Name: 편의적 곰팡이 병원균에 형광 태그 유전자의과 유전자 변형 크립토 콕 쿠스 네오 포르 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 배우세요 Cryptococcus neoformans에서 형광 태그를 이용한 생물학적 전환법으로 안정적인 DNA 통합을 수행하는 방법을. 금 미세입자 코팅과 유전자총 전달, PCR 및 형광 현미경 확인 기법을 활용합니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation 상 # 0920274)와 사우스 캐롤라이나 실험 역 프로젝트 SC-1700340에서 수상에 의해 지원되었다. 클렘 슨 대학 시험장이 종이 isTechnical 공헌 호 6283. 저자는 마지막 프로토콜과 원고의 비판적 읽기 박사 셰릴 잉그램 스미스, 케이티 글렌, 그레이스 Kisirkoi의 개발에 그의 도움이 조언 박사 루카스 Kozubowski 감사합니다.

참고 :이 프로토콜의 전체 체계는 그림 1에 설명되어 있습니다. 1. C. 콕 쿠스 네오 포르 만 준비 <ol><li> 각각의 변환 반응, C.의 2-3 ㎖의 O / N 배양 성장 30 ° C에서 YPD 배지에서 콕 쿠스 네오 포르 만 250 rpm에서 진탕. </li><li> 10 ° C에서 900 XG에서 5 분 동안 O / N 문화를 원심 분리기 상층 액을 버린다. </li><li> 효모 펩톤 덱스 트로 오스 (YPD) 매체의 300 μL의 각 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 유리 비드를 사용하여 조심스럽게 1 M 소르비톨을 함유하는 YPD 한천 상으로 세정 세포 현탁액 300 μl를 확산. </li><li> 판은 3 ~ 4 시간 동안 상온에서 건조하도록 허용합니다. </li></ol> 2. 골드 미세 전달체 준비 <ol><li> DDH 2 O 1 ml의 0.6 μm의 골드 비즈의 0.25 g을 재현 탁, 900 XG에 1 분 동안 원심 분리기는 비드 펠렛, 상층 액을 제거합니다. </li><li> 100 % 에탄올 1 ㎖에 금 비드를 재현 탁. &lt;/ 리&gt; <li> 4 튜브, 각 μL (250)에 구슬을 배포, 100 % 에탄올 750 μl를 추가합니다. </li><li> 4 ℃에서 보관 골드 비드 씩. </li></ol> 3. DNA 준비 <ol><li> 100 % 에탄올을 사용하여 집게에서 그들을 잠수에 의해 오렌지 마크로 캐리어의 유전자 총 디스크를 준비합니다. 건조 drierite를 포함하는 큰 페트리 접시에 배치 디스크 (drierite가 디스크에 닿지 않도록해야합니다). </li><li> 일단 건조, (이전에 100 % 에탄올로 닦여)은 디스크 홀더에 마크로 캐리어 디스크를 누르십시오. </li><li> 변환 당 1.5 ml의 microcentrifuge 관, 하나의 튜브에 (2 단계에서와 같이 제조) 소용돌이 골드 비즈와 나누어지는 12 μL. </li><li> 위해 각 튜브에 추가 : 2 DNA의 μg의 (바람직하게는 1 μg의 DNA의 / μL 2 μL), 10 ㎕의 2.5 M CaCl2를, 2 μL 1 M 스퍼 미딘 유리 염기. </li><li> 단계 3.4에서와 같이하지만 DNA와 음성 대조군을 설정합니다. </li><li> 소용돌이 각각의 튜브는 상온에서 부화5 분. 조심스럽게이 배양 동안 정착 구슬을 재현 탁 가끔씩 각 튜브를 가볍게. </li><li> 30 초 동안 225 XG에 스핀 튜브는 DNA 코팅 골드 비즈 펠렛합니다. 조심스럽게 (피펫 또는 흡인에 의해) 상층 액을 제거하고 폐기합니다. </li><li> 천천히 피펫 아래로 완전히 100 % 에탄올 600 μL에 재현 탁 구슬. </li><li> 포장없이 구슬을 펠렛 30 초 동안 225 XG에 튜브를 스핀. 조심스럽게 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> 천천히 피펫 아래 100 % 에탄올의 8 μL의 DNA 코팅 골드 비즈을 재현 탁. </li><li> 1cm 직경과 유전자 디스크의 중심에 DNA 코팅 골드 비즈를 피펫 건조 할 수 있습니다. 참고 : 유전자 총 디스크의 중앙에 표시 건조 골드 원 골드 비즈의 충분한 농도가 존재 함을 나타냅니다. 참고 : DNA 코팅 골드 비즈와 함께로드 마크로 캐리어 디스크는 이제 유전자 총을 사용할 준비가되었습니다. </li></ol> 4. O유전자 총을 perating <ol><li> 진공 펌프의 전원을 켭니다. </li><li> 약 2,200 PSI의 압력까지 시계 반대 방향으로 노브를 돌려 헬륨 가스를 켜고 압력 게이지에 도달. </li><li> 왼쪽에있는 빨간색 스위치를 틀지하여 유전자 총을 켭니다. </li><li> 진공 15 초 이내에 28인치 수은에 도달 할 수 있도록 진공 배기의 유속이 조정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 파열판 및 마크로 캐리어 사이의 거리가 약 3/8 인치 있는지 확인하십시오. </li><li> 에탄올로 닦고하여 전체 챔버를 청소합니다. </li><li> 100 % 에탄올에 파열 디스크를 담근다. 멸균 표면에 건조하도록 허용 (예를 들어, 페트리 접시). </li><li> 파열판 홀더를 풀고 토크 렌치를 사용합니다. 홀더에 깨끗한 파열 디스크를 넣습니다. 다시 제자리에 파열 디스크 홀더 나사 오른쪽으로 한 번 돌려 토크 렌치로 조입니다. 참고 : 파열 디스크는 각각 촬영 다음과 같은 대체됩니다. </li><li> 제 잠수함100 % 에탄올 중의 E 메쉬 스크린. 멸균 표면에 건조하도록 허용 (예를 들어, 페트리 접시). </li><li> 일단 건조, 흰색 플라스틱 마운팅 플레이트에 세척 메쉬 스크린을 배치합니다. 디스크 챔버로 아래 마크로 캐리어 디스크 홀더 DNA 측 놓습니다. 실버 캡 나사, 가장 높은 슬롯에 장착 판을 배치합니다. 주 : 메쉬 스크린은 각 촬영 후 대체됩니다. </li><li> 바닥 판에 1 M 소르비톨을 포함하는 YPD 한천 플레이트를 놓습니다. </li><li> 실 문을 종료하고 제자리에 고정. </li><li> 밀어 진공 참여하고 진공 28인치 수은에 도달 할 수 있도록 중간 빨간색 스위치를 누르고 있습니다. 적절한 진공 레벨에 도달하면, 아래 위치에이 스위치를 이동합니다. 준비가되면은, 발사 오른쪽에있는 빨간색 스위치를 누르십시오. 파열판이 올라 오면 즉시 발사 버튼을 해제하고 0 PSI에 챔버를 배출하기 위해 중간 위치에 중간 빨간색 스위치를 밀어 넣습니다. </li><li> 파열 된 디스크 파편을 청소하고 유전자 총을 끄십시오. 그런 다음 heliu을 해제노브를 시계 방향으로 회전하고, 최종적으로 진공 펌프를 해제함으로써 m 가스. </li></ol> 5. 도금 형질 전환 세포 <ol><li> 변환 판이 세포가 복구 할 수 있도록 4 시간 동안 실온에서 방치시키고. </li><li> 접시에 YPD의 피펫 700 μL. 부드럽게 멸균 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 한천과 피펫 액체의 떨어져 세포를 긁어 세포 스크레이퍼를 사용합니다. 모든 세포가 판에서 발견 된 보장하기 위해이 단계를 반복합니다. </li><li> 30 초 동안 225 XG에서 세포 펠렛. 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> YPD 500 μL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 피펫 100 + 항생제 YPD 플레이트의 중심 상에 세포 현탁액 μL 및 유리 비드를 사용하여 확산. </li><li> 3~4일 동안 실온에서 거꾸로 판을 둡니다. 식민지가 나타날 때, 새로운 YPD + 항생제 플레이트 상에 패치. </li></ol> PCR 6. 게놈 DNA 분리 주 :이 시약을 사용하여 수정 된 버전 인DNA 정제 키트들 (재료의 표 참조). <ol><li> C. 각 5 ml의 문화를 성장 30 ° C에서 YPD 액체에 콕 쿠스 네오 포르 만의 형질 전환 체는 250 rpm으로 O / N에 떨고. </li><li> 900 XG에 3 ml의 세포를 펠렛 및 핵 분해 용액 600 μL에 재현 탁. </li><li> 0.5 mm 산 200 μL와 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 현탁액을 추가 유리 비드를 세척 하였다. </li><li> 얼음에 주위 온도, 냉각 관에서 미​​니 beadbeater 45 초 동안 균질화하고, 반복합니다. </li><li> 샘플은 2 분 동안 얼음에 정착하고 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송하도록 허용합니다. 20 초 동안 격렬하게 소용돌이 (상층 액을 회수마다 600 ㎕를 100 μl를), 각각의 튜브에 단백질 침전 용액 200 μl를 추가합니다. </li><li> 샘플은 5 분 동안 얼음에 정착, 3 분 동안 11,000 XG에서 원심 분리 할 수​​ 있습니다. </li><li> RT 이소프로판올 300 μl를 포함하는 깨끗한 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송합니다. 부드럽게 반전으로 섞는다. </li><li>원심 분리기 샘플은 2 분 동안 11,000 XG에서 조심스럽게 상층 액을 제거하고 종이 타월에 튜브를 배출. </li><li> 각각의 튜브에 RT 70 % 에탄올 300 μl를 추가하고 부드럽게 펠렛을 씻어 반전. </li><li> 주의 깊게 11,000 2 분 XG, 그리고 원심 분리기 샘플은 에탄올을 모두 제거합니다. </li><li> 깨끗한 종이 타월에 튜브를 배출하고, 10 ~ 15 분간 자연 건조 펠렛을 할 수 있습니다. </li><li> DNA의 수분 보충 용액 50 μl의 각 펠렛와 소용돌이에의 RNase 솔루션의 1.5 μl를 추가합니다. </li><li> 5 초 동안 원심 분리기 샘플은 캡에서 모든 액체를 제거합니다. </li><li> 15 분 동안 37 ° C에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 1 시간 동안 65 ° C에서 샘플들을 배양하여 DNA를 재수. </li><li> 260 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA를 정량 분광 광도 (1.0 (260)는 판독 ~ 50 ㎍ / ml의 이중 가닥 DNA와 동등), 각각의 PCR 반응에서 200 ng를까지 사용한다. </li></ol> 7. RNA 분리에 대한효소-PCR 역. <ol><li> RNA 정제 키트 (재료의 표 참조)를 사용하여, minibeadbeater을 사용하여 효모 세포에서 RNA를 분리 제조업체의 지침을 따르십시오. </li><li> 260 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA의 농도를 정량화 (1.0의 260 독서에 해당 ml의 ~ 40 ㎍ / 단일 가닥 RNA를). </li><li> RT-PCR 키트 (재료의 표 참조)를 사용하여, 약 1 μg의 RNA의와 RT-PCR 반응을 설정하는 제조업체의 지침을 따르십시오. 이 연구에서 얻은 결과는 표 1에 열거 된 프라이머를 사용한다. </li></ol>

<ol><li>Price, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcusneoformans+requires+a+functional+glycolytic+pathway+for+disease+but+not+persistence+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host.</a> MBio. 2, e00103-e00111 (2011).</li>
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<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%27DiOlistic%27+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+dye+staining+of+Cryptococcusneoformans+extracellular+vesicles+and+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule.</a> Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).</li>
</ol>

우리는 공개할 것이 없습니다.

이 프로토콜을 활용하면, 선형 DNA가 상동 재조합에 의해 Cryptococcus neoformans 게놈의 원하는 유전자좌에 통합되는 생물학적 형질전환이 달성될 수 있습니다. 프로토콜의 특정 단계는 변환의 효과/효율성에 극적인 영향을 미칠 수 있습니다. 성공적인 형질전환을 위해서는 싹에 사용되는 DNA의 농도가 최소 1μg이어야 합니다. 그러나, 금 비드에 첨가된 DNA의 부피는 DNA 수율이 1μg 미만일 가능성이 있는 경우 증가할 수 있다(단계 3.4). 
또 다른 중요한 단계는 금 구슬의 DNA 코팅입니다. 준비 오류로 인해 DNA 준비 샘플의 비드 수가 충분하지 않으면 플레이트에 주사되는 DNA의 양이 감소합니다. DNA가 금 구슬에 로드된 후 생물 디스크에 피펫팅되어 건조시킵니다. 건조되면 직경 약 1cm의 눈에 보이는 금색 원이 디스크에 있어야 합니다. 이 원이 없다는 것은 금 구슬의 농도가 충분히 높지 않다는 것을 시사합니다. 금구슬 농도가 너무 낮...

중추신경계의 침습성 기회감염 병원균인 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)는 전 세계적으로 연간 625,000명 이상의 사망자를 초래하는 진균성 뇌수막염의 가장 흔한 원인입니다 1. 아세테이트는 크립토코칼 감염 시 주요 발효 산물로 밝혀졌으며 2,3,4 아세테이트 생성 경로로 추정되는 세 가지 경로에서 효소를 암호화하는 유전자는 감염 중에 상향 조절되는 것으로 나타났습니다 5. 이는 아세테이트 생산 및 수송이 병원성 과정의 필수적이고 필요한 부분일 수 있음을 시사합니다. 그러나 이것의 중요성은 아직 이해되지 않았습니다. 아세테이트 생산을 위한 한 가지 가능한 경로는 크실룰로스 5-인산/과당 6-인산 포스포케톨라제(Xfp) - 아세테이트 키나아제(Ack)로, 이전에는 박테리아에만 존재하는 것으로 생각되었으나 최근에는 진자균류와 C. neoformans 6을 포함한 담자균류 균류에서 확인되었습니다.
세포에서 이 경로의 이러한 효소의 국소화를 결정하기 위해, 형광 태그 mCherry(ACK:mCherry:Neo)에 대한 ACK 유전자 융합의 다운스트림에 네오마이신 내성 유전자를 운반하는 구조체를 잘 정립된 생물학적 형질전환 방법 7,8을 사용하여 C. neoformans에 도입합니다. 전기천공법(electroporation)은 에피솜(episome)으로 유지되는 플라스미드(plasmid)를 크립토코커스(Cryptococcus)9로 형질전환하기 위한 효율적인 방법이지만, 안정적인 상동성 형질전환체(homologous transformant)8를 생성하는 데에는 유용하지 않다. 유전자 총을 사용한 생물학적 전달만이 상동 재조합에 의해 게놈에 통합될 선형 DNA를 변환하는 효과적인 수단을 제공합니다. 예를 들어, Edman 등은 플라스미드-지용 URA5 선택 가능한 마커를 C. neoformansura5 돌연변이체로의 전기천공으로부터 생성된 형질전환체의 경우, 단지 0.001 내지 0.1%의 형질전환체가 안정적임을 보여주었다 9. Chang 등은 전기천공법을 사용하여 캡슐 생산을 재구성하여 acapsular mutant 10에서 0.25%의 안정적인 변환 효율을 달성했습니다. 전기천공법(electroporation)과 달리, 생물학적 형질전환은 변형되는 유전자에 따라 2-50%의 안정적인 형질전환 효율을 보이는 것으로 나타났습니다 7,8,11. 
이 시각적 실험은 선형 ACK:mCherry:Neo DNA 구조체가 C. neoformans로 생물학적으로 변형되는 과정을 단계별로 보여주고, ACK 유전자 자리에 상동 재조합을 통해 적절한 통합을 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 시연된 프로토콜은 Perfect laboratory 8에서 개발된 방법을 수정한 것입니다.

<table><tbody><tr><td>0.6 &무; m 골드 비즈</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>스페르마딘 프리 베이스</td><td>시그마- 알드리치</td><td>S0266</td><td>https://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>G418 - 황산염(네오마이신)</td><td>골드 생명공학</td><td>G-418-10</td><td></td></tr><tr><td>www.goldbio.com 하이그로마이신</td><td>골드 생명공학</td><td>H-270-1</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>1350psi 파열 디스크</td><td>바이오 라드</td><td>165-2330</td><td></td></tr><tr><td>http://www.bio-rad.com 정지 스크린</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Macrocarriers 디스크</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>YPD Broth</td><td>Becton Dickinson & Co.</td><td>242820</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>한천</td><td>Becton 디킨슨 & Co.</td><td>214530</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>소르비톨</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP439</td><td></td></tr><tr><td>http://www.fishersci.com PDS-1000/He 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axio</td><td>http://www.zeiss.com/microscopy</td></tr><tr><td>KOD 원스텝 PCR 키트</td><td>EMD Millipore</td><td>71086-4</td><td>http://www.emdmillipore.com</td></tr><tr><td>One 단계 RT-PCR 키트</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Wizard 게놈 DNA 정제 키트</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>www.promega.com</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Mini Beadbeater - 1</td><td>BioSpecs</td><td>3110BX</td><td>http://www.biospec.com</td></tr><tr><td>Microfuge 18 Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>F241.5P</td><td>www.beckmancoulter.com</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 분광 광도계</td><td>BioTek</td><td>EPOCH</td><td>www.biotek.com</td></tr></tbody></table>

편의적 곰팡이 병원균에 형광 태그 유전자의과 유전자 변형<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

담자균 크립토 콕 쿠스 네오 포르 만, 중추 신경계의 침입 기회 병원균은 전 세계적으로 전 세계적으로 연간 이상 625,000 명이 사망 진균 성 수막염의 가장 흔한 원인이다. 전기 천공은 크립토에서 플라스미드의 형질 전환을 위해 개발되었지만, 오직과 유전자 전달은 상동 재조합에 의해 게놈 내로 통합 될 수있는 선형 DNA를 변환하는 효과적인 수단을 제공한다. 아세트산 크립토 감염시 중요한 발효 산물 것으로 도시 하였지만, 이것의 의미는 아직 알려져 있지 않다. 효소 크실 로스 -5- 포스페이트 / 프 룩토 오스 -6- 포스페이트 phosphoketolase (XFP 광고) 및 아세테이트 키나아제 (ACK)로 구성된 세균 통로 C. 아세테이트의 제조를위한 세 개의 가능한 경로 중 하나이다 콕 쿠스 네오 포르 만. 여기, 우리는 구조의과 유전자 변형을 보여,긍정 응답을 코딩하는 유전자는 mCherry 형광 태그에 융합시킨 C. 콕 쿠스 네오 포르 만. 우리는 그 다음 ACK 궤적에 ACK -mCherry 융합의 통합을 확인합니다.

C.의 성공과 유전자 변형 콕 쿠스 네오 포르 만이 프로토콜 방식 (도 1)를 수행하여 얻을 수있다. DNA가 샷 (그림 2A)이 후과 유전자 변형으로, 코팅 된 골드 비즈의 성공적인 촬영은 접시에 보이는 골드 반지로 표시됩니다. 선택적 매체 상 YPD + 1M 소르비톨 플레이트로부터 세포를 회수 한 후 도금을 실온에서 방치 할 때 콜로니 4-5일 내에 표시한다. DNA의 2 μg의 변형은 20 ~ 30 식민지 (그림 2B)에서 발생한다. 식민지가 나타날 때, 그들은 개별 식민지에 대한 선택 배지에 restreaked해야합니다. 개별 콜로니를 YPD 배지에서 성장 될 수 있고, DNA 및 RNA 모두 적절한 통합 및 발현을 확인 PCR 및 RT-PCR을 통해 이러한 세포로부터 단리하고 분석 할 수있다. 이 프로토콜이 태그 유전자 융합에 사용되는 경우,이 ...

유전자 총 변형은 상동 재조합을 통하여 기회 병원체 크립토 콕 쿠스 네오 포르 만 스의 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합을 생성하는 데 사용되는 방법이다. 우리는 C. 콕 쿠스 네오 포르 만 스에 mCherry 형광 태그에 융합 된 유전자 부호화 아세테이트 키나아제를 갖는 구조, 유전자 총의 변화를 설명 할 것이다.

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

이 절차의 전반적인 목표는 형광 태그를 포함하는 선형 구조체의 생체 변형에 대한 단계별 시연을 제공하는 것입니다. 이것은 먼저 관심 DNA로 금 마이크로카 비드를 코팅하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서 DNA는 유전자 총에 의해 C neo forin 세포로 전달됩니다.그런 다음 형질전환된 세포를 플레이팅하고 DNA 구조체의 통합을 PCR 및 R-T-P-C-R로 평가합니다. 궁극적으로 형광 현미경은 상동 재조합을 통해 DNA 산물의 적절한 통합을 확인하는 데 사용됩니다. 전기천공법(electroporation)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 BIC 형질전환이 암호화 사무실의 게놈에 안정적으로 통합된다는 것입니다.성능에 가깝습니다. 이 기술을 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 타냐 테일러(Tanya Taylor)로, 이 기술에 능숙해졌습니다. 집게를 사용하여 주황색 매크로 캐리어 BIC 디스크를 100% 에탄올에 담근 다음 디스크가 건조제에 닿지 않도록 주의하면서 건조기가 들어 있는 큰 페트리 접시에 디스크를 옮깁니다.건조되면 디스크를 에탄올 닦은 은 디스크 홀더에 밀어 넣은 다음 금 구슬 튜브를 소용돌이치고 12마이크로리터의 비드 용액을 변형당 하나의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 분취합니다. 다음으로, 2마이크로그램의 DNA, 10마이크로리터의 염화칼슘, 2마이크로리터의 정자 프리베이스를 각 비드 튜브에 추가합니다. 각 샘플을 소용돌이.그런 다음 주변 온도에서 5분 동안 튜브를 배양하고 가끔 부드럽게 튕겨 소생시킵니다. 배양 펠릿의 끝에 침전된 구슬을 매달고, DNA가 코팅된 금 구슬을 매달고, 조심스럽게 스내트를 흡인합니다. 100% 에탄올 600마이크로리터에 비드를 완전히 재현탁시킨 다음 세포를 다시 펠렛화합니다.이번에는 8 마이크로 리터의 에탄올에 구슬을 현탁시킵니다. 이제 각 비드 튜브를 개별 BIC 디스크의 중앙에 직경 1cm 원으로 분배합니다. 구슬의 농도가 충분하면 각 디스크의 중앙에 금색 원이 보입니다.비드가 건조되면 유전자 건을 작동하려면 먼저 진공 펌프를 켠 다음 압력 게이지에서 약 2200PSI의 압력에 도달할 때까지 헬륨 탱크 손잡이를 시계 반대 방향으로 돌립니다. 그런 다음 왼쪽 빨간색 스위치를 뒤집어 유전자 건을 켜고 진공 청소기와 통풍구의 유속을 조정하여 진공 청소기가 28초 이내에 15인치의 수은에 도달하도록 합니다. 이때 파열 디스크와 매크로

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서는 단세포 해양 alga의 유전자 변형을...

Picoeukaryote의 게놈 변환<em&gt; Ostreococcus 타우 리</em

이 비디오에서는 배양된 세포에서 생물학적 유전자 총 매개 유전자 전달 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법은 최소한의 DNA를 사용하여 안정적인 유전자 변형을 할 수 있는 간단한 방법을 제공합니다.

Biolistic-Mediated Gene Transfer: Biolistic Gene Gun을 통해 표적 세포에 관심 유전자를 전달하는 기술

개발 변환 관리 및 생균제 효모 사카 boulardii에의 외래 단백질 발현을 테스트 할 수있는 기술의 통일 된 설명은 여기에 제시 하였다.

마우스의 구강 투여에 따라 생균제 효모의 변환 및 위장 면역 조직에서 그들의 복구

유전자 Ustilago이 maydis 검댕 곰팡이 조작에 우리는 강력한 유전자 교체 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 감염 표현형을 조사하기 위해 삭제 돌연변이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 형광 표지 단백질을 코딩하는 서열을 추가하여, 예를 들어, 임의의 방법으로 유전자를 수정하도록 확장 될 수있다.

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

PCR 매개 유전자 변형은 시각화 및 효모 세포 및 단백질의 정량을 용이 칸디다 종의 형광 단백질 융합체를 생성하기 위해 사용될 수있다. 여기서, 우리는 칸디다에서 형광 단백질 융합 (Eno1-FP)을 구축하기위한 전략을 제시한다.

에 형광 단백질 융합의 시대<em&gt; 칸디다</em&gt; 종

여기에 설명 된 세포 수준에서 동물의 조직에서 세균 유전자 발현을 분석 하기 위한 방법이입니다. 이 메서드는 감염 동안 조직 환경에 대 한 응답에서 세균성 인구 내에서 발생 하는 phenotypic 다양성을 공부에 대 한 리소스를 제공 합니다.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

이 문서는 칸디다 알비칸스 ABC (ATP 결합 카세트) 단백질 Cdr1의 특성화를위한 소규모 플라즈마 막 격리 프로토콜을 제시, 사카로미세스 cerevisiae에서 과발현. 프로테아제-클레이블 C-단말 mGFPCdr1과 태그 사이에 16잔류 링커를 장착한 이중 태그는 Cdr1의 정제 및 세제 스크리닝을 용이하게 하도록 설계되었습니다.

칸디다 알비칸스 Cdr1-mGFPHis 분석을 위한 소규모 플라즈마 멤브레인 준비

토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

이 원고는 비침습적 공초점 현미경을 사용하여 포유류 숙주에서 활성 감염 동안 형태 형성 표현형에 대해 중간 크기의 칸 디다 알비칸스 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 설명합니다.

포유류 숙주에서 활성 감염 중 칸디다 알비칸스 돌연변이 균주에서 형태형성 표현형을 스크리닝하기 위한 생체 내 이미징 사용

이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 Saccharomyces eubayanus 의 전사 활성을 측정하여 포도당에서 맥아당으로의 전이를 모니터링함으로써 대사 적응의 실시간 분석을 가능하게 하고 다양한 조건에서 산업 발효를 위한 균주 최적화를 지원합니다.

생체 내 Monitoring of transcriptional activity during metabolic transition using a bioluminescent reporter in yeast(효모의 생물발광 리포터를 사용한 대사 전이 중 전사 활동 모니터링)

배우세요 Cryptococcus neoformans에서 형광 태그를 이용한 생물학적 전환법으로 안정적인 DNA 통합을 수행하는 방법을. 금 미세입자 코팅과 유전자총 전달, PCR 및 형광 현미경 확인 기법을 활용합니다.

편의적 곰팡이 병원균에 형광 태그 유전자의과 유전자 변형

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