Name: Isolare cellule staminali intestinali da adulti Drosophila Midguts di FACS per Studiare Stem Cell Comportamento durante linvecchiamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Impara a isolare cellule staminali intestinali da Drosophila adulti mediante FACS. Questo metodo consente di studiare i cambiamenti molecolari durante l'invecchiamento e migliorare le terapie rigenerative.

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Siamo grati a Gabriele Allies per l'eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo la Facoltà di Medicina dell'Università di Ulm per l'utilizzo della FACS Core Facility e l'Institut für Molekulare und Zelluläre Anatomie per l'utilizzo del microscopio confocale. Ringraziamo S. Hayashi per la linea di mosca esg-Gal4, UAS-GFP. Questo progetto è finanziato dal Ministero Federale dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. è supportato da SFB 1074 (Progetto A2). A.T. e G.A. sono sostenute dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. è membro della Scuola di Specializzazione Internazionale in Medicina Molecolare di Ulm (GSC 270).

NOTA: Se il protocollo viene utilizzato per la prima volta a isolare CSI da FAC di smistamento, i seguenti controlli sono obbligatori al fine di impostare inizialmente i parametri FACS correttamente: le cellule dissociate da wild type (es w 1118) midguts Drosophila senza Sytox. Cellule dissociate da wild type (es w 1118) midguts Drosophila con Sytox (vedi punto 3.6). Cellule dissociato dal midguts della linea fly UAS-GFP ESG -Gal4 senza Sytox. 1. preparazione di soluzioni e piatti per Gut Dissection <ol><li> Preparare 4-6 flaconcini contenenti ciascuno 40 femminile vola da ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP. </li><li> Da una soluzione 10x PBS, preparare 500 ml 1x PBS (1,8 mm NaH 2 PO 4 · H 2 O, 8.4 mM Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 175 mM NaCl, regolare il pH a 7,4). </li><li> Preparare un 3,5Soluzione% agarosio in PBS 1x (3,5 g di agarosio grado elettroforesi in 100 ml PBS 1x). Preparare piatti dissezione versando questa soluzione in capsule di Petri (diametro 8,5 centimetri) per coprire il fondo. Lo strato di agarosio impedisce di danneggiare le punte della pinza durante la procedura di dissezione. Dopo che il gel è solidificato memorizzare le piastre di dissezione a 4 ° C. </li><li> Preparare 300 ml di PBS 1x + 1% BSA freschi prima dissezione e posizionare la bottiglia su ghiaccio oppure a 4 ° C. </li><li> Accendere centrifuga e lasciarlo raffreddare a 4 ° C. </li><li> Fiamma le punte dei 2 pipette Pasteur in vetro per lisciare i bordi. </li><li> Pulire due paia di pinze e una lama di rasoio con il 70% di etanolo. </li><li> Mettere da quattro a sei da 1,5 ml microprovette per la raccolta midguts sezionati sul ghiaccio. </li></ol> 2. Preparazione del tratto gastrointestinale e la dissezione del midgut <ol><li> Anestetizzare le mosche da un flaconcino (40 mosche) con CO 2 in un letto volo normale, decapitare tuttomosche usando una lama di rasoio e trasferirli al piatto dissezione. Versare fredda soluzione / 1% BSA PBS 1x nel piatto dissezione a coprire il gel di agarosio. Le mosche galleggia. </li><li> Prendete al volo addome con un paio di pinze, tenendo il torace con l&#39;altra coppia di pinze. Separare il torace dall&#39;addome. L&#39;intestino sarà visibile e la foregut / raccolto sarà molto probabilmente ancora collegato al torace. </li><li> Afferra l&#39;intestino ed estrarlo del torace. Per aprire l&#39;intestino, afferrare il raccolto e tirare l&#39;intestino leggermente anteriormente fuori dall&#39;addome. </li><li> Afferrare l&#39;estremità posteriore dell&#39;addome con una coppia di pinze e il bordo della cuticola aperta anteriormente con l&#39;altra coppia di pinze. Fare attenzione a non distruggere il tessuto intestinale sporgenti. Tirare l&#39;estremità posteriore via per rompere la cuticola e continuare a tirare posteriormente molto delicatamente finché l&#39;intero intestino è stato tirato fuori dalla cavità addominale. Il raccolto potrebbe dover essere rimosso in anticipo se è troppo grande per essereattraverso la cavità del corpo. </li><li> Rimuovere la foregut, tubuli malpighiani, hindgut e ovaie lasciando il midgut nudo. </li><li> Utilizzando un vetro pipetta Pasteur, trasferire il lotto di midguts sezionati in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente freddo soluzione BSA 1x PBS / 1% e mantenere il tubo in ghiaccio. I campioni devono essere trattati entro 2 ore. </li><li> Dopo la dissezione di un intero lotto è completa, lavare il piatto dissezione con acqua bidistillata a lavare sinistra sopra i detriti. Avviare sezionare il prossimo gruppo di midguts (ripetere i passaggi 2,1-2,7). Sezionare tante partite possibili entro 2 ore, quindi procedere al passo 3.1. </li></ol> 3. La digestione del Tissue Gut a Celle di raccolta per FAC Ordinamento <ol><li> Rimuovere la soluzione BSA / 1% 1x PBS dai midguts e aggiungere 500 ml di 0,5% soluzione di tripsina-EDTA per ogni campione. </li><li> Vortex bene per 20 sec e incubare i campioni dolce dondolio / rotante a 20 rpm a temperatura ambiente per 25-30 min. </li><li> Vortex nuovamente dopo circa 30 min e lascia intatta lavello tessuto midgut al fondo della provetta. Rimuovere delicatamente le cellule che sono in sospensione con una fiammata Pasteur pipetta di vetro e filtrare attraverso un nylon 35 micron rete in un nuovo 1,5 ml provetta. </li><li> Spin le cellule giù a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C. Da notare, quando si avvia il digest, un pellet di cellule potrebbe non essere visibile in un primo momento, ma sarà visibile come il tessuto digest progredisce. <ol><li> Trasferire accuratamente la soluzione tripsina torna alla provetta campione originale contenente il rimanente tessuto midgut intatto. Evitare il trasferimento troppe cellule dal pellet. </li><li> Delicatamente risospendere il pellet cellulare in 400 ml di freddo 1x PBS / BSA 1%. Tenere le provette da microcentrifuga contenenti le cellule dissociate su ghiaccio e coprire le provette con foglio di alluminio per proteggere le cellule dalla luce. </li><li> Vortex la soluzione tripsina contenente ancora il restante tessuto midgut intatta e posizionare i campionisul bilanciere per altri 30 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.4.3 fino a quando tutti i tessuti dell&#39;intestino è stato digerito. Unire le cellule dissociate da tutti i tubi microcentrifuga in una provetta. Ciò può richiedere una fase di centrifugazione come in 3.4, in quanto il volume di tutte le sospensioni cellulari combinate possono superare 1,5 ml. Mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio e proteggere le cellule dalla luce. </li><li> Spin le cellule dissociate giù a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere accuratamente la maggior quantità di surnatante possibile lasciando circa 50-100 ml di soluzione di BSA 1x PBS / 1% in provetta. Risospendere delicatamente le cellule dissociate in 800 microlitri 1x PBS / BSA 1% contenente Sytox (1: 20.000). </li><li> Trasferire la sospensione cellulare a 5 ml tubo Falcon rotondo fondo filtrando le cellule attraverso un cappuccio filtro cella (maglia di nylon 35 micron). Tenere sempre campioni di cellule su ghiaccio e al riparo dalla luce. Le cellule sono ora pronti peressere ordinati. </li><li> Pipettare 600 ml di soluzione di RNAlater in ogni provetta in cui le cellule verranno ordinati per successivo isolamento di RNA. Per altre applicazioni a valle le cellule possono essere raccolte in una soluzione diversa, ad esempio in PBS sterile. </li></ol> 4. FAC Ordinamento per isolare le cellule staminali intestinali <ol><li> Accendere lo strumento citometria di flusso almeno un&#39;ora prima di smistamento. Assicurarsi che il sistema di fluidica è privo di bolle d&#39;aria. </li><li> Scegli le dimensioni dell&#39;ugello 70 micron per iniettare le cellule nel flusso del liquido guaina. </li><li> Regolare l&#39;ampiezza della corrente di fluido principale in modo che il valore della distanza corrispondente al valore di riferimento (6-7, quando si utilizza l&#39;ugello 70 micron). Lasciate che il flusso del fluido nucleo stabilizzi prima di iniziare a ordinare. </li><li> Seguire questo ordine quando l&#39;impostazione iniziale dei parametri per l&#39;ordinamento: <ol><li> Caricare le cellule dissociate ottenute da tipo budella selvatici. In primo luogo, regolare le tensioni FSC e SSCper tracciare le cellule al centro del grafico a dispersione. In secondo luogo, regolare la FITC (GFP) tensione in modo che tutte le cellule sono tracciati inferiore a 10 2 sul logaritmico asse x. L&#39;impostazione del parametro CIC fissa il limite per autofluorescenza. </li><li> Caricare le cellule dissociate ottenute da tipo budella selvatici con Sytox aggiunto. Regolare il valore di Pacific Blue di tensione e porta a identificare e cellule soggiorno indipendente dai morti, cellule Sytox-positivi in ​​Blue Pacific vs FSC un diagramma a dispersione. </li><li> Caricare le cellule dissociate ottenute dalla ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP senza Sytox e regolare la tensione di FITC per garantire che tutte le cellule GFP-positive sono tracciati all&#39;interno del diagramma a dispersione. </li></ol></li><li> Caricare le cellule dissociate ottenute dalla ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP con Sytox aggiunto. Regolare il valore di Pacific Blue di tensione e porta a identificare e cellule soggiorni separati dai morti, cellule Sytox-positive (porta P1). <ol><li> Impostare la SSC-A e FSC Un cancello per identificare il GFPcellule positive (basati sulla trama istogramma) come determinato dalla dimensione e granularità (cancello P2). </li><li> Impostare la porta FSC-H e FSC-W per identificare ed escludere doppiette di cellule GFP-positive in base alla loro dimensione (cancello P3). </li><li> Impostare la SSC-H e la porta SSC-W per identificare ed escludere doppiette di cellule GFP-positive in base alla loro granularità (cancello P4). </li><li> Utilizzare cancello P4 per rappresentare le cellule GFP-positive in una trama istogramma che mostra il numero di cellule (contare) vs. intensità GFP. Due picchi distinti di cellule GFP-positive saranno visibili. Creare una porta per ogni picco (cancelli P5 e P6). Porta P5 contiene la popolazione di cellule che si arricchisce di CSI e possono essere ordinati separatamente dalle cellule nel cancello P6. </li><li> Back-porta in una trama di contorno per verificare che le due popolazioni GFP-positive distinte cellule contengono cellule viventi (confrontare con cancello P1) e le cellule del formato corretto (confrontare con cancello P2). </li></ol></li><li> Ordina le cellule in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 600 &amp; #181; l di soluzione RNAlater. La selezione è effettuata ad una velocità di flusso bassa (max. 2,0, 70 micron ugello, 1.000 eventi / sec, 70 psi) e impiegando un bidirezionale purezza sorta. </li><li> Dopo l&#39;ordinamento è completa, vortice immediatamente le cellule ordinati brevemente e mantenere i tubi microcentrifuga su ghiaccio fino procedere con l&#39;isolamento di RNA o altre applicazioni a valle. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo presentato descrive un metodo per isolare ISC da giovani e meno giovani adulti midguts Drosophila, che possono poi essere utilizzati per ulteriori analisi molecolari come sequenziamento di nuova generazione. FAC ordinamento della popolazione di cellule GFP-positive dalla ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP è già stato raggiunto da diversi gruppi 21,22. Tuttavia, fino ad ora la presenza dei due picchi distinti di cellule GFP-positive è stata sia trascurato o sottovalutato. Abbiamo dimostrato che questa separazione non rappresenta solo due diverse popolazioni di tipi di cellule (ISC e EBS), ma anche che i due picchi di cellule GFP-positive rimanere nettamente distinto durante l&#39;invecchiamento. Questa osservazione è molto importante e prezioso per i ricercatori interessati allo studio delle cellule staminali o progenitrici durante l&#39;invecchiamento. Isolamento di ISC da vecchi midguts è stata ostacolata dal fatto che non vi è nessuna combinazione marcatore molecolare per identificare i CSI in un midgut invecchiato. L&#39;unico indicatore che uidentifica nambiguously ISC in un vecchio midgut è fosfo-histone3 (PH3), dal momento che ISC sono le cellule solo dividono nel midgut 12,13. Tuttavia, PH3 è un indicatore idoneo per isolare ISCs poiché il numero di divisione delle cellule staminali in qualsiasi dato punto di tempo è troppo bassa per ottenere una discreta quantità di CSI per analisi successive. La ESG linea di volo -Gal4, UAS-GFP è la linea di volo più comuni utilizzati dai ricercatori che studiano ISC funzione, la manutenzione e la differenziazione. La nostra conoscenza attuale sulla regolazione molecolare di CSI omeostasi è basata su studi in cui sono stati manipolati specifiche molecole e vie di segnalazione (valutata in 7). Quindi, ci manca ancora la conoscenza dei cambiamenti molecolari endogeni che si verificano durante l&#39;invecchiamento. Il metodo qui descritto chiude questa lacuna e si basa sul fatto che CSI può essere isolato base alle loro dimensioni, granularità e GFP intensità da midguts adulti in qualsiasi punto nel tempo durante l&#39;invecchiamento. Mentrestabilire e ottimizzare questo metodo abbiamo trovato le seguenti operazioni per essere critico per un risultato affidabile. Circa 200 viscere devono essere sezionato al fine di ottenere una buona quantità di CSI per FAC smistamento. La velocità di dissezione è fondamentale e dipende dalla pratica dell&#39;individuo. Un individuo addestrato può sezionare 40 budella entro 20-30 min. Poiché GFP si esprime anche nei tubuli malpighiani nel ESG -Gal4, UAS-GFP linea di volo, è indispensabile rimuovere completamente i tubuli malpighiani dal midgut. I midguts sezionati devono essere conservati in un ambiente fresco per evitare il degrado del tessuto e ridurre l&#39;attività RNAse nel tessuto. Pertanto, i midguts sezionati devono essere trasferiti dal piatto dissezione in microprovette contenenti freddo soluzione / 1% BSA 1x PBS dopo un massimo di 20-30 minuti e tenuti in ghiaccio. Tuttavia, i midguts sezionato non dovrebbero essere lasciati sul ghiaccio per più di 2 ore prima di iniziare la dissociazione di tessuto con tripsina. Il più efficiapproccio ent è quello di analizzare il maggior numero di partite di mosche possibili entro questi 2 ore, quindi avviare la tripsina digerire per questi lotti. Se sono necessarie più midguts, possono essere sezionati durante i tempi di incubazione della tripsina digest. Sebbene tripsina è un enzima molto potente e potrebbe avere effetti negativi sulle cellule, abbiamo ancora ottenuto abbastanza vita, le cellule sane per il successivo smistamento FAC. La fase chiave del nostro procedimento che permette l&#39;isolamento di cellule intatte è che le cellule dissociate sono rimossi dalla soluzione di tripsina ogni 30 min. Se le midguts sezionati sono incubate per 2 ½ ore in una soluzione di tripsina contenente a temperatura ambiente, abbiamo osservato un aumento del 20-30% in celle Sytox-positive morti. Va sottolineato che la soluzione tripsina usiamo contiene EDTA. La presenza di EDTA probabilmente facilita disgregazione del tessuto da chelanti ioni calcio e magnesio necessari per il corretto funzionamento delle molecole della matrice extracellulare. </p&gt; I passi più importanti per specie con successo ISC da giovani e vecchi coraggio sono le impostazioni iniziali appropriate dei FACS ed i parametri di gating utilizzando i comandi descritti e seguenti una gerarchia di ordinamento specifico. Abbiamo eseguito la FAC l&#39;ordinamento su un II Citofluorimetro ARIA (software FACSDiva). È importante che lo strumento sia acceso almeno un&#39;ora prima di smistamento per riscaldare i laser. Da segnalare, quando viene eseguito FAC ordinamento del CSI per la prima volta, i parametri per la selezione e per necessità di compensazione da impostare utilizzando i controlli di cui sopra: (1) le cellule dissociate da wild type (es w 1118) midguts Drosophila senza aggiunta di Sytox - impostazione di questo parametro (Step 4.4.1) impedisce l&#39;ordinamento delle cellule in base alla loro autofluorescenza; (2) dissociato da cellule wild type (es w 1118) midguts Drosophila con Sytox aggiunto - impostazione di questo parametro(Step 4.4.2) permette di separare morto da cellule viventi (le cellule morte hanno un elevato autofluorescenza e possono contaminare le cellule GFP-positive ordinati); (3) dissociato cellule dal midguts della ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP senza Sytox - impostare questo parametro (Step 4.4.3) assicura che tutte le cellule GFP-positive sono tracciati all&#39;interno del diagramma a dispersione. Se questi parametri non sono impostati correttamente, la popolazione cellulare ordinata, molto probabilmente conterrà le cellule morte e detriti (Figura 5B, C), molte cellule GFP-positive verranno perse (Figura 5D) e le due picchi distinti per cellule GFP-positive come visto nella trama istogramma (Figura 2E e Figura 3E) non vengono rilevati. Una volta impostati i parametri FACS e gating, lo strumento è calibrato e pronto per ordinare cellule dal ESG -GAL4, linea di volo UAS-GFP. Dal momento che questi parametri possono essere salvati, tutti i futuri ordinamento sessioni per CSI e EBs dalla ESG -GAL4, UAS-Linea di volo GFP può iniziare dal punto 4.5. Sebbene scegliendo la modalità &quot;Purezza&quot; ed effettuando una purezza bidirezionale sorta diminuisce il numero di cellule filtrate, consente una maggiore stringenza classificare (Passo 4.6 e Figura 4B, C). Da notare, il vantaggio di utilizzare Sytox invece di ioduro di propidio etichettare cellule morte è che c&#39;è solo una bassa straripamento nel canale FITC (GFP), che lo rende facile per compensare la ricaduta. Il nostro metodo di arricchimento per CSI e EBS, rispettivamente, si basa su ordinamento delle celle in base ai diversi livelli di espressione GFP. Può darsi che durante l&#39;invecchiamento la misdifferentiated EBs anche esprimere GFP a un livello più basso e potrebbe essere scambiato come CSI. Tuttavia, poiché le cellule ordinati differiscono per dimensioni e granularità, riteniamo che la nostra strategia di ordinamento è il più adatto a questa data per arricchire per ISC ed EBS. Inoltre, è noto che le cellule in un midgut invecchiamento ritegno ISC identità hanno un piccolo nucleo 15. Per ottenere maggiore chiarezza sull&#39;identità delle cellule ordinati, si poteva ordinare cellule da una linea transgenica mosca che porta esg -GAL4, UAS-GFP e un segnale di Notch giornalista transgene. Poiché Notch ha dimostrato di essere attivo solo nelle EBs 12,13, ISCs isolato da un giovane midgut sarebbe negativo per il reporter Notch, mentre i EBs sarebbe positivo per il reporter Notch. Tuttavia, durante l&#39;invecchiamento diventa segnale di Notch aberranti nel tessuto midgut. Pertanto, deve essere testato se questo set up sperimentale è davvero più affidabile per distinguere tra CSI e EBs isolato da un vecchio midgut. Abbiamo già impiegato questo approccio per l&#39;analisi del trascrittoma comparativa dei CSI da giovani e vecchi midguts e ha individuato una serie di fattori che sono regolati in modo differenziale durante l&#39;invecchiamento (unpub. Osservati.). Inoltre, questo metodo consente di analizzare le differenze di espressione genica tra CSI e EBS. Tale indagines fornirà comprensione dei cambiamenti molecolari iniziali che si verificano in una cellula entra nel processo di differenziazione. Inoltre, l&#39;isolamento di EBs durante l&#39;invecchiamento e le successive analisi farà luce sui cambiamenti molecolari di misdifferentiation età indotta. Inoltre, questo metodo può essere combinato con altri strumenti genetici utilizzati in Drosophila per studiare la funzione del gene. In sintesi, questo metodo offre un approccio imparziale per indagare le caratteristiche molecolari e cambiamenti di ISC ed EBS durante l&#39;invecchiamento. Si tratta di un prezioso strumento che faciliterà l&#39;esplorazione di invecchiamento meccanismi nelle cellule staminali e progenitrici adulte.

Una conseguenza inevitabile di invecchiare è la capacità decrescente di tessuti e organi a funzionare. Le cellule staminali adulte sono essenziali per mantenere l&#39;omeostasi dei tessuti e la funzionalità degli organi, ma come organismi di età, le cellule staminali anche sperimentare un calo della loro comportamento biologico. Ciò è particolarmente dannoso per tessuti che hanno un alto tasso di turnover, quali l&#39;epitelio intestinale. Caratteristiche di cellule staminali di età includono danni genomico, i meccanismi di riparazione deteriorate, regolazione del ciclo cellulare alterata e vie di segnalazione misregulated, tutti che influenzano il comportamento delle cellule staminali normali (rivisto in 1-3). Manipolando vie di segnalazione specifici o abbattere geni specifici, abbiamo acquisito conoscenze del loro ruolo nella regolazione e il mantenimento di un comportamento normale di cellule staminali. Dal momento che la maggior parte di questi esperimenti sono approcci molecola candidati, abbiamo pochissime informazioni circa i cambiamenti molecolari endogeni che si verificano nelle cellule staminali duranteinvecchiamento. Un modo per affrontare questo problema è quello di confrontare il trascrittoma di giovane rispetto a cellule staminali vecchie di identificare molecole il cui profilo di espressione cambia in modo significativo durante l&#39;invecchiamento. Purtroppo, problemi biologici e tecnici hanno ostacolato il nostro progresso per quanto riguarda questo approccio finora. Drosophila melanogaster è un organismo modello molto adatto per lo studio dell&#39;invecchiamento in quanto ha una vita breve (circa 60-70 giorni) e mostre fenotipi di invecchiamento (rivisto in 4). Inoltre, il processo di invecchiamento in Drosophila può essere accelerato dalla temperatura. Quando mantenendo in linea a 29 ° C, un fenotipo invecchiato nel tessuto intestinale può già essere osservato dopo 15 giorni 5. Inoltre, Drosophila è suscettibile per una pletora di manipolazioni genetiche. In particolare, il midgut Drosophila è emersa come un ottimo sistema modello per studiare l&#39;influenza di diverse vie di segnalazione e le sfide ambientalila biologia delle cellule staminali intestinali (CSI) durante l&#39;invecchiamento (rivisto in 6-10). L&#39;epitelio intestinale Drosophila ha un alto tasso di fatturato e si rinnova ogni due settimane nelle femmine e circa una volta al mese nei maschi 11. ISC residente nel midgut Drosophila ha la capacità di dividersi e produrre un ISC auto-rinnovata e una cellula progenitrice post-mitotico chiamato enteroblast (EB) 12,13. L&#39;EB differenzia in due un enterociti assorbente o una cella enteroendocrine secretoria. A questa data, l&#39;unica combinazione marcatore che le etichette in modo inequivocabile un ISC è l&#39;espressione del fattore di trascrizione escargot (ESG) e il ligando Notch Delta (Dl) 14. Tuttavia, questo vale per un giovane e sano intestino solo. Durante l&#39;invecchiamento, l&#39;epitelio midgut è caratterizzata da un aumento della proliferazione ISC 15-17. Inoltre, Notch aberranti sconvolge la decisione destino delle cellule figlie ISCe induce misdifferentiation di EBs 15. Ciò si traduce in un accumulo di cellule che sono attivi per la segnalazione Notch e co-express ESG e Dl, rendendo così espressione Dl insufficiente per identificare in buona fede le cellule staminali in un midgut invecchiato. La difficoltà di identificare i veri CSI ha impedito la possibilità di esaminare i cambiamenti endogeni in CSI invecchiamento fino ad ora. Abbiamo affrontato questo problema sfruttando la ESG -Gal4, UAS-GFP linea fly transgenici in cui il livello di espressione GFP in CSI e EBS è intrinsecamente diversa e resta diverso per tutta l&#39;invecchiamento. Un approccio simile è stato descritto per l&#39;isolamento di neuroblasti larvali e neuroni 18,19. Midguts di giovani e vecchi ESG -Gal4, mosche UAS-GFP sono stati sezionati e dissociate in singole cellule. Le cellule sono state poi ordinati per la cellule GFP-positive utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS). È interessante notare che l&#39;ordinato GFP-positive cells distribuiti in due picchi distinti sulla base dell&#39;intensità di fluorescenza GFP (GFP alti e bassi GFP). Inoltre, la distribuzione delle cellule GFP-positive nei due picchi anche correlati con dimensioni delle cellule: le cellule che mostravano bassa intensità GFP erano piccole e meno granulare che cellule con alta intensità GFP erano più grandi e più granulare. Questa osservazione ha suggerito che i CSI più piccole potrebbero essere distinti dai EBs di grandi dimensioni tramite FACS basati sull&#39;intensità GFP e scegliendo scatter appropriata in avanti (FSC) e le impostazioni di side scatter (SSC). Curiosamente, i due picchi sono rimasti nettamente separati durante l&#39;invecchiamento. Inoltre, il rapporto tra i due picchi modificata in modo da riflettere le caratteristiche di cui sopra di midguts invecchiamento: vale a dire che il numero di grandi dimensioni, misdifferentiated EBS aumenta nel tempo. Da questi risultati possiamo concludere che di classificare per le cellule GFP-positive utilizzando le impostazioni dei parametri FACS appropriate possiamo arricchire per CSI e EBs in qualsiasi punto temporale durante invecchiamento. In sintesi, si introduce una strategia di FACS che permette ai ricercatori di arricchire di due diverse popolazioni cellulari, CSI ed EBS, dalla Drosophila midguts di ogni età e isolare queste cellule per ulteriori analisi, come sequenziamento di nuova generazione. Questo metodo permette potente per lo studio dei meccanismi molecolari endogeni che sono inerenti all&#39;invecchiamento in una popolazione arricchito di cellule staminali o progenitrici. I dati ottenuti da questi studi saranno sicuramente facilitare l&#39;identificazione di molecole conservate che sono significativi per l&#39;invecchiamento tra le specie.

<table><tbody><tr><td>Pinze: Dumont, Inox Biologie #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>SefarNitex 03-150um/38 (35 &micro; Sefar</td><td></td> <td>3A03-0150-102-00</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Provetta in polistirene a fondo tondo con filtro cellulare Tappo a scatto</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Polymax 1040</td><td>Heidolph</td><td>543-42210-00</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>La tripsina ottenuta da un'altra azienda molto probabilmente ha un'attività diversa e la durata del digestato della tripsina deve essere regolata di conseguenza.</td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain per citometria a flusso</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di stabilizzazione RNAlater</td><td>Life Technologies</td><td>AM7023</td><td>Altre soluzioni, ad es, Trizol possono essere utilizzate per il successivo isolamento dell'RNA Selezionatore</td></tr><tr><td>di cellule FACSAria II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Accendere un'ora prima della cernita</td></tr></tbody></table>

isolare cellule staminali intestinali da adulti drosophila midguts di facs per studiare stem cell comportamento durante l'invecchiamento

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Il tessuto che invecchia è caratterizzato da un continuo declino della capacità funzionale. Le cellule staminali adulte sono fondamentali per mantenere l'omeostasi tissutale, in particolare nei tessuti che hanno un alto tasso di turnover come l'epitelio intestinale. Tuttavia, le cellule staminali adulte sono anche soggette ai processi di invecchiamento e al concomitante declino della funzione. L'intestino medio di Drosophila è emerso come un sistema modello ideale per studiare i meccanismi molecolari che interferiscono con la capacità delle cellule staminali intestinali (ISC) di funzionare nell'omeostasi dei tessuti. Sebbene le ISC adulte possano essere facilmente identificate e isolate dall'intestino medio di giovani mosche, è stata una grande sfida studiare i cambiamenti molecolari endogeni delle ISC durante l'invecchiamento. Ciò è dovuto alla mancanza di una combinazione di marcatori molecolari adatti a isolare le ISC dall'intestino invecchiato. Qui proponiamo un metodo che consente di dissociare con successo il tessuto dell'intestino medio in cellule viventi che possono essere successivamente separate in popolazioni distinte mediante FACS. Utilizzando cellule dissociate dalla linea di mosca esg-Gal4, UAS-GFP, in cui sia le ISC che le cellule progenitrici dell'enteroblast (EB) esprimono GFP, si distinguono due popolazioni di cellule in base alle diverse intensità di GFP. Queste differenze nell'espressione della GFP sono correlate a differenze nelle dimensioni e nella granularità cellulare e rappresentano popolazioni arricchite di ISC ed EB. Curiosamente, le due popolazioni cellulari GFP-positive rimangono nettamente separate durante l'invecchiamento, presentando una nuova tecnica per identificare e isolare popolazioni cellulari arricchite per ISC o EB in qualsiasi momento durante l'invecchiamento. L'ulteriore analisi, ad esempio l'analisi del trascrittoma, di queste particolari popolazioni cellulari in vari momenti durante l'invecchiamento è ora possibile e ciò faciliterà l'esame dei cambiamenti molecolari endogeni che si verificano in queste cellule durante l'invecchiamento.

Per ottenere tra 50.000-100.000 cellule da FAC ordinamento, tra 160 e 200 midguts devono essere sezionato. Ovviamente questo è il più tempo passo dell'intera procedura. Il cartone mostrata in figura 1A illustra le fasi principali di budello dissezione, che sono descritti in dettaglio nel protocollo qui fornite. Questa procedura può essere modificata singolarmente. Un sezionato, tutto il tratto gastrointestinale è mostrato nella Figura 1B. Quando tutto il tessuto midgut è stato digerito, continua immediatamente con FAC smistamento. Seguendo la strategia di gating descritto nel protocollo consente l'identificazione di successo e smistamento di una popolazione di cellule arricchito per CSI e EBs da giovane (Figura 2) e da vecchie midguts (Figura 3). Il cancello P1 è impostato per includere solo le cellule viventi sane e per escludere le cellule morte. Le cellule che tracciare sopra 10 3 sulla logaritmica y-axquando si utilizza il canale Pacific Blue sono definiti come cellule morte. I punti che trama sotto 40 sul asse x (FSC-A) sono per lo più detriti e quindi sono esclusi anche (Figura 2A). Nel grafico a dispersione di SSC-A vs FSC-A le cellule sono distribuiti in base alla loro dimensione e granularità. Per una risoluzione ottimale, le cellule sono posti nel diagramma di dispersione, come illustrato in Figura 2B regolando la tensione del tubo fotomoltiplicatore (PMT). Nei grafici a dispersione FSC-H vs. FSC-W e SSC-H e SSC-W singole cellule sono separate da aggregati e doppietti base alle dimensioni (Figura 2C) e sulla base di granularità (Figura 2D). Quando raffigurante le cellule contenute in porta P4 in una trama istogramma, la netta separazione di GFP-negativo, GFP basso (porta P5) e (cancello P6) cellule GFP alta è visibile (Figura 2E). Le cellule che presentano intensità GFP inferiore sono piccole e meno granulare e rappresentano CSI. Le cellule che presentano maggiore int GFPensità sono più grandi e più granulare e rappresentano EBs. Trascrittasi inversa (RT) -PCR per Dl su cDNA sintetizzato da RNA delle cellule di ogni popolazione GFP-positive (cancelli P5, P6) ha rivelato che il segnale Dl è davvero più forte nei più piccoli, GFP bassi cellule che nel più ampio, GFP alta cellule (Figura 2H). Le cellule sono state poi backgated e rappresentati in grafici di contorno per confermare che le cellule GFP basso (porta P5) e GFP alto (porta P6) differiscono per dimensioni e granularità (Figura 2F) e sono ancora vivi (Figura 2G). Di nota, i due picchi di cellule GFP-positive (GFP bassa e alta GFP) possono essere ben distinti solo se il (GFP) canale FITC è stato calibrato correttamente utilizzando i comandi descritti nel protocollo. La stessa strategia di gating è stato utilizzato durante l'ordinamento CSI derivati ​​da vecchi budella (Figura 3). I grafici a dispersione (Figure 3A-D), l'istogramma (Figura 3E) e le curve di livello (Figura 3F, G) sono analoghi a quelli mostrati in figura 2. Come accennato sopra, non vi è alcun marcatore buona fede identificare ISCs in vecchi midguts e quindi nessun dato RT-PCR è presentato qui. Tuttavia, l'osservazione interessante è che i due picchi contenenti GFP basso (porta P5) o (P6) di gate cellule GFP elevati rimangono nettamente separati durante l'invecchiamento. Inoltre, il numero di cellule in alta (gate P6) picco GFP aumenta significativamente durante l'invecchiamento, che emula chiaramente l'accumulo noto di EBs misdifferentiated con l'età. La variazione del rapporto tra le due popolazioni cellulari può essere visto anche nelle trame dispersione (confrontare Figura 3A-D con la Figura 2A-D) e nei grafici di contorno (confronta figura 3F, G alla figura 2F, G). Da questi risultati possiamo concludere che di classificare per GFPcellule -positive utilizzando FACS si possono arricchire di ISC e EBs in giovani e vecchi midguts. Per convalidare la purezza della ISC isolata e EBs, un'analisi post ordinamento è stato eseguito (Figura 4). Le trame istogramma del post-ordinati ISC ed EBS (Figura 4B, C) ​​raffigurano purezza tra il 95% e il 98%. Se la gerarchia di impostare i parametri FACS come sopra descritto è strettamente seguito, le due popolazioni cellulari differenti (GFP bassa, piccola e GFP alto, più grande) possono già essere distinte in un grafico a dispersione GFP vs. FSC-A (Figura 5A). Queste due popolazioni di cellule non si distinguono se questa gerarchia viene ignorata (Figura 5B-D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig1highres.jpg"> Figura 1: (A) Uno schema delle fasi principali di Disseamen la mosca intestino. Innanzitutto, la testa viene rimossa (la rimozione delle ali è opzionale) seguito da una separazione del torace e dell'addome per esporre l'intestino. L'intestino viene successivamente liberato dalla cavità del corpo nelle seguenti fasi. Le frecce nere indicano la progressione della dissezione, mentre le frecce rosse scure indicano la direzione di estrazione. Le linee rosse nella ultima immagine indicano anteriore e posteriore confini del midgut. (B) A immagine luce del microscopio della mosca adulta dell'intestino. Le principali regioni e caratteristiche anatomiche sono etichettati. Le linee rosse segnano i confini del midgut. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig2highres.jpg"> Figura 2:. FAC ordinamento strategia per identificare e isolare ISC e EBs da giovani (7 giorni) midguts Per una migliore visualizzazione, le cellule che rappresentano CSI sono evidenziate in rosso e le cellule che rappresentano EBs sono evidenziatein blu nel diagrammi di dispersione (AD) e nei grafici di contorno (F, G). (A) Il cancello P1 è impostato per escludere cellule morte, Sytox-positivi tracciate sopra 10 3 sul y logaritmico. La soglia del FSC-A è fissato a 40 per escludere anche le cellule morte e detriti. (B) Le cellule sono state gated per FSC-A e SSC-A per selezionare le celle in base alle dimensioni e granularità (cancello P2). La trama istogramma (E) è stato utilizzato in parallelo per identificare le cellule GFP-positive in FSC-A vs SSC-A grafico a dispersione (B). (C, D) I grafici a dispersione FSC-H vs. FSC-W e SSC-H e SSC-W servono per rimuovere aggregati e doppietti e selezionare per singlets (porta P3 in C e cancello P4 in D). (E) La trama istogramma mostra il numero di cellule e la loro intensità GFP. Due picchi, GFP basso (porta P5) e GFP alto (porta P6) possono essere distinti. (F, G) Le cellule sono state back-gated in una trama di contorno per verificare che le due cellule GFP-positive distinto populationi sono di dimensioni corrette (F) e contengono cellule viventi (G). (H) Reverse Transcriptase (RT) per -PCR Dl su cDNA sintetizzato da RNA isolato dalle cellule presenti nel primo picco (porta P5) e nel secondo picco (cancello P6), rispettivamente. Più espressione Dl potrebbe essere rilevato in cellule presenti in porta P5 P6 vs cancello. Tubulina servito come controllo di caricamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig3highres.jpg"> Figura 3: FAC ordinamento strategia per identificare e isolare ISC e EBs dal vecchio (60 giorni) midguts Per una migliore visualizzazione, le cellule che rappresentano CSI sono evidenziate in rosso e le cellule che rappresentano EBs sono evidenziate in blu nei grafici a dispersione (AD) e in. grafici di contorno (F, G). (A) Il cancello P1 è impostato per escludere cellule morte, Sytox-positivi tracciate sopra 10 3 sul y logaritmico. La soglia del FSC-A è fissato a 40 per escludere anche le cellule morte e detriti. Da segnalare, l'aumento di età-dipendente in cellule GFP-positive più grandi è già evidente in questa trama. (B) Le cellule sono state gated per FSC-A e SSC-A per selezionare le celle in base alle dimensioni e granularità (cancello P2). La trama istogramma (E) è stato utilizzato in parallelo per identificare le cellule GFP-positive in FSC-A vs SSC-A grafico a dispersione (B). (C, D) I grafici a dispersione FSC-H vs. FSC-W e SSC-H e SSC-W servono per rimuovere aggregati e doppietti e selezionare per singlets (porta P3 in C e cancello P4 in D). (E) La trama istogramma mostra il numero di cellule e la loro intensità GFP. Due picchi, GFP basso (porta P5) e GFP alto (porta P6) possono essere distinti. Da segnalare, l'alta cellula popolazione GFP contenenti celle più grandi è aumentato in numero durante l'invecchiamento. (F, G) le cellule sono state back-gated in una trama di contorno per verificare che le due popolazioni GFP-positive distinte cellule sono di dimensioni corrette (F) e contengono cellule viventi (G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig4highres.jpg"> Figura 4:. Una analisi post sorta è stata eseguita per determinare la purezza della ISC isolata e EBs cellule (A) GFP-positivi dai giovani (7 giorni) e di età (60 giorni) midguts erano FAC allineati e le trame degli istogrammi mostrano la distribuzione in due picchi sulla base dell'intensità GFP. (B) L'analisi post sorta dimostra la purezza dei CSI isolati da giovani e meno giovani midguts che è&gt; 97%. (C) L'analisi post sorta di ordinata EB da giovani e meno giovani midguts mostra una purezza&gt; 95%. Le lievi impurità possono derivare da fluorescenza tempra o cellule GFP esprimere danneggiate meccanicamente causati dalla ri-ordinare le cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig5highres.jpg"> Figura 5: Esempi di grafici a dispersione che mostrano dati FACS non ottimali, che si vede quando i parametri FACS non sono stati fissati correttamente (A) profilo Rappresentante FACS di tutte le cellule, quando i parametri FACS sono stati impostati correttamente sulla base dei controlli descritti nel protocollo.. La popolazione di cellule contenenti CSI è cerchiata in rosso e la popolazione cellulare contenente EBS è cerchiata in blu. Le cellule cerchiate in verde sono le cellule morte che hanno una autofluorescenza forte rispetto alcellule viventi, che sono tracciate sotto 10 3 on y logaritmico. (B) Il diagramma a dispersione raffigura un tipico risultato ottenuto quando lo strumento FACS non è stata calibrata. Non vengono rilevati cellule GFP-positive. (C) Se la FSC non è impostato correttamente, le diverse popolazioni di cellule GFP-positive non vengono rilevati. (D) Se la (GFP) canale FITC non è regolato correttamente, la maggior parte di GFP cellule positive da ordinare non tracciata nel diagramma di dispersione, ma piuttosto lungo il bordo superiore della trama. Inoltre, nel grafico riportato qui, il limite per autofluorescenza non era regolata, quindi cellule che trama superiore a 10 2 sul y asse logaritmiche sono in realtà autofluorescenti e potrebbe essere scambiato come cellule GFP-positive.

Comprendere i cambiamenti molecolari endogeni nelle cellule staminali adulte durante l'invecchiamento richiede l'isolamento delle cellule di interesse. Il metodo qui descritto presenta un approccio semplice e robusto per arricchire e isolare le cellule staminali intestinali di Drosophila e le cellule progenitrici degli enteroblasti mediante FACS in qualsiasi momento durante l'invecchiamento.

Isolare cellule staminali intestinali da adulti Drosophila Midguts di FACS per Studiare Stem Cell Comportamento durante l'invecchiamento

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare una popolazione cellulare arricchita per le cellule staminali intestinali dall'intestino medio di drosofila giovane e anziana utilizzando l'approvvigionamento cellulare attivato dalla fluorescenza. Ciò si ottiene sezionando prima l'intestino medio dei moscerini in cui le cellule di interesse esprimono GFP nella seconda fase. Le viscere medie vengono dissociate in sospensioni a singola cellula e quindi ordinate in base ai fatti in base alle differenze nella loro intensità di GFP.In definitiva, questa strategia di gating consente l'arricchimento e l'isolamento di popolazioni di cellule staminali intestinali da drosofila giovane e anziana. Budella medie. Essere in grado di isolare cellule staminali intestinali da intestino medio giovane e vecchio di drosofila adulta faciliterà l'identificazione di nuove molecole in queste cellule che funzionano durante l'invecchiamento.Le implicazioni di questa tecnica si estendono in ultima analisi allo sviluppo di terapie molecolari volte a migliorare la rigenerazione e il mantenimento degli organi durante l'invecchiamento. La procedura di dissezione e dissociazione tissutale sarà dimostrata da Helen Talc, una studentessa laureata del mio laboratorio, e la selezione dei fatti sarà dimostrata da GaN, una studentessa laureata dell'Istituto di Immunologia prima di iniziare la dissezione. Anestetizzare una fiala di 40 mosche con anidride carbonica su un lettino standard.Quindi usa una lama di rasoio per decapitare tutte le mosche e trasferiscile in una capsula di dissezione rivestita di gel di agarro. Versare abbastanza PBS freddo più BSA nel piatto per coprire gli agros. Le mosche galleggeranno quindi per ogni insetto.A sua volta, afferra una mosca dell'addome con un paio di pinze e il torace con un altro. Separare il torace dall'addome. L'intestino sarà visibile e molto probabilmente il raccolto sarà ancora collegato al torace.Afferra l'intestino ed estrailo dal torace. Quindi afferra il raccolto e tira l'intestino leggermente anteriormente lontano dall'addome per aprirlo. Quindi, usa una delle pinze per afferrare l'estremità posteriore dell'addome e l'altra per afferrare il bordo della cuticola aperta anteriormente.Tirare via l'estremità posteriore per rompere la cuticola e continuare a tirare posteriormente molto delicatamente fino a quando l'intero intestino non è stato estratto dalla cavità addominale. Rimuovere le quattro tube intestinali, l'intestino posteriore e le ovaie lasciando l'intestino medio nudo mentre l'intestino medio viene isolato. Utilizzare una pipetta di vetro per la pasta per trasferire periodicamente diversi tessuti intestinali alla volta in una provetta micro centri da 1,5 millilitri contenente PBS freddo più BSA su ghiaccio entro due ore dalla dissezione.Rimuovere la soluzione dai campioni e aggiungere 500 microlitri di soluzione di EDTA allo 0,5% di tripsina nelle budella centrali. Agitare ogni campione per 20 secondi, quindi incubare l'intestino medio con un leggero dondolio a 20 giri/min a temperatura ambiente. Dopo 25-30 minuti, agitare nuovamente i campioni e lasciare che il tessuto intestinale medio intatto affondi sul fondo della provetta.Una volta che il tessuto si è depositato, utilizzare una pipetta per pasta di vetro fiammato per rimuovere con cura le cellule in sospensione e filtrarle attraverso una rete di nylon da 35 micrometri in una provetta fresca da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Dopo aver filtrato la centrifuga, le cellule notano che all'inizio della digestione, una tavolozza cellulare potrebbe non essere visibile, ma lo diventerà man mano che la digestione dei tessuti progredisce. Trasferire con cautela la tripsina supinato nella provetta del campione originale contenente il tessuto intestinale medio intatto rimanente e risospendere delicatamente il pellet in 400 microlitri di PBS freddo più BSA, posizionare la provetta da microcentrifuga contenente le cellule dissociate su ghiaccio al riparo dalla luce.Quindi agitare la soluzione di tripsina contenente il tessuto intestinale medio intatto rimanente e riposizionare i campioni sul bilanciere per altri 30 minuti. A temperatura ambiente, trattenere periodicamente le cellule dissociate fino a quando tutto il tessuto dell'intestino medio non è stato digerito. Quindi centrifugare le cellule raggruppate e rimuovere con cura o solo gli ultimi 50-100 microlitri di surnatante.Risospendere delicatamente il pellet in 800 microlitri di PBS e BSA più bue, quindi filtrare le cellule attraverso una rete di nylon da 35 micrometri, filtrare un tappo a scatto in un tubo Falcon a fondo tondo da cinque millilitri su ghiaccio, al riparo dalla luce per almeno un'ora. Prima di effettuare lo smistamento, accendere il fax. Scegliere la dimensione dell'ugello da 70 micrometri per iniettare le celle nel flusso del fluido della guaina e assicurarsi che il sistema fluidico sia privo di bolle d'aria.Regolare l'ampiezza del flusso del fluido del nucleo in modo che il valore della fessura corrisponda al valore di riferimento e lasciare che il flusso del fluido del nucleo si stabilizzi. Quindi impostare i parametri per l'ordinamento delle celle. Caricare le celle dissociate ottenute da budella di tipo selvatico e regolare le tensioni di dispersione diretta e laterale Per tracciare le celle al centro del grafico di dispersione.Regolare la tensione di adattamento in modo che tutte le celle siano tracciate al di sotto di 10 rispetto a due e all'asse x logaritmico per impostare il limite del parametro E di adattamento per l'autofluorescenza. Quindi caricare le cellule dissociate ottenute dalle viscere di tipo selvatico con l'aggiunta di cit. Regolare il valore della tensione blu del Pacifico nel grafico di dispersione in avanti, quindi eliminare le celle viventi dai morti.Cellule Cytx positive. Caricare le celle dissociate ottenute dalla linea di mosca escargo GAL four U-A-S-G-F-P senza cyt e regolare la tensione fitzy per garantire che tutte le celle positive GFP siano tracciate all'interno del grafico di dispersione. Quindi caricare le celle dissociate ottenute dalla linea di mosca Escargo GAL four U-A-S-G-F-P con l'aggiunta di cyt e regolare il valore di tensione del blu del Pacifico.Usa questi parametri per accedere alle cellule cytx negative viventi. Identificare le cellule GFP positive. Impostare la dimensione di dispersione A e la dispersione in avanti di un'andatura in base alle dimensioni e alla granularità delle celle GFP positive.Quindi impostare l'andatura h e w a dispersione in avanti per escludere i doppietti cellulari positivi GFP in base alle loro dimensioni e l'andatura a dispersione laterale h e w per escludere i doppietti in base alla loro granularità. Ora, usa l'andatura h e w a dispersione laterale per rappresentare le cellule positive alla GFP in un grafico a istogramma che mostra il numero di cellule rispetto all'intensità della GFP. Saranno visibili due picchi distinti di cellule GFP positive.Crea un cancello per ciascuno dei picchi. Il P 5 gate conterrà la popolazione cellulare che si arricchisce per le cellule staminali intestinali. Il P six gate conterrà la popolazione cellulare che si arricchisce per gli eblasti.Le celle contenute in ciascun gate possono essere ordinate separatamente. Quindi eseguire il back gate in un grafico di contorno per verificare che le due distinte popolazioni cellulari positive alla GFP contengano cellule viventi della dimensione corretta. Infine, utilizzare la modalità di ordinamento della purezza a due vie per ordinare le cellule in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti 600 microlitri di soluzione successiva di RNA a bassa portata.Immediatamente dopo che la selezione è terminata, fare brevemente il vsx delle cellule selezionate e mantenere le provette della microcentrifuga sul ghiaccio fino a procedere con l'isolamento dell'RNA o altre applicazioni a valle. Per convalidare la purezza delle cellule staminali intestinali isolate ed entrare negli oblast, è possibile eseguire un'analisi di smistamento dei post. Ad esempio, in questo esperimento, le popolazioni di cellule staminali intestinali ordinate e di eblast hanno mostrato purezze comprese tra il 95% e il 98%Per verificare che la popolazione cellulare a bassa presenza di GFP sia arricchita nelle cellule staminali intestinali, è possibile eseguire una PCR con trascrittasi inversa per il delta del ligando di notch come mostrato qui.L'espressione di Delta è più forte nelle cellule presenti nella popolazione GFP bassa rispetto alle cellule GFP alte con la tubulina che funge da controllo del carico. La stessa strategia di gating può essere utilizzata quando si reperiscono cellule staminali intestinali derivate da vecchie viscere medie. Si noti che nell'intestino medio vecchio, i due picchi contenenti le cellule GFP bassa e GFP alta rimangono nettamente separati durante l'invecchiamento.Da questi risultati si può concludere che l'approvvigionamento di cellule GFP positive consente l'arricchimento delle cellule staminali intestinali e l'ingresso negli oblast da intestino medio giovane e vecchio. Durante il tentativo di questa procedura, è importante eseguire i passaggi in modo tempestivo. Avendo cura di selezionare le cellule subito dopo la procedura di dissociazione tissutale e di impostare correttamente i parametri dei fatti, utilizzando gli opportuni controlli Per un'ulteriore validazione dell'identità delle cellule staminali intestinali.È possibile testare un ulteriore costrutto reporter che dovrebbe essere attivo solo nelle cellule progenitrici, ma non nelle cellule staminali intestinali.

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Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuti<em&gt; In Situ</em

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Isolare cellule staminali intestinali da adulti Drosophila Midguts di FACS per Studiare Stem Cell Comportamento durante linvecchiamento (Video) | JoVE Journal

Isolare cellule staminali intestinali da adulti Drosophila Midguts di FACS per Studiare Stem Cell Comportamento durante l'invecchiamento

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