Name: A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl - Canais e Transportadores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a medir a atividade de transporte de canais de cloreto reconstituídos em proteolipossomas usando eletrodos sensíveis a cloreto. Este método permite determinar a taxa de turnover unitário e a estequiometria do complexo proteico ativo.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH grant GM085232 e um Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (para AA).

1. Preparação Lipid <ol><li> Alíquota os lípidos quantidade desejada para um tubo de vidro transparente. Use E. coli extracto de lípidos polares, mas a maioria das composições de lipidos podem ser usados. Se os lípidos são na forma de pó, ressuspender em clorofórmio a uma concentração de 20 mg / ml. Secar os lípidos à temperatura ambiente sob atmosfera de N 2 gasoso até todo o solvente se ter evaporado. </li><li> Ressuspender os lipídios em pentano e secá-lo novamente um fluxo constante de gás N 2 para remoção de vestígios que sobraram de clorofórmio. Seco até todo o solvente tenha evaporado. Enquanto a secagem, rodar suavemente o tubo de modo a que o lípido é distribuído numa película uniforme que cobre o terço inferior do tubo em vez de uma formação de uma massa densa na parte inferior. </li><li> Adicionar o tampão de reconstituição contendo detergente (KCl 300 mM, ácido cítrico 50 mM, 25 mM de K 2 HPO 4, pH 4,5, CHAPS a 35 mM) para dissolver os lípidos. Usar outros detergentes suaves para este passo, se a proteína é mal tolerante para CHAPS. </li><li> Resuspend os lipídios a clareza usando um banho de água sonicator. Mergulhar o tubo no centro do banho de ultra-sons de água à potência máxima de curta duração (30 sec-1 min) com pulsos de curta duração (30 sec-1 min) faz uma pausa. A solução deve ficar clara. NOTA: O grau final de clareza obtida depende da composição do lípido específico utilizado. Alguma variação lote-a-lote neste passo, mesmo entre lípidos nominalmente idênticas, também é possível. Turvação residual é devido à dispersão da luz pelas partículas grandes em suspensão, que podem ser removidos por centrifugação. </li><li> Incubar os lípidos ressuspensas a TA durante 20-60 min. </li></ol> 2. proteolipossoma Formação NOTA: Várias estratégias podem ser empregues para inserir o detergente-proteína solubilizada em lipossomas. Para CLC-EC1 diálise funciona bem e é, por conseguinte, o método de escolha 6,9,10. <ol><li> Adicionar a proteína purificada para a desejada proteína e lípido (P / L) razão (expressa em ug o<html> f proteína / mg de lípido). A escolha da relação P / L depende do objectivo da experiência. <ol><li> Se o objectivo é o de avaliar a actividade da proteína de interesse, em reconstituir alta P / L para maximizar o sinal, uma vez que cada liposoma contém múltiplas cópias da proteína. Para quantificar a actividade e / ou a taxa de transporte unitário da proteína, reconstitua num regime de diluição de Poisson em baixo P / L, de modo que cada vesícula contém, em média, uma proteína. Veja o Passo 7 e Discussão para uma análise mais profunda de quando usar cada regime. </li></ol></li><li> Para determinar os valores de P / L óptimas para os vários esquemas, realizar uma titulação completa da actividade como uma função da concentração de proteína 8,11-13. No entanto, para qualquer proteína para a qual o peso molecular (PM, expressa em kDa) da unidade activa é conhecido os seguintes valores de P / L podem ser utilizados como guesstimates iniciais: pg &quot;/&gt; <img alt="Equação 2" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li> Coloque a mistura de proteína e lípido num tubo de diálise pré-humedecido ou uma cassete. Colocar o dispositivo de diálise num copo contendo 500-1,000x o volume do tampão de reconstituição lípido (isto é, um tampão de L para 1 ml de ressuspensão lipídica) sob agitação suave. <ol><li> Mudança de tampão de 3-4 vezes em intervalos de&gt; 3 h. Em cada mudança solução, lava-se a cassete / tubo e o copo com água destilada e enche o recipiente com tampão fresco a reconstituição. Incluir 1-2 S / N intervalos para a mudança solução. O número exacto e duração da solução muda depende do lípido exacta e detergentes utilizados. </li></ol></li><li> Após a última etapa é concluída, remova os lipossomas a partir do navio de diálise, aliquotar-los em tubos e flash congelá-los em N 2 líquido ou congelar a -80 ° C. </li></ol> 3. A gravação Set-up &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: A gravação de set-up (Figura 2A) consiste de duas câmaras (cilindros de fundo plano, ~ 3-4 ml de volume), um Cl - (veja abaixo) eletrodo, um medidor de pH com um análogo ou saída digital elétrica, um digitalizador e um computador com um software de aquisição apropriado. <ol><li> Ligue o Cl - eléctrodo para o medidor de pH, a saída do medidor de pH para o digitalizador que está ligado ao computador. Inserir o eléctrodo de referência em uma câmara e o fio recodificação no outro (Figura 2B). NOTA: A polaridade dos fios é correto se AV Cal (ver Passo 6.4 e 7.2) é positivo. </li><li> Coloque as câmaras numa placa de agitação com uma barra de agitação na câmara de gravação (Figura 1B). Certifique-se a barra de agitação não toca o eletrodo. </li><li> Ligar as câmaras que utilizam uma ponte de agar (Figura 2B) (KCl 100 mM e 2% de agarose). Guarde as pontes Agar em KCl 100 mM. </li&gt; </ol> 4. Preparação do Cl - Eléctrodo <ol><li> Tome um eletrodo de pH não-funcionamento de idade e -possibly-. Quebrar o revestimento de vidro para revelar completamente os fios de prata. </li><li> Retire cuidadosamente o revestimento dos fios de prata, usando uma lâmina de bisturi. Limpe os fios usando grandes quantidades de H 2 O e EtOH. </li><li> Lugar numa solução saturada de FeCl 3 (ou cloro) até fios são cobertos com um revestimento escuro uniforme de AgCl. </li></ol> 5. Preparação de Unilamelares Vesicles <ol><li> A noite antes das experiências, inchar 1 g de Sephadex G-50 em grânulos de 15 ml de tampão externo (1 mM KCl, 150 mM de K 2 SO 4, ácido cítrico 25 mM, pH 4,5) com agitação suave (não agite) para pelo menos 3 horas à temperatura ambiente antes da sua utilização. Cada experiência requer ~ 3 ml de pérolas inchadas. Manter os grânulos inchados a 4 ° C durante alguns dias no máximo. </li><li> Embora os lipossomas são descongelar à temperatura ambiente, verter em cada coluna de ~ 3 ml de inchados G-50 grânulos. Deixe-os secar por fluxo de gravidade na RT; isso geralmente leva 1-2 min. </li><li> Preparar vesículas unilamelares por extrusão dos proteolipossomas 11 vezes através de um mini-extrusora utilizando um ponto de corte de 0,4 m de Teflon. </li><li> Inserir a coluna em um tubo de plástico de fundo redondo. Gire as colunas para remover o excesso de solução. Centrifugar durante 20-30 segundos a 1400 x g numa centrífuga clínica. </li><li> Descartar escoamento, lugar coluna num tubo de vidro de 13 x 100 mm e adicionar 100 ul de vesículas extrudidas para a coluna. Rotação coluna durante 1 min a 500 xg numa centrifugadora clínica. </li><li> Recolhe ~ 200 ul de fluxo de passagem que vão ser adicionados à câmara de registo no passo 6.5. </li></ol> 6. Efluxo Medição <ol><li> Coloque 2 ml de KCl 100 mM na câmara (terra) de referência, e 1,8 ml de tampão externo (1 mM KCl, 150 mM de K 2 SO 4, 25 mM de ácido cítrico, pH 4,5) para a câmara de registo. O ligeiro desequilíbrio osmótico entre o internoe soluções externas não afeta </li><li> Inicie o programa de aquisição. Deixe a linha de base equilibrar, isso pode levar alguns minutos. </li><li> Uma vez que o sinal atinge uma linha de base estável (os lipossomas são preparados e as colunas de secar), iniciar a gravação (Figura 3A). </li><li> Adicionar 15 ul de uma solução 10 mM de KCl para calibrar o sistema (Figura 2A). </li><li> Adicionar lipossomas. Um pequeno salto pode ser visível devido à remoção incompleta de Cl externo - a partir das proteoliposomes (Figura 3A). Espere até a linha de base se estabilize. </li><li> Adicionar valinomicina (1 ml a 1 mg / ml em EtOH) para iniciar o efluxo (Figura 3A). </li><li> Deixe o efluxo de correr o seu curso de tempo, até que se planaltos (Figura 3A). </li><li> Adicionar 40 ul de 1,5 M β-octilglucósido (β-OG), preparado no tampão externo para dissolver todos os liposomas (Figura 3A). Fim da gravação. </li></ol> 7. Data Análise <ol><li> Exportar o arquivo de rastreamento a partir de um formato ASCII ou texto e importá-lo para o programa de análise de escolha. </li><li> Meça a tensão nos seguintes pontos (Figura 3A): No início da gravação (V 0); Após a adição do impulso de calibração (V cal); Após a adição dos lipossomas (V lipo); No final do efluxo (V fin); Após a adição de detergente (V tot); Linha de base, de modo que as tensões V 0 = 0. </li><li> Utilizar a equação de Nernst-prancha para determinar o valor experimental de <img alt="Equação 3" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" /> medindo <img alt="Equação 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> Onde Vol Cal é o volume do impulso de calibração em ul, 1,800 é o volume da câmara no início da experiência, expresso em1; l, [Cl] cal / in são o Cl - concentrações do pulso de calibração e do buffer externo em mM e AV cal é o salto em mV medido após o pulso de calibração. NOTA: Esta determinação empírica de α serve a três propósitos: ele garante que o sistema está respondendo corretamente, oferece uma medida da consistência da resposta do instrumento entre os experimentos, bem como para verificar se não há erros foram cometidos na tomada de solução. </li><li> Calcular a concentração de Cl após cada passo da seguinte forma: <img alt="Equação 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="Equação 6" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="Equação 7" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> O factor de 3/400 vem da diluição do impulso de calibração 15 ul no volume final de 2.000 mL. </li><li> Calculcomeu as mudanças na [Cl] em cada etapa, ΔCl lipo / fin / tot. </li><li> Converter V (t) em Cl (t) com <img alt="Equação 8" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> Diretamente determinar os valores [CL] nos pontos críticos e compará-los com os valores calculados como um controlo interno. </li><li> Normalizar o traçado de modo que a lipo Cl rel = 0 e Cl tot rel = 1 <img alt="Equação 9" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li> Montar o curso de tempo de efluxo com a seguinte equação: <img alt="Equação 10" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> Onde L é a taxa de Cl - vazamento que é determinada experimentalmente medindo Cl - efluxo de lipossomas livres de proteínas preparadas nas mesmas condições e τ é a constante de tempo do processo. </li><li> Calcular v, a velocidade inicial: Onde ΔCl barbatana é expressa em milimolar e V é o volume da câmara em ul. </li><li> Calcular a taxa de transporte / condutância <img alt="Equação 12" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> Em que p é a relação P / L, MW é o peso molecular do complexo activo, expresso em kDa </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Nós descrevemos um protocolo detalhado para medir Cl - transporte mediado pelos canais de ânion seletivo purificadas ou transportadores reconstituídos em lipossomas. O exemplo utilizado foi o procariotas H + / Cl - Trocador CLC-EC1. No entanto, a metodologia pode ser facilmente adaptada para estudar canais fechados por ligandos 12,13,15, 11,12 tensão, ou que ostentam diferente selectividade aniónico 15,16 substituindo o Ag: AgCl com um adequado para o ião sob consid...

Nas últimas duas décadas, a capacidade para sobre-expressar e purificar proteínas transportadoras de membrana aumentou dramaticamente: canais de iões, os transportadores principal e secundário são rotineiramente purificado a partir de sistemas de expressão heterólogos, bem como as fontes naturais. Novas abordagens para monitorar expressão, melhorar e facilitar a extração e melhoram a estabilidade dessas proteínas estão sendo constantemente desenvolvidos 1-5. Estes avanços tecnológicos têm sido fundamentais para desencadear a explosão de informações estruturais em nível atômico em proteínas de membrana, que, por sua vez, reforçada a nossa compreensão das bases estruturais da sua função. Em contraste, a nossa capacidade para sondar as propriedades funcionais das proteínas purificadas não aumentaram com a mesma velocidade, de modo que, em alguns casos, a informação estrutural de alta resolução é acompanhada pelos dados funcionais qualitativos, limitando assim a capacidade de testar quantitativamente previsões baseadas em estrutura. Assim, o desenvot de ensaios funcionais quantitativos e generalizáveis ​​é um passo fundamental para a elucidação das bases mecanicistas da função da proteína de membrana. Descrevemos aqui um ensaio de efluxo que pode ser utilizado para determinar quantitativamente as propriedades funcionais da purificados e reconstituídos Cl - canais e transportadores. Os princípios subjacentes a ensaio pode ser generalizada para uma variedade de sistemas de transporte, bem como para o transporte de proteínas não-iônicos. Os lipossomas são reconstituídos com purificados Cl - / canal transportadores, na presença de um grande gradiente de Cl - (Figura 1A, B). Cl - efluxo é iniciada pela adição de um ionóforo para permitir fluxo de contra-ião, no nosso caso, o K + ionóforo valinomicina, que desviam a tensão estabelecida pela Cl - gradiente e definir o potencial de membrana inicial do potencial de equilíbrio de K + 6,7. Sem tele não ionóforo Cl líquido significativo - efluxo ocorre, uma vez que é impedida pela geração de um potencial transmembranar. Os dados são descritos quantitativamente por dois parâmetros mensuráveis ​​(Figura 1C): τ, a constante de tempo de efluxo de Cl -, e f 0, a fracção de lipossomas que não contêm uma proteína activa. De τ 0 e f o Cl unitário - a taxa de transporte, a fracção de proteínas activas e a massa molecular do complexo activo pode ser derivado 8. A técnica é ilustrada aqui, usando proteoliposomes reconstituídos com CLC-EC1, um bem caracterizado CLC-tipo H + / Cl - trocador de estrutura e função conhecida. Este ensaio é prontamente generalizado para canais ou transportadores com diferentes selectividade iónica ou cuja actividade depende da presença de tensão e / ou ligantes. Além disso, este ensaio pode ser usado para determinar se as moléculas pequenas afectar directamente a proteína reconstituída,para quantificar os efeitos destes compostos e composição como membrana ou reagentes modificadores de lípidos afectar a função dos canais reconstituídos e transportadores.

<table><tbody><tr><td>Lipossomizador, Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>&nbsp; Avanti Lipídios Polares Inc.</td><td>610200</td><td></td></tr><tr><td>IEC Centra CL2 Bancada</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orion Research Modelo 701A Medidor</td><td></td><td></td> digital de pH-mV <td>Estes podem ser encontrados no Ebay.</td></tr><tr>Sonda <td></td><td></td><td>de pH não funcional</td><td>Qualquer sonda de medidor de pH com fios de prata funcionará. O revestimento de vidro/plástico precisa ser removido e os fios limpos.</td></tr><tr><td>DI-710 Data Logger</td><td>DATAQ instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WinDAQ acquisition software</td><td>DATAQ instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce Colunas de plástico descartáveis, fluxo de gravidade, 2ml</td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td> <td>29922</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura KIMBLE, descartáveis, vidro borossilicato</td><td>Kimble Chase</td><td>73500-13100</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de extrusora com suporte / bloco</td> <td>de aquecimentoAvanti Lipídios Polares Inc.</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Computador</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a proteolipossoma-based efluxo ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de cl<sup&gt; -</sup&gt; canais e transportadores

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Os últimos 15 anos foram caracterizados por uma explosão na capacidade de superexpressar e purificar proteínas de membrana de organismos procarióticos, bem como de eucariotos. Esse aumento foi amplamente impulsionado pelo esforço bem-sucedido para obter informações estruturais sobre proteínas de membrana. No entanto, a capacidade de interrogar funcionalmente essas proteínas não avançou na mesma taxa e muitas vezes é limitada a ensaios qualitativos de valor quantitativo limitado, limitando assim os insights mecanicistas que eles podem fornecer. Um ensaio para investigar quantitativamente a atividade de transporte de canais ou transportadores de Cl reconstituídos é descrito. O ensaio é baseado na medida da taxa de efluxo de Cl- de proteolipossomas após a adição do ionóforo K + valinomicina para desviar o potencial de membrana. Um eletrodo sensível a íons é usado para seguir o curso do tempo do efluxo de íons de proteolipossomas reconstituídos com a proteína desejada. O método é altamente adequado para estudos mecanísticos, pois permite a determinação quantitativa das principais propriedades da proteína reconstituída, como sua taxa de transporte unitário, a fração de proteína ativa e a massa molecular da unidade funcional. O ensaio também pode ser utilizado para determinar o efeito de compostos de moléculas pequenas que inibem / ativam diretamente a proteína reconstituída, bem como para testar os efeitos moduladores da composição da membrana ou reagentes modificadores de lipídios. Sempre que possível, a comparação direta entre os resultados obtidos usando este método foi encontrada em boa concordância com aqueles obtidos usando abordagens eletrofisiológicas. A técnica é ilustrada usando CLC-ec1, um trocador H+/Cl- do tipo CLC, como sistema modelo. O ensaio de efluxo pode ser utilizado para estudar qualquer canal/transportador condutor de Cl e, com alterações mínimas, pode ser adaptado para estudar qualquer proteína transportadora de íons.

Nós descrevemos um protocolo detalhado e robusto para medir Cl - transporte mediado por purificada CLC-EC1, um procariota CLC-tipo H + / Cl - trocador, reconstituída em lipossomas. Uma representação esquemática da experiência é mostrado na Figura 3 proteoliposomes reconstituídos com CLC-purificada contendo EC1 e alta - Cl interno. São imersos numa solução de banho que contém baixo Cl -. Sob estas condições Cl líquido - efluxo é impedida p...

Os proteolipossomas são usados para estudar canais purificados e transportadores reconstituídos em um ambiente bioquímico bem definido. Um procedimento experimental para medir o efluxo mediado por essas proteínas é ilustrado. As etapas para preparar proteolipossomas, realizar os registros e analisar os dados para determinar quantitativamente as propriedades funcionais da proteína reconstituída são descritas.

A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canais e Transportadores

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar quantitativamente a atividade de transporte de canais ou transportadores de cloreto reconstituídos. Isso é realizado primeiramente reconstituindo o transportador purificado em lipossomos com baixa densidade, de modo que cada lipossomo contenha zero ou uma cópia do complexo ativo. Após a remoção dos íons cloreto externos, de forma a criar um gradiente iônico direcionado para fora, os lipossomos são adicionados à câmara de registro, onde a concentração de cloreto é monitorada utilizando um eletrodo sensível ao cloreto. Em seguida, o fluxo de cloreto proveniente dos lipossomos é iniciado pela adição de Val Micina, um ionóforo de potássio, que alivia o potencial de membrana.Uma vez que o sinal atinge o estado estacionário, o experimento é encerrado pela adição de detergente para dissolver as lipossomas. Em última análise, ao medir a taxa de saída de cloreto de lipossomas proteicos, reconstituídos com um canal ou transportador purificado, é possível determinar quantitativamente a taxa de transporte unitária e a estequiometria do complexo proteico ativo. A principal vantagem desta técnica em relação a outras abordagens existentes, como medições de fluxo baseadas em fluorescência, é que com esta técnica é possível determinar quantitativamente parâmetros-chave do transportador reconstituído, tais como a taxa unitária de turnover e a geometria do complexo.Além de fornecer medidas quantitativas desses parâmetros-chave, este método pode ser usado para determinar rapidamente e com precisão o efeito de mutações, moléculas pequenas e monitorar subunidades na proteína de transferência reconstituída. O conjunto de gravação consiste em duas câmaras, um eletrodo de cloreto, um medidor de pH com saída elétrica analógica ou digital, um digitalizador e um computador com software apropriado de aquisição. Conecte o eletrodo de cloreto ao medidor de pH, depois conecte a saída do medidor de pH ao digitalizador, o qual está conectado ao computador.Coloque o eletrodo de referência em uma câmara e o fio de gravação na outra. Em seguida, posicione as câmaras sobre uma placa de agitação, com o bastão de agitação na câmara de gravação. Certifique-se de que o bastão de agitação não toque o eletrodo.Conecte as câmaras utilizando uma ponte de ágar na noite anterior aos experimentos. Hidrate um grama de perlas Cidex G 50 em 15 mililitros de tampão externo com agitação suave por pelo menos três horas à temperatura ambiente antes do uso. Cada experimento requer aproximadamente três mililitros de perlas hidratadas enquanto os lipossomos estão descongelando à temperatura ambiente. Despeje aproximadamente três mililitros de perlas G 50 hidratadas em cada coluna.Deixe-os secar por gravidade. Flua à temperatura ambiente. Isso geralmente leva um a dois minutos.Em seguida, prepare vesículas ular extrudindo os lipossomos protea 11 vezes através de um extrusor miniatura utilizando um corte de teflon de 0,4 mícron. Em seguida, coloque a coluna em um tubo cônico de plástico e centrifugue por 20 a 30 segundos a 1400 G em uma centrífuga clínica para remover a solução em excesso. Após isso, protegendo o fluxo de saída, coloque a coluna em um tubo de vidro de 13 por 100 milímetros e adicione 100 microlitros das vesículas extrudidas à coluna.Gire a coluna por um minuto a 500 G. Em uma centrífuga clínica, colete aproximadamente 200 microlitros do fluxo passante, que será adicionado à câmara de gravação. Para realizar a medição de efluxo, coloque dois mililitros de cloreto de potássio 100 milimolar na câmara de referência e 1,8 mililitro do tampão externo na câmara de gravação. Inicie o programa de aquisição.Deixe a linha de base equilibrar. Isso pode levar alguns minutos. Quando o sinal atingir uma linha de base estável, inicie o registro.Adicione 15 microlitros de uma solução molar marrom de cloreto de potássio para calibrar o sistema. Em seguida, adicione lipossomos. Um pequeno salto pode ser visível devido à remoção incompleta do cloreto externo dos lipossomos proteicos.Aguarde até que a linha de base se estabilize. Em seguida, adicione CIN para iniciar o flx. Deixe o FLX seguir seu curso temporal até atingir um platô.Neste ponto, adicione 40 microlitros de beta-Octa-glucocídeo 1,5 molar preparado no tampão externo para dissolver todas as lipossomas. Em seguida, aguarde de 10 a 15 segundos. Encerre o registro e prossiga para a análise de dados conforme descrito no protocolo textual.Quando lipossomos contendo cloreto interno elevado são imersos em meio com baixo teor de cloreto, gerando um gradiente de cloreto de 300 vezes, não se observa fluxo iônico líquido. Isso ocorre porque os lipossomos livres de proteínas apresentam baixa permeabilidade intrínseca a íons. Nenhum FLX macroscópico é observado em lipossomos prot com o transportador de cloreto acoplado a prótons, C-L-C-E-C um.Como a pequena quantidade de cloreto que sai do vesículo gera uma carga positiva líquida no lipossomo, a adição de CIN permite que íons potássio se movam através da membrana, aliviando o potencial elétrico e iniciando o fluxo de cloreto. A reação é interrompida e a quantidade total de íons cloreto contida nas vesículas é medida para determinar as propriedades das proteínas individualmente reconstruídas. Os dados brutos do curso temporal do efluxo são primeiro convertidos de milivolts para uma concentração de cloreto e, em seguida, normalizados; o curso temporal é então ajustado.Constatou-se que a constante de tempo do efluxo é de 41 segundos e a fração de lipossomos contendo zero cópias ativas de C-L-C-E-C um é de 0,31, indicando que aproximadamente um terço dos lipossomos contém zero proteínas ativas. A partir desses valores e da medição do conteúdo de cloreto em vesículas contendo pelo menos uma cópia de C-L-C-E-C um, é possível determinar uma taxa unitária de transporte de C-L-C-E-C um igual a aproximadamente 2.500 íons de cloreto por segundo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a taxa de renovação de um transportador. Esses experimentos podem ser realizados em 10 a 15 minutos quando executados com cuidado.É fundamental avaliar cuidadosamente a qualidade dos lipossomos, pois vazamentos afetam negativamente as estimativas da taxa de renovação.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós introduzimos um ensaio de fluorescência baseada rápido que monitora a taxa de extinção de fluorescência como uma medida da atividade do canal gramicidin. Os canais gramicidin são usados ​​como transdutores de força molecular para monitorar as mudanças nas propriedades bicamada lipídica como sentiu por proteínas bicamada de expansão.

Gramicidina baseado em Ensaio de fluorescência; para determinar Moléculas Pequenas Potencial para Modificação de Propriedades bicamada lipídica

Este protocolo de detalhes um método para a medida quantitativa da translocação de peptídeos em grandes vesículas lipídicas unilamelares. Este método também fornece informações sobre a taxa de translocação de membrana e pode ser usado para identificar peptídeos que de forma eficiente e espontânea cruz bicamadas lipídicas.

Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

Nós apresentamos um protocolo para a investigação in vitro de bombas de efluxo de Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo permite a geração de um gradiente de protões robusto, reversível, e ajustável dentro da membrana do lipossoma e, portanto, deve ser adaptável a qualquer proteína da membrana energizado pela força protomotive.

In vitro Investigação do MexAB efluxo Bomba De Pseudomonas aeruginosa

Descrito aqui é um procedimento rápido e eficaz para a reconstituição funcional da purificado do tipo selvagem e proteína CFTR mutante que preserva a atividade para este canal de cloro, que está com defeito na Fibrose Cística. Efluxo de iodeto de proteoliposomes reconstituídos mediadas por CFTR permite estudos da atividade do canal e os efeitos de pequenas moléculas.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

O protocolo apresentado descreve a análise do transporte mediado por proteínas de membrana no nível do transportador único usando bicamadas lipídicas livres de solvente que abrangem os poros. Isso é alcançado pela criação de chips de matriz de nanoporos produzidos em massa, combinados com aquisição e análise de dados altamente paralelas, permitindo o estabelecimento futuro de telas efetoras de proteínas de membrana.

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Descrevemos um ensaio baseado em fluorescência para medir o embaralhamento de fosfolipídios em grandes lipossomas unilamelares reconstituídos com opsina.

Um ensaio baseado em fluorescência de Fosfolípido scramblase Atividade

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o mecanismo molecular de translocação de prótons através das membranas lipídicas de lipossomas único, usando citocromo bo3  como exemplo. Combinando a eletroquímica e microscopia de fluorescência, mudanças de pH no lúmen do única vesículas, contendo uma única ou várias enzimas, podem ser detectados e analisados individualmente.

Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

Este protocolo descreve a fabricação de lipossomas e como estes podem ser imobilizados em uma superfície e imagemindividualmente de uma forma paralela maciça usando microscopia de fluorescência. Isso permite a quantificação do tamanho e inhomogeneidade composicional entre os lipossomos únicos da população.

Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

Os nano corpos são importantes ferramentas na biologia estrutural e representam um grande potencial para o desenvolvimento de terapias. No entanto, a seleção de nano corpos com propriedades inibitórias pode ser desafiadora. Aqui demonstramos o uso de eletrofisiologia baseada em membrana sólida (SSM) para a classificação de nano corpos inibitórios e não inibitórios visando transportadores de membrana eletrogênica.

Seleção de nanomá corpos inibitórios direcionados ao transporte por eletrofisiologia baseada em membrana sólida (SSM)

Apresentamos um método econômico para avaliar a permeabilidade da membrana lipossomal com sensibilidade e resolução superiores às técnicas convencionais. Usando uma nova reação de substituição de ligante encapsulada, esta técnica detecta alterações induzidas pela fosfolipase A2 nas membranas do modelo. Facilmente integrada com análises padrão, essa abordagem acessível melhora a resolução para estudar a biofísica da membrana e as interações de toxinas.

Um ensaio de permeabilidade de membrana lipossomal para investigar os efeitos dos grupos fosfato de fosfatidilinositol na ação membranotrópica do veneno PLA2

Aprenda a medir a atividade de transporte de canais de cloreto reconstituídos em proteolipossomas usando eletrodos sensíveis a cloreto. Este método permite determinar a taxa de turnover unitário e a estequiometria do complexo proteico ativo.

A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl

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