Name: Tetracistronicミニゲノムを含むウイルス様粒子とバイオセーフティレベル2の条件の下ではエボラウイルスのライフサイクルのモデル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学ぼう、エボラウイルスのライフサイクルを安全にモデル化する方法。trVLPを用いてバイオセーフティレベル2の条件下でウイルス複製と遺伝子発現を解析し、感染症研究の新たな可能性を開きます。

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著者は、ボブ·フィッシャー（LV、DIR、NIAID、NIH）、ナレーターを務めただけでなく、オースティンAthman（RTB、DIR、NIAID、NIH）とミーガン·モーガン（DOHS、ORS、OD、NIH）のために非常に感謝していますこの原稿を伴う映画を作る際の彼らの助け。さらに、私たちは原稿の重要な読書のためのアリソンGroseth（LV、DIR、NIAID、NIH）を感謝したいと思います。この研究は、NIH、NIAIDの学内研究プログラムによってサポートされていました。

trVLPsの初期生産のためのプロデューサー細胞の1分割<ol><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）、2mMのL-グルタミン、および1×ペニシリン/ストレプトマイシンを備えた高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で2フラスコ（75 cm単位293細胞培養80〜90％コンフルエントからDMEM10の培地を除去）。細胞を取り除く、そして細胞は2 mlトリプシン-EDTAを加えることがないように注意しながら10mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回細胞を洗浄する。 </li><li>顕微鏡（約30秒）の下で観察すると、細胞が重要なの丸めを示すまで、室温で細胞をインキュベートする。フラスコをタップして、細胞を取り除くと、8ミリリットルDMEM10を追加します。徹底的に穏やかにピペッティングすることにより細胞を再懸濁し、ダウン顕微鏡下で見たときに、単一細胞懸濁液が観察されるまで。 </li><li>自動細胞カウンターを用いて細胞を数える。 DMEM10 1ml当たり2×10 5個の細胞に細胞を希釈する。ピペットウェルあたり6ウェルプレート（4×10へ細胞懸濁液を2mlウェル当たり5細胞）。 </li><li> 5％のCO 2、37℃で加湿した組織培養インキュベーター中で培養する。 </li></ol> trVLPsの初期生産のためのプロデューサー細胞のトランスフェクション2。 <ol><li>フィルタリングのヒントを使用して、無菌の2ミリリットルに細胞を分割した後、24時間（実験タイミングの概要については図5を参照）、ピペットプラスミドDNA 15（金額については表1を参照）クリオバイアル。 DNAにウェルあたり100μlのOptiMEMを追加します。簡単に混合物をボルテックスし、優しくフュー​​ジを使用してチューブをスピンダウン。いくつかのウェルは、同一のプラスミドでトランスフェクトされる場合、いくつかのウェルについてのマスターミックスを作製することができる。 </li><li>簡単に言えば、使用前にトランジットLT1でバイアルをボルテックス。希釈したDNAにウェルあたり7.5μlのトランジットLT1を追加します。静かにクリオバイアルの蓋に液体を収集しないように注意しながら、混合物をボルテックスし、室温で15分間インキュベートする。 </li><li>静かにトランスフェクションをミックス上下にピペッティングすることにより、複雑な。滴下各ウェルにトランスフェクション複合体を100μlを追加します。トランスフェクション複合体を分散させる左右に前方/後方および側方からプレートを揺する。これはトランスフェクション複合体の広がりが不均一原因となるため、プレートを旋回しないでください。 </li><li>インキュベーターにセルを返します。 </li><li> 24時間後、細胞から上清を除去。 5％のFBS、2mMのL-グルタミン、細胞に1×ペニシリン/ストレプトマイシン（DMEM5）で4ミリリットルDMEMを加える。この手順は、交差汚染が問題になることができる井戸が原因でこのシステムのtrVLPsの自己増幅する性質のために、そうでない（同一のサンプルを含むと仮定すると、井戸の乾燥させずに一度に最大3つのウェルのために行うことができ、このステップ）は、一度に一つの井戸を行う必要があります。 </li><li>インキュベーターにセルを返します。 </li></ol>標的細胞の調製<ol><li>ウェル当たり2ミリリットルDMEM10に4×10 5個の細胞を播種し、セクション1で説明したように293細胞を分割6ウェルプレート。 </li><li>標的細胞の分裂後24時間で、感染の24時間前に、DNAを用い項2に記載のようにトランスフェクトした標的細胞は、 表1の量、およびウェルあたり4.5μlのトランジットLT1。 </li></ol>プロデューサー細胞の標的細胞と収穫の4。感染<ol><li> 15ミリリットルチューブにプロデューサー細胞からの上清を移す。バキュームホースを使用して、任意の残りの上清を取り出し、廃棄します。細胞に250μlのグロ溶解バッファーを追加します。 </li><li>細胞破片のサンプルをクリアする800×gで、室温で5分間遠心上清。 </li><li>標的細胞の1つのウェルからの上清を取り除きます。注意深くピペット最も遅い速度を使用して、標的細胞へのクリアプロデューサー細胞上清を3mlを加える。細胞単層を破壊することを避けるために、細胞上に直接ピペッティングは避けてください。このステップは、 一度に一つのウェルを行わなければならない。 </li><li>すべてのサンプルはトランスされているときferred、trVLPsおよび標的細胞の感染の沈降を可能にするためにインキュベーターに標的細胞を返す。 </li><li>グロ溶解緩衝液中で室温でのインキュベーションの15分後、150μlに設定マイクロピペットを用いて溶解緩衝液中でプロデューサー細胞を再懸濁し、クリオバイアル2ミリリットルに試料を移す。この時点で、溶解物を-80℃で凍結するか、直接項6に記載のように測定することができる。 </li><li>感染後24時間では、標的細胞から上清を除去。細胞にウェルあたり4ミリリットルDMEM5を追加します。井戸が原因でこのシステムのtrVLPsの自己増幅特性により、交差汚染が問題になることができ、このステップがあるべき、そうでない（同一のサンプルが含まれている場合、この手順は、一度に最大3つのウェルについて行うことができます一度に一つの井戸をして）。 </li></ol>シングルサイクル感染のための標的細胞の5収穫<ol><li>単一の感染サイクルは、感染削除tの後72時間で、評価すべきである場合には彼は真空ホースを使用して、標的細胞からの上清。 </li><li>プロデューサー細胞は、セクション4で説明したように250μlのグロ溶解緩衝液中で細胞を収穫。 </li></ol> 6。標的細胞の収穫とtrVLPsの連続継代<ol><li> trVLPsが連続的に継代される場合、それらは、標的細胞（ 図5参照）の第一のセットの感染後、感染72時間の準備ができているように、セクション3で説明したように、標的細胞の新しいセットを準備する。 </li><li>セクション4で説明したように（プロデューサー細胞の代わりに、標的細胞の第一のセットを使用して）標的細胞の新しいセットを感染させる。 </li><li>これらのステップごとに72時間を繰り返します。 </li></ol>レポーター活性の7分析<ol><li>細胞溶解物を凍結した場合、室温でそれらを解凍する。サンプルは測定前に室温に達したことを確認してください。 </li><li>ウミシイタケGloアッセイバッファー（理想的に凍結され、iの必要量（サンプルあたり40μl）を解凍室温でのn個の分量）。バッファは測定前に室温に達していることを確認してください。 </li><li>ウミシイタケGlo試薬を得るために、ウミシイタケGloアッセイバッファーにウミシイタケグロ基板の100分の 1のボリュームを追加し、ボルテックスで混和する。ピペット白色96ウェルプレートにウミシイタケGlo試薬40μlの。 </li><li>ウミシイタケ-Glo試薬にサンプルを40μlを加える。その後、10分待つ1秒の積分時間を用いて、ルミノメーターでサンプルを測定する。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

この原稿に記載されtetracistronic trVLPアッセイは、いくつかの感染サイクルにわたってエボラウイルスのライフサイクルのモデル化を可能にする。重要なのは、このシステムで生産さtrVLPsは一緒にエボラウイルスゲノムのほぼ60％を構成し、ウイルスの複製に必須であるヌクレオカプシドタンパク質NP、VP35、VP30、およびL、遺伝情報が含まれていません。むしろ、これらのタンパク質は、発現プラスミドからトランスでの標的細胞に設ける必要はなく、これらのタンパク質のすべての4を発現する細胞の任意の感染は不稔である。重要なことは、フィロウイルスのための遺伝子組換えの証拠はない、とtetracistronicミニゲノム及びヌクレオカプシドタンパク質のための発現プラスミドの間で共有なかっ相同領域はありません。したがって、任意の実用的な証拠も潜在的に原因となり、全長エボラウイルスゲノムを生成する可能性を提供する可能性のある理論的根拠もないとされている感染エボラウイルスの産生、BSL2条件下での使用のためにこのシステムを安全にすること。 つの重要なtrVLPsの産生、すなわち 、実験条件によって影響を受けるtetracistronic trVLPアッセイの手順、およびこれらのtrVLPsによる標的細胞の感染がある。 trVLPsの生産は、今度は、高いトランスフェクション効率に依存する、ミニゲノム複製および転写の高いレベルに依存している。トランスフェクション効率を容易L発現プラスミドは、eGFPをコードする発現プラスミドのために交換される-Lコントロールを含めることによって評価することができる。これらの条件下でトランスフェクション率は、トランスフェクションの24時間ポスト蛍光顕微鏡で検査することによって50％を超えている必要があります。私たちの経験ではマイコプラズマ汚染が劇的ミニゲノム複製および転写（未発表データ）を損なうので、細胞は、マイコプラズマがないことがあります。その高いトランスフェクション能力293 CEへLLSはtrVLPアッセイのために選択される細胞株である。しかしながら、これらの細胞は、エボラウイルス16感染に（完全に屈折しないが）比較的乏しい感受性である。そのようなTIM-1などの接着因子の発現は、約100倍trVLPsで293細胞の感染を高め、数継代にわたってこのシステムの成功のために不可欠である。 tetracistronic trVLPsが自分自身で自己複製ではありませんが、彼らはヌクレオキャプシドタンパク質を発現する細胞内で自己複製します。そのため、予防措置は（ミニゲノム中の異なる変異を有するなど ）が異なるtrVLPsを含むウェル間のクロスコンタミネーションを回避するために行う必要があります。より技術的な観点から、原因は、このアッセイで正と負の信号間の差が大きい（約4ログ）に、サンプル間のクロストークルシフェラーゼ活性を測定する場合には問題となることがあります。しかし、これは簡単には、各試料間の1つの空のウェルを残すことによって回避することができるルシフェラーゼ活性を測定するために使用される96ウェルプレート。 tetracistronic trVLPsの可能な多数のアプリケーションがあります。感染trVLPs、感染フィロ14の典型的な糸状構造であり、フィロウイルス粒子と同じウイルス成分が含まれているため、明らかに、それらは、フィロウイルス粒子の侵入を研究によく適している。偽型ウイルス粒子またはレトロウイルスGP 1,2を有する粒子、またはそのようなGP 1,2を発現する組換え水疱性口内炎ウイルスなどの組換えウイルスのようなウイルス様粒子を使用するときの場合のように重要なのは、それらは、他のウイルスの成分を含まない。付着因子の要件この系における標的細胞、293細胞を用いて、画面に活用し、このような結合因子の役割を研究することができる一方、そのようなゲノムの複製と転写に関与するものなどの他の細胞因子の役割、ならびに形態形成および芽鼎は、RNAi技術を使用して調べることができる。一つはVP40、GP 1,2、およびVP24がウイルス転写後に発現している間、他のウイルスタンパク質の発現は、式から達成されていることを心に留めておく必要がありますが、ウイルスのライフサイクル上のウイルスタンパク質における変異の効果も、研究することができるプラスミドを、これらのタンパク質の過剰発現に起因する影響を考慮しなければならないようにする。また、ケアはレポーター活性を直接ミニゲノム長さ15の影響を受けるため、ミニゲノムの変異が大きく、ミニゲノムの長さを変えないように注意すべきである。 tetracistronicミニゲノムは、ウイルス遺伝子を運ぶウイルスゲノムの類似体であり、ウイルスポリメラーゼ複合体により複製されるので、最後に、それはまた、BSL2条件下での突然変異に応じて、これらの遺伝子の進化を研究することが可能であるべきである。さらなる研究はまだこの方向に必要とされるつつ、それが可能であるべきであり、例えば、準最適導入するミニゲノム内の遺伝子に突然変異した後、通路trVLPs無料の変異が現れるまで。 留意しなければならないtetracistronic trVLPアッセイの1つの制限は、モデルウイルスのライフサイクルのほとんどをしながら、標的細胞は、トランスにおけるヌクレオキャプシドタンパク質を発現する必要があるため、標的細胞の一次転写が、このシステムによってモデル化されていないという事実であるtrVLPsが複製するためには。一次転写を評価する必要がある場合には、ナイーブ標的細胞10を使用することが可能である。ただし、この場合には、ゲノムの複製は、標的細胞内で行われず、これ以上の感染trVLPs、感染を中止し、生産されていません。これは事実上の感染性組換えエボラウイルスに変えるだろうミニゲノムへのヌクレオカプシド蛋白質の遺伝子を含むことによって、完全に自己複製をtrVLPsをレンダリングせずに克服することができない主要な問題である。実際には、Ebolルシフェラーゼまたは他のレポーターが生成されたと評価し、ゲノムの複製および転写17,18を研究するために利用することができる発現するウイルス;しかしながら、それらの使用はBSL4研究所に制限される。また、VP40、GP 1,2、およびVP24がウイルスゲノムアナログから発現している間、ミニゲノム内の位置（ 第2、第3、および第 4の転写ユニット）と同一ではないことに留意する必要がある互いに対してそれらの絶対的な発現レベル、ならびにそれらの相対的な発現レベルに影響を与える可能性があり、ウイルスゲノム内の位置（3 番目 、4 番目 、および6 番目の転写単位）。 全体的に、tetracistronic trVLPアッセイは、これまでの利用可能なエボラウイルスのための最も包括的なライフサイクルモデリングシステムを表し、添付ファイルと専用だけでなく、ゲノムの複製および転写、粒子形態形成および出芽のモデリングを可能にする複数の感染サイクルにわたって標的細胞にしてみてください。このように、BSL2条件下でエボラウイルスの生物学を調査に使用するための多大な可能性を秘めている。

エボラウイルスは、人間の集団発生1で最大90％の致死率を持つヒトおよび非ヒト霊長類において重篤な出血熱の原因物質である。 （2,3にレビュー）、ワクチンだけでなく、具体的な治療法の開発に近年では大きな進展があったが、これらは、ヒトへの使用が承認されていない。エボラウイルス粒子は、約1μmの長さが特徴的な糸のような外観と96から98 nmの4の直径を有する。ヌクレオカプシド形ウイルス粒子のコア及び1からなる）7エボラウイルス遺伝子をコードする非セグメント化一本鎖ネガティブセンスRNAゲノム（ 図1）、ゲノムをキャプシド2）核タンパク質NP、3 ）ポリメラーゼLとその補因子VP35からなるウイルスポリメラーゼ複合体、及び4）転写アクチベーターVP30。また、最近では、タンパク質VP24はまた、ヌクレオキャプシドと関連していることが示されている秒4。ヌクレオカプシドは、ビリオンの形態形成および出芽に関与するマトリックスタンパク質VP40は、配置されるマトリクス空間に囲まれている。ウイルス粒子は、さらに、エンベロープ、およびそのエンベロープに埋め込 ​​まれているビリオンの付着およびエントリに関与する唯一の表面タンパク質GP 1,2、である。 感染エボラウイルスでの仕事は、世界中のいくつかの施設にこの仕事を制限するバイオセーフティレベル（BSL）4条件下最大封じ込め実験室で行われなければならない。これらのウイルスの生物学を研究するため、またはBSL2条件下での新規治療薬を開発するために、研究者は、エボラウイルスタンパク質の組換えの過剰発現に、または感染性エボラウイルスの非存在下で加工することができるどちらもライフサイクルモデリングシステム、のいずれかに依存している。エボラウイルスタンパク質の組換え発現のいずれかの発現プラスミドまたはウイルスベクターから達成される。この戦略の特殊なケースである組換え的に研究することができるシュードタイピング粒子の生成につながる、GP 1,2表現の存在下で、ビリオンまたはエボラウイルス以外のウイルスに基づくウイルス様粒子の生成（最も一般的に口内炎ウイルス、レトロウイルスまたは水疱）侵入阻害剤5用のフィロウイルス、画面の入力プロセス。あるいは、独自の糖タンパク質の代わりに、エボラウイルスGP 1,2をコードする組換えウイルス（ 例えば 、水疱性口内炎ウイルス）が生成され、バイオセーフティーレベル2の条件6の下のウイルス侵入を研究するために使用することができる。 ライフサイクルモデリングシステムは、最初にcDNAから産生され、その後複製さトランスで提供エボラウイルスタンパク質によって転写される短縮型エボラウイルスゲノム類似体（ミニゲノム）の使用を特徴とする逆遺伝学系の形態である。エボラウイルスの最初のミニゲノムシステムは15年以上前に開発された7、および以降エボラウイルスゲノムの複製および転写（8,9に概説）を研究するために使用されている。このシステムでは、エボラウイルスゲノムの末端非コード領域に隣接し、単一のレポーター遺伝子から成るモノシストロンミニゲノムは、（T7のRNAポリメラーゼを用いて、通常の転写によって）哺乳動物細胞中で発現される（ 図1）（リーダーおよびトレーラーと呼ばれる）一緒にウイルスタンパクL、VP35、VP30およびNPと。ミニゲノムは、NPによってキャプシド化した後、複製され、ウイルスのライフサイクル（ 図2）、これらの二つの側面を反映しているレポーター活性につながる、リーダーおよびトレーラーに局在シス作用シグナルを使用して他のヌクレオカプシドタンパク質によって転写される。 ウイルスライフサイクルの追加の手順をモデル化するためには、転写および複製能力のあるウイルス様粒子（trVLP）システムは、古典的なミニゲノムシステムに基づいている、開発したが、Aを備えていてきた発現プラスミド10,11から他のウイルスタンパク質VP24、VP40およびGP 1,2のdditional式。 VP40の存在は、それらの表面上にGP 1,2を負担trVLPsの形成をもたらし、内側のミニゲノムを含むヌクレオカプシドを運ぶ。これらtrVLPs、 すなわち （trVLPs 11内の標的細胞に持ち込まミニゲノムの複製および転写を容易にするために、いずれかのL、VP35、VP30およびNPのための発現プラスミドでpretransfectedされた標的細胞を感染させるために使用される、またはナイーブ標的細胞であることができるエボラウイルスタンパク質のプラスミド-駆動発現なし）10。これは、trVLPsのプロデューサー細胞、形態形成および出芽においてミニゲノムの複製を反映して、標的細胞におけるレポーター活性をもたらす標的細胞への侵入、および1）pretransfected標的細胞の場合には、複製および二次転写（ゲノムウイルスタンパク質のprodによるすなわち転写uced）標的細胞内、標的細胞内、または2）また、ナイーブ標的細胞trVLPs内の標的細胞に持ち込まウイルスタンパク質）（ 図3）による一次転写（ すなわち 、転写の場合。これらのタンパク質は、ゲノム複製の強力な負の調節因子であることが示されているので、重要なことに、これらのシステムは、単一の感染サイクルをモデル化し、VP24およびVP40の場合に特に問題となる全てのウイルスタンパク質の過剰発現に依存することに使用されているプラスミド12,13から過剰発現し転写。さらに、これらのシステムで生成さtrVLP調製物は、感染trVLPs 14の生化学的解析のための課題を提起、非感染性粒子の割合が高いが含まれています。 これらの問題を克服するために、本 ​​発明者らは最近、レポーター遺伝子に加えて、VP40、GP 1,2とをコードする遺伝子が含まれ、tetracistronicミニゲノムシステムを開発したVP24（ 図1）。古典的なモノシストロニックミニゲノムシステムと同様に、このシステムは、（ 図4）15標的細胞に感染することができるtrVLPsの産生をもたらす。しかし、古典的なミニゲノムシステムとは対照的に、VP40、GP 1,2、およびVP24ではなくプラスミドから過剰発現されるよりも、ウイルスゲノムの転写後に生成される。その結果、これらのタンパク質の動態および発現レベルは、はるかに密接にウイルスライフサイクル中に見られるものを模倣し、したがって非感染性trVLPsへの感染の割合は、このシステム15において約500倍増加している。さらに、このシステムを使用して、連続的継代tetracistronicミニゲノム含有trVLPsを、複数の感染サイクルをモデル化することが可能であった。このように、tetracistronic trVLPsは現在、BSL2条件でエボラウイルスの生物学を研究するために利用できる最も包括的なライフサイクルモデリングシステムである。ここでは、使用O上の詳細な情報を提供するこのシステムFだけでなく、期待される結果について。

<table><tbody><tr><td>75 cm2 細胞培養フラスコ</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430641</tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6546</td><td>を 37°C に予熱します。C 使用前の</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td>熱不活性化30分@ 56°;C</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>25030-081</td><td>100x</td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 15070-063</td><td>100x</td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4、 H2Oは1 Lを追加します。オートクレーブと室温での保存&nbsp;</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>Glo 溶解バッファー</td><td>Promega</td><td>E2661</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Glo ルシフェラーゼアッセイシステム</td><td>Promega</td><td>E2720</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルアッセイプレート(白)</td><td>Costar</td><td>3912</td><td></td></tr><tr><td>弾性率マイクロプレートルミノメーター</td><td>Turner Microsystems</td><td>998-9300</td><td></td></tr></tbody></table>

tetracistronicミニゲノムを含むウイルス様粒子とバイオセーフティレベル2の条件の下ではエボラウイルスのライフサイクルのモデル化

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

エボラウイルスは、90％と高い致死率で、ヒトおよび非ヒト霊長類において重篤な出血熱を引き起こす。があり、これらのウイルスに起因する疾患のための認可されたワクチンまたは特定の治療法はなく、感染性エボラウイルスでの作業が大幅にこれらのウイルスの研究を制限し、バイオセーフティーレベル4の研究室に限定されています。ライフサイクルモデリングシステムモデルバイオセーフティーレベル2の条件下で、ウイルスのライフサイクル;しかしながら、最近まで、そのようなシステムは、ウイルスのライフサイクルの各局面、または単一の感染サイクルのいずれかに限られていた。形態形成に関与Tetracistronicエボラウイルス非コード領域、レポーター遺伝子から成るミニゲノム、三エボラウイルス遺伝子、出芽、エントリ（VP40、GP 1,2、およびVP24）は、複製および転写を製造することができるこれらのミニゲノムを含む-competentウイルス様粒子（trVLPs）。これらtrVLPsは継続的にエボラを発現する細胞に感染することができます私たちは安全にバイオセーフティーレベル2の条件で複数の感染サイクルをモデル化することができ、ゲノム複製および転写を担うウイルスタンパク質、。重要なことは、このシステムのウイルス成分は、単独で（例えば、偽型ウイルスを使用するシステムの場合のように）、エボラウイルス由来ではなく、他のウイルスから誘導され、VP40、VP24およびGP 1,2は、このシステムにおいて過剰発現されていないこのようなゲノム複製および転写などのウイルスのライフサイクルの他の側面もこのシステムをモデル化することができますが、形態形成、出芽し、エントリを研究するために理想的に適して作る。したがって、tetracistronic trVLPアッセイはエボラウイルスの最も包括的なライフサイクルモデリングシステムであり、将来的にはエボラウイルスの生態を調査に使用するための非常に大きな可能性を秘めています。ここでは、このシステムの使用上だけでなく、期待される結果に関する詳細な情報を提供します。

エボラウイルスヌクレオタンパク質NP、VP35、VP30、およびL、ミニゲノムの複製と転写および72時間で容易に検出可能であるレポーター活性のtetracistronicミニゲノムおよびアクセサリT7ポリメラーゼ結果（ 図6をコードする発現プラスミドで293プロデューサー細胞のトランスフェクション）。重要なことは、観察されたレポーター活性（10 5.6相対発光単位（RLU））をコードする発現プラスミドLは2つ以上のログによりトランスフェクション（10 3 RLU）から省略されたネガティブコントロールのことを超えている。偶数Lの非存在下で観察される活性の低レベルに起因ミニゲノムプラスミド中の潜在性プロモーターによる可能性が最も高い。プロデューサー細胞と比較した場合、プロデューサー細胞の上清からtrVLPsに感染した標的細胞は、実際には幾分レポーター活性のレベルの増加を示し、その値は、通路に応じて、10 6、10 7 RLUとの間に達する。対照的に、ワット-L制御プロデューサー細胞の上清を、標的細胞上で継代される編（L含め、すべてのヌクレオカプシドタンパク質を発現する）を、レポーター活性をルミノメーター（約10 2 RLU）のバックグラウンドノイズを超えない。 tetracistronic trVLPアッセイは、エボラウイルスのライフサイクルを研究するために使用することができる。例えば、trVLPs 293細胞の感染は、これらの細胞にトランスで提供する必要があるなどのTim-1 16などの付着因子の存在に依存する。したがって、tetracistronic trVLPアッセイにおいて約100倍の標的細胞におけるレポーター活性の低下のTim-1（ 図7A）の非存在下で観察される。ウイルスのライフサイクルにおける特定の（ウイルスまたは細胞）のタンパク質の役割はまた、このアプローチと共にRNAi技術を用いて評価することができる。一例として、Lでの中心的役割を反映し、ダウンレギュレーション約100倍のレポーター活性の低下でL結果のRNAiを媒介複製と転写（ 図7B）7。また、直接ウイルスのライフサイクルにおける変異の効果を評価するためのミニゲノムを操作することが可能である。ミニゲノムからVP24発現を開始コドンのすぐ下流の3停止コドンを導入することによって廃止された場合、一例として、プロデューサー細胞におけるレポーター活性が劇的に変化しない。しかしながら、標的細胞におけるレポーター活性は、感染trVLPs（ 図7C）15の製造におけるVP24の役割を示すつの通路と、2つの継代後に400倍から約20倍減少する。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig1highres.jpg" width="500" /> 図1：エボラウイルスゲノムの構造だけでなく、モノシストロニックとtetracistronicミニゲノム。エボラウイルスタンパク質コード領域を赤（NPとして示されているVP35、VP30、およびL）、イエロー（VP40とVP24）または青（GP 1,2）のボックス。非コード領域（NCRの）が示されたリーダーおよびトレーラー領域と、緑色で示されている。添字は、ウイルスNCRはコード領域を接合するために使用されたかを示す。レポーター（担当者）のためのコード領域は紫色で示されている。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig2highres.jpg" width="500" /> 図2モノシストロンミニゲノムアッセイ細胞を、エボラウイルスヌクレオカプシドタンパク質のための発現プラスミド（NP、VP35、VP30、L）、モノシストロンミニゲノム（mg）およびT7ポリメラーゼを用いてトランスフェクトされる。ミニゲノムは、最初に、次いでNP（b）で包膜されているウイルスゲノム（vRNAの）と同じ向きにunencapsidatedミニゲノムRNAへのT7ポリメラーゼ（a）で転写される。これはvRNAの相補ミニゲノムRNA（cRNAを）済の中間経由複製されるキャプシド化ediate（c）は、その後、レポータータンパク質（E）に換算されているレポーターのmRNAの（d）に転写。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig3highres.jpg" width="500" /> モノシストロニックミニゲノムを持つ図3 trVLPアッセイ。細胞は、ミニゲノムアッセイ成分のための発現プラスミドでトランスフェクトする（エボラウイルスヌクレオタンパク質NP、VP35、VP30、L、モノシストロンミニゲノムおよびT7ポリメラーゼ）だけでなく、VP40、GP 1 、2、VP24。これは、ミニゲノム含有ヌクレオカプシド（F）を組み込むtrVLPsの形成をもたらす。いずれのレポーター発現（e）に、またはナイーブにつながる複製および二次転写（d）で得られた、NP、VP35、VP30、およびL（上部）のための発現プラスミドでpretransfectedされ、次いで標的細胞に感染することができ、これらのtrVLPs（g）に分の一次転写をもたらす標的細胞（下部）igenomes（h）は、また、レポーター発現の（e）に至る。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig4highres.jpg" width="500" /> 図tetracistronicミニゲノムで4 trVLPアッセイ：細胞を、エボラウイルスヌクレオカプシドタンパク質のための発現プラスミド（NP、VP35、VP30、L）、tetracistronicミニゲノム（mg）およびT7ポリメラーゼを用いてトランスフェクトされる。初期転写（a）は、キャプシド（b）は、ゲノム複製（c）および転写の（d）と同様に変換（e）は、モノシストロニックミニゲノムアッセイにおけるように起こる。しかし、レポーターmRNAに加えて、VP40、VP24およびGP 1,2ためのmRNAはまたtrVLPs（f）のの形成をもたらす、tetracistronicミニゲノムから転写される。これらtrVLPsはヌクレオキャプシドタンパク質NP、VP35、VP30とLのための発現プラスミドでpretransfectedされた標的細胞だけでなく、携帯エボラウイルスに感染する接着因子のTim-1、新鮮な標的細胞を感染させるために使用することができるtrVLPsのゲノムの複製および転写および生産をもたらす。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig5highres.jpg" width="500" /> 3つの連続継代tetracistronic trVLPアッセイの図5のタイミング。日間、細胞（単数または複数）を播種細胞（t）をトランスフェクト細胞は、（i）、培地交換（c）に感染した細胞とtrVLPsの収穫（h）のためである3つの連続継代のために示されている（矢印）。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig6highres.jpg" width="500" /> tetracistronic trVLPアッセイで観察されたレポーター活性の図6典型的なレベル。tetracistronic trVLPアッセイはprotoc以下の5継代にわたって実施されたオール本稿で概説。陰性対照として発現プラスミドをコードするLは、p0はプロデューサー細胞のトランスフェクションから（-L）を省略した。 p5は継代P1内の標的細胞を、ルミノメーターのバックグラウンドノイズが破線として示されているL.含むすべてのヌクレオカプシドタンパク質のための発現プラスミドでトランスフェクトした。手段と、3つの独立した実験から4の生物学的反復の標準偏差が示されている。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig7highres.jpg" width="500" /> tetracistronic trVLPsを用いてウイルスのライフサイクル上のさまざまなウイルスおよび細胞因子の影響を評価する図7。接着因子として（A）のTim-1ヌクレオカプシドタンパク質および（15に記載）のTim-1をコードするプラスミドを含むまたは含まないコードする発現プラスミドを用いてpretransfectedされた標的細胞を、tetオペレーターに感染させたracistronic trVLPs。 p1は、標的細胞における72時間後の感染レポーター活性を測定した。手段および4の生物学的反復の標準偏差4の独立した実験から示されている。 ゲノム複製と転写にLのRNAiのノックダウン（B）の効果。に対して向けヌクレオカプシドコンポーネント、TIM-1とのmiRNAのための発現プラスミドでpretransfectedた標的細胞L（抗L）または（15参照）無関係のタンパク質（抗GFP）をtetracistronic trVLPsで感染させた。 p1は、標的細胞における72時間後の感染レポーター活性を測定した。平均および2つの独立した実験からの5生物学的反復の標準偏差が示されている。（C）の影響変異のtrVLPの感染性に対するミニゲノム中。tetracistronic trVLPアッセイは、野生型ミニゲノム（4cis-WT）またはミニゲノム中のいずれかを用いて行った3終止コドンを発現Oを廃止、VP24の開始コドンの直後に導入されたfはこのタンパク質が、P0、P1とP2での長さ、核酸組成、二次構造レポーター活性に関してにおけるミニゲノムへの唯一の最小限の変更を導入するトランスフェクション/感染後72時間に測定した。手段と、3つの独立した実験からの3生物学的複製の標準偏差が示されている。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;width:115px;"></td><td style="width:127px;"> プロデューサー細胞（P0） </td><td style="width:180px;"> 標的細胞（p1およびそれ以降） </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;">のpCAGGS-NP </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;">のpCAGGS-VP35 </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;">のpCAGGS-VP30 </td><td> 75 </td><td> 75 </td></tr><tr height="19"><td heiGHT = &quot;19&quot;スタイル= &quot;高さ：19px;&quot;&gt;のpCAGGS-L </td><td>千</td><td>千</td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> p4cis-vRNAを、たRLuc </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;">のpCAGGS-T7 </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;">のpCAGGS-TIM1 </td><td> - </td><td> 250 </td></tr></tbody></table> 表1 DNAをトランスフェクションに達する。プロデューサーと標的細胞のトランスフェクションのために必要な各プラスミドの量は、6ウェルプレートのウェルあたりのngのに示されている。全てのプラスミドは、ワットら 15に記載されている。

感染エボラウイルスでの作業は、バイオセーフティーレベル4の研究室に限定されています。粒子（trVLPs）のようなTetracistronicミニゲノム含有複製と転写可能ウイルスは、私たちが安全にエボラウイルスのコンポーネントのみに頼って、バイオセーフティーレベル2の条件で複数の感染サイクルをモデル化することを可能にするライフサイクルモデリングシステムを表している。

Tetracistronicミニゲノムを含むウイルス様粒子とバイオセーフティレベル2の条件の下ではエボラウイルスのライフサイクルのモデル化

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

本実験の全体的な目的は、バイオセーフティレベル2の条件下で、強毒性であるエボラウイルスのライフサイクルをモデル化することです。これは、エボラウイルス粒子と同じタンパク質組成を持ちながら、ウイルスゲノムの代わりにミニゲノムを保持するウイルス様粒子を作製することで達成されます。ミニゲノムとは、ウイルスゲノムの小型版であり、ウイルスの遺伝子が除去され、代わりにルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子が組み込まれたものです。重要な点として、本実験で使用されるミニゲノムには、ウイルス蛋白であるVP40、GP-1、GP-2、およびVP24をコードする複数のウイルス遺伝子が依然として含まれています。ウイルス様粒子は、プロデューサー細胞と呼ばれる293T細胞において、ミニゲノムを、RNP蛋白とも呼ばれるウイルス蛋白（NP、VP35、VP30、L）と共に発現させることで作製されます。その後、ミニゲノムはウイルス蛋白質によって複製され、mRNAへと転写されます。これらのmRNAは、ルシフェラーゼリポーターおよび追加のウイルス蛋白質であるVP40、GP-one two、VP24をコードしています。これら3つの蛋白質が共存することで、ウイルス様粒子の産生が導かれます。これらは、内部のヌクレオカプシドがゲノム複製および転写を行う能力を持つため、転写複製能を有するウイルス様粒子（TRVLP）と呼ばれます。TRVLPはエボラウイルス糖蛋白質GP-one twoを保持しているため、標的細胞に感染させることが可能です。これらの標的細胞には、np、VP35、VP30、およびLの発現プラスミドがあらかじめ導入されています。これらのRNPタンパク質が共同して、TRVLP内部で標的細胞に導入されたミニゲノムを認識します。その後、ミニゲノムが複製および転写され、レポーター活性が生じるとともに、新たなTRVLPが産生されます。この産生されたTRVLPを用いて、再び新しい標的細胞に感染させることが可能です。重要な点として、ミニゲノムは自身の複製に必要な遺伝情報を保持していません。したがって、TRVLPsは4つのRNPタンパク質を発現していない細胞に感染して増殖することはできません。この特性により、本システムはバイオセーフティーレベル2の条件下で安全に使用することが可能です。この手法の主な利点は、バイオセーフティーレベル2の条件下で、ゲノム複製、ウイルス遺伝子産物の発現、ウイルス粒子の産生、および複数回の注入因子サイクルにわたる標的細胞への感染を含む、ウイルスライフサイクル全体をモデル化できることです。これにより、生きたエボラウイルスを扱う際に必要となる最大封じ込め施設（BSL-4等）を使用せずに、この研究を行うことが可能になります。本手法は、細胞因子のRNA介在性ノックダウンやそれらの因子の過剰発現などの他の手法と組み合わせることで、ウイルス生物学におけるこれらの因子の役割を研究することができます。また、ウイルス遺伝子に突然変異を導入することで、ウイルス生物学におけるこれらのウイルス遺伝子および遺伝子産物の役割を研究することも可能です。コンフルエンシーが80～90%に達した293T細胞から培地を除去し、PBSで2回洗浄した後、トリプシン2 mLを添加して細胞を剥離させます。細胞が丸くなるまで待ちます。次に、フラスコを軽く叩いて細胞を剥離させ、10% FBSを含む培地を8 mL加えて細胞に加えます。自動細胞計数器を用いて細胞数を計測し、細胞密度を2 × 10⁵ cells/mLに希釈して、6ウェルプレートの各ウェルに2 mLずつ播種します。細胞を5% CO2濃度の37 °C加湿インキュベーターに戻します。24時間後、TRVLPの産生に必要なプラスミドを細胞にトランスフェクションします。BSC内にて、フィルターチップを用いてDNAをチューブにピペッティングします。陰性対照として、1つのウェルではウイルスポリメラーゼLをコードするプラスミドを除外し、代わりにGFPをコードするプラスミドをトランスフェクションして、トランスフェクション効率を可視化します。その後、DNAにOpti-MEMを1ウェルあたり100 µL加えます。チューブをボルテックスし、スピンダウンします。次に、希釈したDNAに7.5 µLのtransIT LT-oneトランスフェクション試薬を加えます。チューブを緩やかにボルテックスし、室温で15分間インキュベートします。15分後、ピペッティングによってトランスフェクション混合液を穏やかに混ぜ合わせ、6ウェルプレートの各ウェルに100 µLずつ滴下するように加えます。細胞にトランスフェクション複合物を添加した後、プレートを前後左右に揺らしてください。プレートを回転させるとトランスフェクションが不均一になるため、旋回させないでください。その後、細胞をインキュベーターに戻します。トランスフェクションの24時間後、細胞から上清を除去します。次に、5% FBS含有培地 4 mLを細胞に添加し、インキュベーターに戻します。プロデューサー細胞のトランスフェクションから24時間後に、既述の方法で293T細胞を継代します。継代から24時間後、エボラウイルスRNPタンパク質をコードするプラスミドおよびエボラウイルスの接着因子として機能するTim-1をトランスフェクションします。プロデューサー細胞のトランスフェクションから72時間後かつターゲット細胞のトランスフェクションから24時間後に、プロデューサー細胞から上清を回収し、15 mLチューブにピペットで移します。上清を回収した後、残っている液体を取り除き、250 µLのglow lysis bufferを細胞に加えて、室温で10分以上インキュベートします。その後、本ビデオのステップ3に従ってルシフェラーゼ活性を測定します。その間に、生産細胞から得られた上清を室温、800 gで5分間遠心分離します。次に、標的細胞から培地を除去し、P-0細胞から得られた清澄化上清を3 mL、標的細胞に加えます。この操作を1ウェルずつ行います。完了後、標的細胞をインキュベーターに戻します。感染から24時間後。標的細胞から上澄みを除去します。次に、5% FBS含有培地を4 mL加え、細胞をインキュベーターに戻します。プロデューサー細胞または標的細胞におけるレポーター活性を測定するため、プロデューサー細胞の場合はトランスフェクションの72時間後、標的細胞の場合は感染の72時間後に細胞を回収します。そのためには、細胞から上清を除去し、250 microlitersのglow lysis bufferを細胞に加え、室温で少なくとも10分間インキュベートします。必要に応じて、この上清を新しい標的細胞の感染に使用できます。その場合は、上清を回収し、本ビデオのステップ2に記載されている方法で標的細胞に感染させてください。その間に、ルシフェラーゼアッセイバッファーを1ウェルあたり 40 µL 解凍し、バッファーに100分の1容量のルシフェラーゼ基質を加えます。調製したルシフェラーゼ試薬をボルテックスし、次へ進む前に室温に達していることを確認してください。次に、試薬 40 µL を白色不透明の 96 ウェルプレートにピペッティングします。クロストークによる問題を避けるため、サンプルウェルの間に1ウェルの空きを設けることが推奨されます。10分間のインキュベーション終了後、ピペッティングによって細胞を溶解バッファーで洗浄し、細胞溶解液をチューブに移します。溶解液を室温、10,000 g で3分間遠心分離します。その後、溶解液 40 µL をルシフェラーゼ試薬が入った 96 ウェルプレートにピペッティングします。サンプルを室温で10分間インキュベートします。10分後、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定します。発光測定の積分時間は 1 s としてください。Modulus マイクロプレートルミノメーターを用いた場合、ポジティブコントロールの典型的な発光信号は 1 × 10⁶ から 1 × 10⁷ 程度であり、一方でネガティブコントロールの信号は少なくとも 2〜3 ログ低くなるはずです。その後の継代において、ポジティブコントロールのレポーター活性は安定して維持される一方、ネガティブコントロールのレポーター活性はバックグラウンドレベルまで低下します。このビデオを視聴することで、エボラウイルスの複製および転写能を持つウイルス様粒子を作製し、それらを用いて標的細胞に感染させ、産生細胞および標的細胞におけるレポーター活性を測定できるようになります。重要な点として、この手法はRNA介在性の細胞因子ノックダウンなどの他の技術と組み合わせることが可能であり、ウイルス生物学におけるこれらの因子の役割を研究することができます。また、この手法で用いるウイルス成分に突然変異を導入することで、エボラウイルスのライフサイクルにおけるこれらの成分の役割を研究することも可能です。さらなる実験の詳細および具体的な試薬については、このビデオに付随する論文をご参照ください。

modeling-lifecycle-ebola-virus-under-biosafety-level-2-conditions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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