングで粒子を再懸濁させ、溶液を十分に混合します。チューブを95 °Cで2分間、次いで37 °Cで2分間インキュベートします。インキュベーション完了後、1 µLのポリメラーゼを加えて十分に混合し、混合液を室温で5分間インキュベートします。インキュベーションの間、シーケンシングチップをシーケンサーにロードし、チップの品質チェックを行います。次に、マイクロ遠心分離機を用いて迅速に遠心分離を行い、チップから液体を除去します。気泡がチップ内に入らないように注意しながら、酵素球ミックス 7 µL をゆっくりとピペッティングしてチップに導入します。サンプルをチップにロードしたら、チップを装置にセットし、シーケンシングランを開始します。データの解析を開始するには、シーケンシングデータサーバーに接続し、fastqファイルをダウンロードします。次に、プライマーとバーコード情報を含むタブ区切りのoligosファイルを作成します。続いて、MOTHERのウェブサイトからGreen Genesリファレンスファイルをダウンロードし、MOTHERを起動して解析を実行します。画面下部に表示されているコマンドを使用して、FASTQファイルをfastq-allファイルに変換します。各配列のグループ所属を判定し、配列をトリミングします。その後、このコマンドを用いて、Green Genesタクソノミーに基づいて配列を分類します。このコマンドを使用すると、Ion Torrent PGMの314チップを用いたシーケンシングにおける平均出力は、Mothurで結果をフィルタリングした後で約0.3〜0.5百万リードの高品質なリードとなります。ここにあるのは、この次世代シーケンシング手順の各ステップ後におけるリード数の典型的な内訳です。ここに示されているのは、16SリボソームのV3-V4領域を標的とするプライマーで増幅し、Mothurで解析した、マルチプレックス化された全36個の環境サンプルの門・綱レベルにおける平均的なコミュニティ組成です。この手法は、適切に実施すれば2日間で完了できます。このビデオを視聴することで、ベンチトップシーケンサーを用いて16SリボソームRNAアンプリコンをシーケンスする方法について、十分に理解できるはずです。

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学ぶ 16S rRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング法。環境サンプルから微生物叢の組成と多様性を解析し、微生物生態学への深い洞察を提供します。ベンチトップシーケンサーを用いた効率的な手法です。

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

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