Name: Correlare DNA Modifiche metilazione gene-specifica con espressione e trascrizionale attività di astrociti KCNJ10 (Kir4.1) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Scopri come correlare la metilazione del DNA del gene KCNJ10 con l'attività trascrizionale negli astrociti usando MS.HRMA e saggi luciferasi. Questo metodo epigenetico avanzato aiuta a studiare la regolazione genica nel sistema nervoso centrale.

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Questo lavoro è stato supportato da R01NS075062-01A1. Smistamento FACS eseguito presso la struttura UAB Comprehensive Flow Cytometry Core (P30 AR048311, P30 A1027767). Il Dr. Scott Philips della struttura UAB Neurobiology Core e la Dr. Susan Nozell dell'UAB CDIB hanno assistito con gli aspetti tecnici del test della luciferasi.

Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute. La cura e l&#39;uso Comitato degli animali presso l&#39;Università di Alabama a Birmingham ha approvato l&#39;uso degli animali. 1. Ottenere RNA e DNA da un Arricchita astrocitica Popolazione utilizzando fluorescenti Cellulari Attivato Ordinamento (FACS) di astrociti da tutto il tessuto del cervello <ol><li> Animale sedate con CO 2 per 1 minuto e poi rapidamente decapitarlo. Sezionare cortecce come descritto in Albuquerque et al, 26.; non è necessario rimuovere meningi. Nota: i ratti transgenici che esprimono eGFP sotto il S100β (un marcatore astrociti) promotore sono stati generati da Itakura et al 27 e utilizzati per FACS ordinamento degli astrociti.. </li><li> Preparare tutto omogenato cerebrale utilizzando un kit di dissociazione papaina in condizioni non sterili, secondo il protocollo del produttore. Calore disattivare papaina a 37 ° C a bagnomaria per 10 min. Nota:Soluzione papaina è fornito dal costruttore e contiene L-cisteina e EDTA (vedi Tabella dei Materiali). <ol><li> Tagliare o dremel un foro nella parte superiore di un tubo da 50 ml per permettere tubazione che trasporta il 95% O 2: 5% CO 2 da alimentare in una provetta conica chiusa (Figura 1A). Mettere cortecce sezionato in 10 millimetri piatto di coltura contenenti supporti dissociazione (MEM supplementato con 20 mM glucosio e la penicillina / streptomicina (500 U / ml) ed equilibrato al 95% O 2: 5% di CO 2) e utilizzare una lama di rasoio pulito per tritare il tessuto in 1 x 1 mm 2 pezzi. </li></ol></li><li> Tessuto Trasferimento con 10 ml Pipetman manuale a tubo da 50 ml contenente soluzione papaina. Lasciare tessuto di depositarsi fondo pipetta prima dello scarico per minimizzare la quantità di materiale di dissociazione riportati. Mantenere soluzione papaina equilibrati a 95% O 2: 5% CO 2 attraverso lo scambio di gas di superficie per la durata dell&#39;incubazione. Non bolla papaina solution. Incubare il tessuto per 20 minuti a 37 ° C bagnomaria. </li><li> Dopo l&#39;incubazione in soluzione papaina, tessuto triturare 10 volte con una pipetta 10 ml di trasferimento a bassa velocità. Centrifugare sospensione cellulare nuvoloso a 1.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. <ol><li> Equilibrare soluzione inibitore DNasi / albumina (fornito dal costruttore) attraverso lo scambio di gas superficiale e risospendere le cellule in pellet in 3 ml di soluzione inibitore / DNasi di albumina. Preparare commerciale gradiente di densità discontinuo seguendo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Spin gradiente di densità discontinuo a 1.000 xg per 6 min. Isolare le cellule dissociate dal fondo della provetta da succhiare pellet fondo con una pipetta. </li><li> Risospendere le cellule dissociate in 2-3 ml di DPBS con 0,02% di albumina di siero bovino e 1 mg / ml DNasi o HEPES buffered preferiti coltura. Passare attraverso 40 micron filtro prima FACS (Figura 2A). Mantenere le cellule in ghiaccio fino a quando l&#39;ordinamento. <ol><li> Eseguire FACS 28. &lt;/ li&gt; <li> Cellule pellet in 1,5 ml provette a 2000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Nota: astrociti Il pellet possono essere utilizzati immediatamente o conservati in -80 ° C fino al momento dell&#39;estrazione del DNA. </li></ol></li><li> Estratto RNA e DNA utilizzando il metodo preferito di isolamento 29 30. Valutare RNA e concentrazione del DNA e la qualità con spettrofotometro e bioanalizzatore 31. Nota: Utilizzare solo RNA alta qualità e il DNA in fasi successive, 260/280 = 2,0-2,2 e 1,8-1,9, rispettivamente. Analisi Bioanalyzer è essenziale per valutare la degradazione dell&#39;RNA o frammentazione del DNA. RNA o DNA possono essere utilizzati immediatamente o conservate in -80 ° C o -20 ° C, rispettivamente per gli studi successivi. </li></ol> 2. Valutare metilazione del DNA Stato di un gene mediante metilazione-sensibile ad alta risoluzione Melt Analysis (MS-HRMA) <ol><li> Inserisci sequenza del gene di interesse in preferito software di mappatura metilazione online per individuare eventuali isole CpG del genedi interessi 32. <ol><li> Primer design contro bisolfito convertiti sequenza di DNA 33 e amplificano con DNA polimerasi preferita secondo il protocollo del produttore. Verificare le dimensioni del prodotto amplificato mediante l&#39;esecuzione di un gel di DNA agarosio 1% a 100 V per 45 minuti. Conservare primer a concentrazione magazzino di 20 micron di -20 ° C. </li></ol></li><li> Bisolfito convertire 500-1000 ng di DNA di ciascun campione e DNA metilato standard che vanno da 0-100% delle stesse specie animali 34. Campioni eluire per fornire una concentrazione di 20 ng / ml. Verificare la concentrazione di bisolfito di DNA convertito con spettrofotometro 31. </li><li> Setup 20 reazioni microlitri per l&#39;amplificazione di MS-HRM utilizzando DNA polimerasi preferito e primer a 5 micron di concentrazione in base alla tabella 1 e 2. Eseguire tutti i campioni, tra cui DNA e metilato standard FACS, in triplice copia. </li><li> A seconda del software di analisi, impostare pre- e post-avviare e arrestare i parametriintorno alle transizioni della curva di fusione. Set inizio pre-fusione e parametri di stop pre-melt così la differenza tra i due è 0,2-0,5 ° C. Imposta l&#39;inizio post-fusione e post-fusione fermare in modo simile. Estrarre i dati differenza di temperatura di picco per ogni campione. </li><li> Utilizzando gli standard per cento metilati (y-valore) e le loro corrispondenti differenze di temperatura di picco medi (x valore) genera una equazione di regressione lineare (Figura 3A-B, Tabella 3-4). Utilizzare questa equazione di regressione lineare per stimare lo stato di metilazione di 35 campioni sconosciuti. </li></ol> 3. Valutare Hyper-metilato Promotore Attività via Uso di luciferasi Assay <ol><li> Identificare isole CpG del gene bersaglio (punto 2.1). PCR amplifica regioni di interesse 36 e clone monte della luc2 Firefly gene della luciferasi giornalista per la produzione di plasmidi CpG-isola-luc2 37. </li><li> Linearizzare 30 microgrammi di plasmide CpG-isola-luc2 via restrizionedigestione enzimatica 38. Verificare i siti di restrizione digest e di evitare doppi tagli utilizzando il software di taglio preferito 38. Calore-inattivare enzimi a temperatura e durata adeguata seguenti digestione secondo il protocollo del produttore. Perdita minima di DNA si verifica durante la fase di linearizzazione. </li><li> Metilato plasmidi linearizzati con CpG metilasi (M.Sssl) O / N a 30 ° C o lasciare non trattati protocollo seguente produttore tranne che per le seguenti regolazioni. </li><li> Eseguire 50 reazioni microlitri. </li><li> Utilizzare 5 unità di CpG metilasi per metilare 700 ng di plasmide linearizzato. </li><li> Eseguire reazioni O / N per 13-19 ore. </li><li> A seguito di CpG reazione metilasi, eseguire la pulitura del DNA utilizzando lo standard, disponibile in commercio membrana di gel di silice pulizia Kit secondo il protocollo del produttore. Perdite significative di DNA si verificano a seguito CpG reazione metilasi, perdita 30-60%. </li><li> Verificare metilazione di plasmidi tramite una restrizione Hpa II digest. </li&gt; <li> Prendere 1 mg di DNA metilato o non metilato e restrizione digerire con Hpa II per 1 ora a 37 ° C. Utilizzare 5-10 unità di Hpa II per ogni mg di DNA. A seguito di Hpa II digestione, eseguire la pulitura DNA usando preferita, membrana disponibile in commercio gel di silice ripulire kit. Eseguire entrambi plasmidi metilati e non metilati CpG su un gel di agarosio 1% DNA in tampone TAE o TBE a 100 V per 45 minuti per la visualizzazione (Figura 4B). </li><li> Oggetto sia denaturato e non metilato plasmidi a doppia digestione con opportuni enzimi di restrizione per rilasciare full-length luc 2 (vettoriale) e l&#39;isola CpG (inserto) frammenti 38. Eseguire doppio digestione O / N a temperatura adeguata e gli enzimi calore inattivare seguente digestione secondo il protocollo del produttore. Minima perdita di concentrazione di DNA avviene durante doppia restrizione digest. </li><li> Eseguire plasmidi doppio digeriti su 1% gel di agarosio DNA a 100 V per 1 ora per permettere la separazione of vettore e inserire (Figura 4C). Attenzione. Indossando UV scudo protettivo faccia, mettere il gel del DNA su un tavolo nero luce di visualizzare bande. In base alle dimensioni, accise inserto metilato e non metilato e non metilato vettore con una lama chirurgica pulito. </li><li> Gel estratto di DNA con fenolo saturo, pH 6,6. In breve, pesare gel DNA contenente vettoriale o inserto. Utilizzare 100 ml di fenolo per 0,1 grammi di gel DNA. Omogeneizzare gel DNA fenolo utilizzando Dounce vetro omogeneizzatore. </li><li> Aggiungere cloroformio (con 1/5 del volume di fenolo) ed agitare i campioni per 20 sec. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 2-3 minuti. Centrifugare per 15 minuti a velocità massima (16,1 x 1.000 xg) a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione acquosa e 0,1 X. aggiungere volume di 3 M acetato di sodio e 2,5 volte il volume di etanolo. Incubare i campioni per 1 ora a -80 ° C. Dopo l&#39;incubazione, rimuovere l&#39;etanolo e risospendere il DNA in 30 microlitri di tampone preferito. Significativa perdita di DNA avviene seguenti isolamento di inserti e vettori, 30-50% loss. </li><li> Re-legare inserti metilato e non metilato al vettore non metilato utilizzando T4 DNA ligasi 38. Utilizzare un rapporto 1: 4 di vettore da inserire per le reazioni legatura. Reazione di installazione in base alle istruzioni del produttore. Utilizzare un volume totale di 50 microlitri per le reazioni e incubare O / N a -20 ° C o su ghiaccio con coperchio sopra secchiello del ghiaccio. </li><li> A seguito di legatura, eseguire la pulitura DNA usando preferita, membrana disponibile in commercio gel di silice ripulire kit. Significativa perdita di DNA si verificano a seguito di reazione legatura, un approssimativo perdita 30-50% del DNA. Verificare ri-legatura eseguendo il 1% gel di DNA agarosio a 100 V per 45 minuti e valutare la concentrazione di plasmidi ri-legatura (Figura 4D). </li><li> Trasfettare plasmidi denaturato o non denaturato nelle cellule D54 con un reagente di trasfezione commerciale secondo il protocollo del produttore. Cellule D54 Seed sulla piastra 12 pozzetti alla 0,14 x 10 6 cellule / pozzetto. </li><li> A seguito di 24 ore, le cellule trasfettare with concentrazioni uguali di entrambi (1) plasmide non methyated CpG luc2 + Renilla o un altro controllo luciferasi vettoriale o (2) metilata plasmide CpG luc2 + Renilla o un altro controllo luciferasi vettoriale. </li><li> Consentono alle cellule per trasfettare per 24 ore prima di eseguire doppio test luciferasi. Eseguire test secondo le istruzioni del produttore. Eseguire le letture usando un luminometro. Leggere ogni bene in triplice copia. </li><li> Calcolare il rapporto di attività luciferasi Firefly a Renilla o altre attività di controllo della luciferasi. Normalizzare metilato Firefly: attività luciferasi di controllo per non metilato Firefly: attività luciferasi controllo dividendo l&#39;attività luciferasi metilato per attività luciferasi non denaturato </li></ol>

Gli autori non hanno divulgazioni.

Questo protocollo descrive l'isolamento di una popolazione arricchita di astrociti tramite FACS e una varietà di tecniche che consentono studi sia correlati che causativi tra la metilazione del DNA e l'espressione genica. Queste tecniche, utilizzate in isolamento o in combinazione, sono particolarmente utili per i laboratori che lavorano con tessuti ad alta eterogeneità cellulare o sono interessati allo stato di metilazione del DNA di un particolare gene o regione genica rispetto ai cambiamenti globali della metilazione ...

L'epigenetica è lo studio delle modificazioni chimiche che possono influenzare l'attività trascrizionale del genoma. Essenzialmente, senza un cambiamento nella sequenza del DNA, le modifiche epigenetiche come la metilazione del DNA, l'acetilazione degli istoni e la metilazione degli istoni sono sufficienti per alterare in modo reversibile i modelli di espressione genica 1. La metilazione del DNA, un potente regolatore dell'espressione genica, è la modificazione epigenetica più caratterizzata. La metilazione del DNA è l'attacco covalente di gruppi metilici sulla posizione C5 di una citosina, tipicamente la citosina di un dinucleotide citosina-guanina, noto anche come sito CpG. Le aree che contengono un'alta densità di siti CpG sono note come isole CpG (CGI). I CGI sono frequentemente associati ai siti di inizio trascrizionale (TSS) e ai promotori genici 1-3. Pertanto, mentre i cambiamenti nella metilazione del DNA nelle CGI non sono sempre concomitanti con i cambiamenti nell'espressione o nella funzione cellulare, i cambiamenti nella metilazione del DNA nelle CGI possono esercitare una potente regolazione sull'attività trascrizionale 2. 
Storicamente, si è osservato che la metilazione del DNA è essenziale nell'embriogenesi, nell'imprinting e nello sviluppo, con piccoli cambiamenti nei livelli di metilazione del DNA che si verificano nelle cellule post-mitotiche (con l'eccezione delle alterazioni nei geni correlati al cancro) 4,5. Tuttavia, il campo della neuroepigenetica ha evidenziato un importante ruolo non evolutivo per la metilazione del DNA. In particolare, l'epigenetica cognitiva ha ridefinito la metilazione del DNA come un meccanismo altamente plastico integrale nel mediare sia l'attivazione trascrizionale che la repressione di geni essenziali per il processo di apprendimento e memoria 6. Oltre all'epigenetica cognitiva, gli studi che modellano il danno ischemico e il dolore neuropatico caratterizzano la metilazione del DNA come un meccanismo labile che risponde rapidamente a una varietà di insulti del SNC 7-9. Per quanto riguarda gli astrociti, diverse linee di evidenza suggeriscono che la metilazione del DNA svolge un ruolo importante nell'astrogliogenesi. Fan et al., hanno scoperto che il KO condizionale di DNMT1 nelle cellule progenitrici neurali (NPC) ha portato allo sviluppo precoce di astrociti concordanti con uno stato globale di ipometilazione 10. Inoltre, Perisic et al., hanno concluso che i livelli differenziali di metilazione del DNA del promotore GLT-1 mediano i livelli differenziali di espressione del trasportatore del glutammato nella corteccia e nel cervelletto, sottolineando un ruolo nella metilazione del DNA nello stabilire modelli specifici della regione cerebrale dell'espressione genica astrocitaria 11. Nel complesso, numerosi studi sottolineano la natura dinamica e labile della metilazione del DNA nel SNC poiché è stato dimostrato che l'ambiente, i farmaci e le lesioni modificano la metilazione del DNA e, spesso, l'espressione genica 4,9. Insieme, questi studi neuroepigenetici indicano la metilazione del DNA come un bersaglio terapeutico fattibile con il potenziale di mitigare una varietà di patologie del SNC.
Man mano che il campo dell'epigenetica espande la sua comprensione del ruolo della metilazione del DNA nel neurosviluppo e nella malattia, la sfida di spostare la metilazione del DNA verso un bersaglio terapeutico consiste nell'eseguire non solo studi correlativi, ma anche causali che definiscono specifici bersagli e siti genici. Inoltre, l'indagine sui cambiamenti nella metilazione del DNA specifici per la regione del cervello e il tipo di cellula rimane una sfida continua e degna di tempo, unica nel campo della neuroepigenetica. Questo protocollo utilizza una varietà di tecniche, tra cui la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) degli astrociti, l'analisi del fuso ad alta risoluzione sensibile alla metilazione (MS-HRM) e un saggio di metilazione luciferasi per studiare lo stato di metilazione del DNA di KCNJ10, un gene che codifica per Kir4.1. Kir4.1 è un canale del potassio gliale specifico che dimostra sia la regione cerebrale che i modelli di espressione specifici delle cellule nel SNC 12-16. L'espressione di Kir4.1 aumenta passando dalle regioni rostrali a quelle caudali del SNC, con l'espressione più alta che si verifica nel midollo spinale 15. Sebbene il canale sia espresso nelle cellule ependimali, negli oligodendrociti e nelle loro cellule precursori, Kir4.1 è espresso prevalentemente negli astrociti e si ritiene che sia essenziale per mantenere i livelli omeostatici di potassio e per supportare l'assorbimento del glutammato impostando il potenziale di membrana a riposo degli astrociti a una temperatura iperpolarizzata di -80mV 12,16-19. È importante sottolineare che l'espressione di Kir4.1 non è statica sia durante lo sviluppo che in seguito a molteplici forme di lesione del SNC 20-25. Abbiamo voluto esaminare la regolazione epigenetica di questo canale, in particolare negli astrociti durante lo sviluppo. Le tecniche utilizzate offrono analisi del sito CpG specifiche e mirate per il gene che forniscono prove causali di un ruolo della metilazione del DNA nella regolazione dell'espressione genica di KCNJ10. Queste tecniche possono essere applicate ad altri geni.

<table><tbody><tr><td>Sistema di dissociazione della papaina</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit AllPrep DNA/RNA</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Primer</td><td>Software online Applied Biosystems</td><td></td><td>per localizzare le isole CpG</td></tr><tr><td>Kit di metilazione del DNA EZ</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>Standard di calibrazione premiscelata per ratto</td><td>EpiGenDx</td><td>80-8060R-Premix</td><td></td></tr><tr><td>CpG Metilasi (M.Sssl)</td><td>Zymo Research</td><td>E2010</td><td></td></tr><tr><td>QIAestrazione rapida del gel&nbsp;</td><td>QIagen</td><td>28704</td><td>Utilizzato per l'estrazione di gel e la pulizia del DNA</td></tr><tr><td>Enzimi di restrizione</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB cutter</td><td>New England BioLabs</td><td>verifica online</td> i <td>siti di digestione di restrizione</td></tr><tr><td>Doppio sistema di saggio Luciferase Reporter</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Luc2 vettore, pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>vettore renilla, pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>TD-20/20 Luminometro</td><td>Turner progetta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina LTX e Plus Reagente</td><td>Life Technologies</td><td>A12621</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo, saturo pH 6,6/6,9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 17501-100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spettroptometro</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4415440</td><td></td></tr><tr><td>Software HRM (High Resolution Melt) v2.0</td><td>Life Technologies</td><td>4397808</td><td></td></tr><tr><td>AB Software SDS v2.3</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB High Resolution Melting Guida introduttiva&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB 7900HT Sistema veloce in tempo reale</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

correlare dna modifiche metilazione gene-specifica con espressione e trascrizionale attività di astrociti<em&gt; kcnj10</em&gt; (kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

La metilazione del DNA serve a regolare l'espressione genica attraverso l'attaccamento covalente di un gruppo metilico sulla posizione C5 di una citosina in un dinucleotide citosina-guanina. Mentre la metilazione del DNA fornisce cambiamenti duraturi e stabili nell'espressione genica, anche i modelli e i livelli di metilazione del DNA sono soggetti a cambiamenti in base a una varietà di segnali e stimoli. In quanto tale, la metilazione del DNA funziona come un regolatore potente e dinamico dell'espressione genica. Lo studio della neuroepigenetica ha rivelato una varietà di stati fisiologici e patologici che sono associati a cambiamenti sia globali che gene-specifici nella metilazione del DNA. In particolare, esistono sorprendenti correlazioni tra i cambiamenti nell'espressione genica e la metilazione del DNA nei disturbi neuropsichiatrici e neurodegenerativi, durante la plasticità sinaptica e dopo lesioni al SNC. Tuttavia, poiché il campo della neuroepigenetica continua ad espandere la sua comprensione del ruolo della metilazione del DNA nella fisiologia del SNC, è essenziale delineare le relazioni causali per quanto riguarda i cambiamenti nell'espressione genica e nella metilazione del DNA. Inoltre, per quanto riguarda il campo più ampio delle neuroscienze, la presenza di vaste differenze regionali e cellulo-specifiche richiede tecniche che affrontino queste variazioni quando si studiano il trascrittoma, il proteoma e l'epigenoma. Qui descriviamo lo smistamento FACS degli astrociti corticali che consente il successivo esame sia della trascrizione dell'RNA che della metilazione del DNA. Inoltre, descriviamo in dettaglio una tecnica per esaminare la metilazione del DNA, l'analisi del fuso ad alta risoluzione sensibile alla metilazione (MS-HRMA) e un saggio del promotore della luciferasi. Attraverso l'uso di queste tecniche combinate si è in grado non solo di esplorare i cambiamenti correlati tra la metilazione del DNA e l'espressione genica, ma anche di valutare direttamente se i cambiamenti nello stato di metilazione del DNA di una data regione genica sono sufficienti per influenzare l'attività trascrizionale.

Una popolazione arricchita di astrociti è stato acquisito tramite FACS ordinamento di eGFP-S100β animali transgenici 27. A causa della diminuzione della qualità delle cellule e molecole molecolari isolati da animali di età superiore a postnatale giorno 50 (p50), animali di età p0-P40 sono ottimali per tali esperimenti. Tessuto corticale è stato utilizzato per questi esperimenti. Cortecce da due a sei animali sono stati riuniti insieme. FACS è stata eseguita presso lo stabilimento UAB Comprehensive Citometria ...

La metilazione del DNA è in grado di mantenere stabili i livelli di espressione genica e di consentire cambiamenti dinamici nell'espressione genica in risposta a una varietà di stimoli. Descriviamo in dettaglio le tecniche che consentono lo studio dei cambiamenti gene-specifici nella metilazione del DNA e l'effetto di questi cambiamenti sull'espressione genica.

Correlare DNA Modifiche metilazione gene-specifica con espressione e trascrizionale attività di astrociti<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare lo stato di metilazione del DNA di KCNJ10 in una popolazione arricchita di astrociti e correlare le variazioni della metilazione del promotore con l'attività trascrizionale opzionale. Questo viene realizzato isolando innanzitutto una popolazione arricchita di astrociti corticali dall'intero cervello di roditore mediante sorting FACS; successivamente, il DNA viene isolato dalla popolazione arricchita di astrociti. Quindi, lo stato di metilazione del DNA di KCNJ10 viene valutato mediante analisi di fusione ad alta risoluzione sensibile alla metilazione, o MS-HRMA.Infine, il promotore KCNJ10 è ipermetilato e il saggio con luciferasi viene utilizzato per correlare le variazioni nella metilazione del DNA del promotore con l'attività trascrizionale. In definitiva, MS.HRMA e il saggio con luciferasi sono impiegati per misurare lo stato di metilazione del DNA di KCNJ10 e per correlare le variazioni nella metilazione del promotore con l'attività trascrizionale del gene. La procedura verrà dimostrata da un ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida dei National Institutes of Health, e l'utilizzo degli animali è stato approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università dell'Alabama a Birmingham.Tutti i tamponi e i reagenti sono stati preparati secondo il protocollo indicato nel testo. Dopo aver dissezionato le cortecce dalla testa di un animale eutanasizzato, secondo il protocollo descritto nel testo, praticare un foro nella parte superiore di un tubo conico da 50 millilitri utilizzando un taglierino o una fresa, in modo da far passare un tubicino all'interno del tubo. Quindi aggiungere la soluzione papaina nel tubo.Posizionare le cortecce dissezionate in una piastra da coltura da 10 millimetri contenente mezzo di dissociazione equilibrato a 95% O2 e 5% CO2 e utilizzare una lametta pulita per tritare il tessuto in pezzi di dimensioni pari a 1 millimetro per 1 millimetro. Con una pipetta da 10 millilitri, trasferire il tessuto nel tubo da 50 millilitri contenente la soluzione di pepaina. Attendere che il tessuto si depositi sul fondo della pipetta prima di effettuare il trasferimento.Per minimizzare la quantità di mezzo di dissociazione trasferito senza provocare la formazione di bolle nella soluzione di pepano, applicare un flusso costante di 95% O2 e 5% CO2 mediante scambio gassoso superficiale durante l'incubazione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta di trasferimento da 10 millilitri per aspirare e rilasciare lentamente il tessuto 10 volte, quindi centrifugare la sospensione cellulare torbida a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Equilibrare la soluzione inibitrice dell'albumina del DNA mediante scambio gassoso superficiale e risospendere le cellule in pellet in tre millilitri di tale soluzione.Quindi preparare un gradiente di densità discontinuo commerciale seguendo le istruzioni del produttore. Centrifugare il gradiente di densità discontinuo a 70 G per sei minuti. Successivamente, isolare le cellule dissociate dalla parte inferiore del tubo utilizzando una pipetta per aspirare il mezzo.Utilizzare da due a tre millilitri di DPBS con albumina sierica bovina allo 0,02% e un milligrammo per millilitro di DNA o il mezzo preferito. Per riutilizzare, sospendere le cellule dissociate. Far passare le cellule attraverso un filtro da 40 microgrammi prima di eseguire il sorting cellulare e l'estrazione di DNA o RNA secondo il protocollo indicato nel testo.Dopo aver progettato primer specifici per una sequenza di DNA convertito con bisolfito e aver amplificato il DNA seguendo il protocollo descritto, convertire con bisolfito da 500 a 1000 nanogrammi di DNA per ogni campione e standard di DNA metilato con percentuali dallo zero al 100% provenienti dalla stessa specie animale, utilizzando una DNA polimerasi preferenziale e primer a cinque micromoli. Impostare reazioni da 20 microlitri per l'amplificazione Ms HRM. In base a questa tabella, eseguire tutti i campioni, inclusi DNA di controllo, DNA e standard metilati, in triplicato; in base al software di analisi utilizzato, impostare i parametri iniziali e finali pre e post intorno alle transizioni della curva di fusione.Impostare i parametri di premelt iniziale e premelt finale in modo che la differenza tra i due sia compresa tra 0,2 e 0,5 gradi Celsius. Impostare in modo analogo i parametri di postmelt iniziale e finale ed estrarre i dati relativi alla differenza di temperatura di picco per ogni campione utilizzando gli standard di metilazione percentuale e le corrispondenti differenze di temperatura di picco.Generare un'equazione di regressione lineare. Utilizzare questa equazione di regressione lineare per stimare lo stato di metilazione di campioni sconosciuti dopo aver identificato le isole CPG di interesse e aver amplificato e clonato l'isola CPG Luke due plasmidico secondo il protocollo descritto nel testo. Utilizzare il software cutter preferito per verificare i siti di digestione con enzimi di restrizione al fine di evitare tagli doppi e linearizzare 30 microgrammi di plasmide una volta che il campione è stato digerito con gli enzimi appropriati.Inattivare gli enzimi al calore alla temperatura e durata appropriate in reazioni da 50 microlitri. Utilizzare cinque unità di metilasi CPG per metilare 700 microgrammi di plasmidi lineari a 30 gradi Celsius per 13-19 ore.Dopo aver purificato il DNA come descritto nel protocollo, eseguire un doppio digestione con HPA su campioni di un microgrammo di DNA metilato, incubando a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo la purificazione, caricare i campioni di DNA su un gel di agarosio al 1% a 100 volt per 45 minuti per la visualizzazione. Successivamente, sottoporre i plasmidi metilati e non metilati a digestione doppia con enzimi di restrizione appropriati per tutta la notte, al fine di rilasciare il vettore Luke due completo e i frammenti dell'isola CPG.Inattivare termicamente gli enzimi dopo la digestione. Eseguire i campioni digeriti due volte su un gel di agarosio 1% a 100 volt per un'ora per separare il vettore dall'inserto; quindi, indossando protezioni contro la luce UV, posizionare il gel sotto luce nera e, utilizzando lame chirurgiche pulite, escindere gli inserti metilati e non metilati. Dopo l'estrazione del DNA dal gel secondo il protocollo descritto, utilizzare la DNA Ligasi T4 in un rapporto uno a quattro tra vettore e inserto per clonare gli inserti metilati e non metilati in un vettore non metilato. Incubare a meno 20 gradi Celsius o sul ghiaccio per tutta la notte dopo la ligazione.Pulire il DNA e verificare la religatura eseguendo i campioni su un gel di agarosio al 1% e valutare la concentrazione del plasmide religato. Seminare cellule CD54 in una piastra a 12 pozzetti a 140.000 cellule per pozzetto. Dopo 24 ore, utilizzare un reagente di trasfezione commerciale per trasfettare le cellule con concentrazioni uguali di plasmide CPG non metilato con loop due più RAN vanilla oppure un altro vettore di controllo ferroso, oppure plasmide cpg metilato con Luke due più ELLA oppure un altro vettore di controllo lucifero. Lasciare che le cellule vengano trasfettate per 24 ore prima di eseguire un saggio lucifero.Secondo le istruzioni del produttore, utilizzare un luminometro per leggere ogni pozzetto in triplice replicato. Calcolare il rapporto tra l'attività della luciferasi di lucerna e quella della ran vanilla o di un altro controllo. Attività della luciferasi.Normalizzare l'attività della luciferasi di controllo firefly metilata rispetto all'attività della luciferasi di controllo firefly non metilata, dividendo l'attività metilata per l'attività della luciferasi metilata. Come dimostrato qui, una popolazione arricchita di astrociti è stata ottenuta mediante sorting FACS di animali transgenici E-G-F-P-S 100 beta. Una popolazione selezionata è stata indirizzata in base allo scattering anteriore e laterale, e una popolazione di cellule vive è stata determinata utilizzando un indicatore per cellule morte a base di bromuro; le immagini mostrate qui sono rappresentative di astrociti positivi per EGFP dopo la dissociazione, ma prima del sorting e anche dopo il sorting. Questa figura mostra una popolazione cellulare isolata positiva per EGFP che ha dimostrato un aumento di 40 volte dell'mRNA per il marcatore specifico degli astrociti.Un LDH su L uno. Inoltre, nonostante l'espressione condivisa di S100β e NG2 negli OPC e negli astrociti, è stata osservata una riduzione quattro volte maggiore dell'mRNA di NG2, un marcatore per le cellule precursori degli oligodendrociti, indicando l'isolamento di una popolazione cellulare astrocitaria arricchita. Questa tabella elenca l'RNA e il DNA totali isolati da animali di età e numero variabili, ed è riportata come riferimento per il rendimento atteso di molecole molecolari in seguito ai fatti.Infine, è stato utilizzato un saggio con luciferasi duale per valutare l'attività trascrizionale delle regioni ipermetilate del gene di interesse dopo aver trasferito l'inserto metilato in un vettore non metilato. È stata utilizzata HPAII, che digerisce soltanto il DNA non metilato, per verificare lo stato di metilazione del plasmide. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare una popolazione arricchita di astrociti utilizzando la FACS, nonché di come misurare la metilazione del DNA di un gene e correlare le variazioni nella metilazione del DNA del promotore con l'attività trascrizionale, utilizzando rispettivamente l'analisi di fusione ad alta risoluzione sensibile alla metilazione e il saggio con luciferasi.

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