Name: Transformação Biolistic de uma fluorescente Tagged Gene para o oportunista fúngica Pathogen Cryptococcus neoformans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a transformação biolística para integração de DNA marcado com fluorescência no patógeno fúngico oportunista Cryptococcus neoformans. Este método permite a integração estável via recombinação homóloga.

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Este trabalho foi apoiado por prêmios da Fundação Nacional de Ciência (Award # 0920274) e da Carolina do Sul Experiment Station Projeto SC-1700340. Este papel isTechnical Contribuição No. 6283 da Estação Experimental da Universidade Clemson. Os autores agradecem ao Dr. Lukasz Kozubowski por seu conselho útil no desenvolvimento deste protocolo final e Dr. Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, e Grace Kisirkoi por sua leitura crítica do manuscrito.

NOTA: O esquema geral deste protocolo é descrito na Figura 1. 1. C. neoformans Preparação <ol><li> Para cada reacção de transformação, um crescer 2-3 ml O / N cultura de C. neoformans em meio YPD a 30 ° C com agitação a 250 rpm. </li><li> Centrifuga-se a cultura D / N durante 5 min a 900 xg a 10 ° C e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender cada pelete de células em 300 ul de levedura peptona dextrose (YPD) médio. </li><li> Usando grânulos de vidro, espalhar suavemente a 300 ul da suspensão de células lavadas em agar YPD, contendo 1 M de sorbitol. </li><li> Permitir placas a secar à temperatura ambiente durante 3-4 h. </li></ol> 2. Ouro microtransportador Preparação <ol><li> Ressuspender 0,25 g de 0,6 mm de contas de ouro de 1 ml de ddH2O, centrifugar durante 1 minuto a 900 xg para sedimentar as pérolas, e remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as contas de ouro em 1 ml de etanol a 100%. &lt;/ Li&gt; <li> Distribuir os grânulos em 4 tubos, 250 uL de cada, e adicionar 750 ul de etanol a 100%. </li><li> Loja de ouro cordão alíquotas a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparação DNA <ol><li> Prepare discos microtransportador biolísticos laranja, submergindo-os em 100% de etanol, usando uma pinça. Coloque os discos em uma grande placa de petri contendo drierite para secar (certifique-se a drierite não toca nos discos). </li><li> Depois de seco, pressione os discos microtransportador nos suportes de disco de prata (previamente limpo com 100% de etanol). </li><li> Vortex grânulos preparados de ouro (tal como no passo 2) e alíquotas de 12 ul num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, um tubo por transformação. </li><li> Adicionar a cada tubo, a fim: 2 ^ g de ADN (preferencialmente 2 ul de 1 mg / mL de ADN), 10 ul de 2,5 M de CaCl2, e 2 mL de 1 M de base livre de espermidina. </li><li> Configurar um controle negativo como no passo 3.4, mas sem DNA. </li><li> Vortex cada tubo e incubar à temperatura ambiente durante5 min. Agite suavemente cada tubo, ocasionalmente, para voltar a suspender as contas liquidadas durante esta incubação. </li><li> Tubos de centrifugação a 225 xg durante 30 seg para sedimentar as pérolas de ouro revestidas com DNA. Remova cuidadosamente o sobrenadante (por pipetagem ou aspiração) e descarte. </li><li> Grânulos Ressuspender completamente em 600 mL de etanol a 100% por lentamente pipetagem cima e para baixo. </li><li> Girar os tubos a 225 xg durante 30 seg para sedimentar as pérolas sem embalagem. Cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as contas de ouro revestidas com ADN em 8 mL de etanol a 100% por lentamente pipetando para cima e para baixo. </li><li> Pipetar as pérolas de ouro revestidas com DNA para o centro do disco biolística em 1 cm de diâmetro e deixe secar. NOTA: Um círculo ouro seco visível no centro do disco biolística indica que uma concentração suficiente de esferas de ouro está presente. NOTA: Os discos microtransportador carregados com esferas de ouro revestidas com DNA estão agora prontos para utilização com a pistola de genes. </li></ol> 4. OPERACIONAL o Gene Gun <ol><li> Ligue a bomba de vácuo. </li><li> Ligue o gás hélio, girando o botão para a esquerda até uma pressão de aproximadamente 2.200 psi é atingido no manômetro. </li><li> Ligue a arma gene lançando o botão vermelho do lado esquerdo. </li><li> Certifique-se que as taxas de fluxo para o vácuo e a ventilação são ajustados de modo a vácuo atingirá 28 polegadas de Hg no prazo de 15 seg. </li><li> Certifique-se a distância entre o disco de ruptura e microtransportador é de aproximadamente 3/8 de polegada. </li><li> Limpe a câmara inteira limpando-se com etanol. </li><li> Mergulhe os discos de ruptura em etanol 100%. Deixa-se secar sobre uma superfície estéril (por exemplo, uma placa de Petri). </li><li> Use uma chave de torque para soltar o suporte do disco de ruptura. Insira um disco de ruptura limpa para o suporte. Parafuso do suporte do disco de ruptura de volta no lugar e aperte com chave de torque, girando-o uma vez para a direita. NOTA: Discos de segurança será substituído após cada tiro. </li><li> Mergulhe the telas de malha em 100% de etanol. Deixa-se secar sobre uma superfície estéril (por exemplo, uma placa de Petri). </li><li> Depois de seco, coloque uma tela de malha lavado na placa de montagem em plástico branco. Coloque o lado DNA suporte do disco microtransportador para dentro da câmara de disco. Parafuso na tampa de prata, e colocar a placa de montagem na ranhura mais alto. NOTA: A tela de malha será substituído depois de cada tiro. </li><li> Colocar uma placa de agar YPD, contendo 1 M de sorbitol na placa de fundo. </li><li> Feche a porta da câmara e encaixado. </li><li> Empurre e segure o botão vermelho do meio até se envolver vácuo e permitir que o vácuo para chegar a 28 polegadas de Hg. Uma vez que o nível de vácuo adequado é alcançado, mover este interruptor para a posição para baixo. Quando estiver pronto, mantenha pressionado o botão vermelho à direita para disparar. Quando o disco de ruptura aparece, solte imediatamente o botão de fogo e empurre o botão vermelho do meio para a posição do meio para ventilar a câmara a 0 psi. </li><li> Limpe os restos de disco de ruptura e desligar o gene gun. Em seguida, desligue o helium gás girando o botão no sentido horário, e, finalmente, desligar a bomba de vácuo. </li></ol> 5. As células transformadas Galvanização <ol><li> Permitir que as placas de transformação para sentar-se à TA durante 4 h, para permitir que as células se recuperar. </li><li> Pipetar 700 l de meio YPD na placa. Use um raspador de células para raspar suavemente as células fora do líquido agar e pipeta em um estéril 1,5 ml microtubo. Repetir esta etapa para assegurar que todas as células foram recuperadas a partir da placa. </li><li> Sedimentar as células a 225 xg durante 30 seg. Retire e elimine o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 500 ul de meio YPD. </li><li> Pipete 100 pi da suspensão de células para o centro das placas com antibiótico + YPD e espalhado utilizando esferas de vidro. </li><li> Deixar as placas invertidas a TA durante 3-4 dias. Como colônias aparecer, remendo em novo YPD + placas com antibiótico. </li></ol> 6. Isolamento de ADN genómico para PCR NOTA: Esta é uma versão modificada usando o reagentes a partir de um kit de purificação de ADN (ver o quadro de Materiais). <ol><li> Crescer uma cultura de 5 ml de cada um dos C. neoformans transformantes em meio YPD líquido a 30 ° C com agitação a 250 rpm O / N. </li><li> Agregar 3 ml de células a 900 xg, e ressuspender em 600 ul de solução de lise núcleos. </li><li> Adicionar a suspensão para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com 200 ul de ácido 0,5 milímetros pérolas de vidro lavadas. </li><li> Homogeneizar durante 45 segundos num mini-beadbeater à temperatura ambiente, o tubo fresco em gelo, e repetir. </li><li> Permitir amostra assente em gelo durante 2 min e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml. Adicionar 200 uL de solução de precipitação de proteína a cada tubo, (100 ul por cada 600 ul de sobrenadante recuperado) e agitar vigorosamente em vórtice durante 20 seg. </li><li> Deixar as amostras em repouso sobre gel durante 5 minutos, e centrifugar a 11.000 xg durante 3 min. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml limpo contendo 300 mL de isopropanol temperatura ambiente. Misture suavemente por inversão. </li><li>Centrifugar as amostras a 11.000 xg por 2 min, retire cuidadosamente o sobrenadante, e drenar os tubos para toalhas de papel. </li><li> Adicionar 300 ul de etanol 70% de RT a cada tubo, e inverter suavemente para lavar o sedimento. </li><li> Centrifugar as amostras a 11.000 xg durante 2 min, e cuidadosamente remover todo o etanol. </li><li> Escorra o tubo sobre toalhas de papel limpo, e permitir que o pellet secar ao ar durante 10-15 min. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de re-hidratação de DNA e 1,5 ul de uma solução de ARNase a cada sedimento e vortex. </li><li> Centrifugar as amostras durante 5 segundos para remover todo o líquido da tampa. </li><li> Incubar as amostras a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Re-hidratar o ADN por incubação das amostras a 65 ° C durante 1 h. </li><li> ADN quantificar espectrofotometricamente por medição da absorvância a 260 nm (A 260 uma leitura de 1,0 é equivalente a ~ 50 ug / ADN de cadeia dupla ml), e utilizar-se para 200 ng de cada reacção de PCR. </li></ol> 7. Isolamento de ARN paraTranscriptase reversa-PCR. <ol><li> Utilizando um kit de purificação de RNA (ver o quadro de Materiais), siga as instruções do fabricante para isolar o ARN a partir de células de levedura usando um minibeadbeater. </li><li> Quantificar a concentração de ARN por medição da absorvância a 260 nm (260 A uma leitura de 1,0 é equivalente a ~ 40 ug / ml de ARN de cadeia simples). </li><li> Utilizando um estojo de RT-PCR (ver o quadro de Materiais), siga as instruções do fabricante para criar reacções de RT-PCR com cerca de 1 ug de ARN. Para os resultados obtidos no presente estudo, utilizar os iniciadores listados na Tabela 1. </li></ol>

<ol><li>Price, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcusneoformans+requires+a+functional+glycolytic+pathway+for+disease+but+not+persistence+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host.</a> MBio. 2, e00103-e00111 (2011).</li>
<li>Bubb, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteronuclear+NMR+studies+of+metabolites+produced+by+Cryptococcusneoformans+in+culture+media%3A+identification+of+possible+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors.</a> Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).</li>
<li>Himmelreich, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+metabolites+of+importance+in+the+pathogenesis+of+pulmonary+cryptococcoma+using+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).</li>
<li>Wright, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+released+by+Cryptococcusneoformans+var.+neoformans+and+var.+gattii+differentially+affect+human+neutrophil+function%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function.</a> Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).</li>
<li>Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+adaptation+in+Cryptococcusneoformans+during+early+murine+pulmonary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection.</a> Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).</li>
<li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+kinase%3A+not+just+a+bacterial+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Acetate kinase: not just a bacterial enzyme.</a> Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).</li>
<li>Davidson, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+biolistic+transformation+in+serotype+D+strains+of+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%3A+FG+%26+B%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans.</a> Fungal Genet Biol: FG & B. 29, 38-48 (2000).</li>
<li>Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+in+Cryptococcusneoformans+by+use+of+biolistic+delivery+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA.</a> J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).</li>
<li>Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+URA5+gene+from+Cryptococcusneoformans+var.+neoformans+and+its+use+as+a+selective+marker+for+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation.</a> Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).</li>
<li>Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+of+a+capsule-deficient+mutation+of+Cryptococcus+neoformans+restores+its+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence.</a> Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).</li>
<li>Del Poeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+is+essential+in+Cryptococcusneoformans%3A+role+In+pathobiology+and+as+an+antifungal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target.</a> Genetics. 152, 167-178 (1999).</li>
<li>McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+transformation+of+Cryptococcusneoformans+and+Cryptococcusgattii+by+Agrobacteriumtumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%3AFG+%26+B%22%5BJournal%5D)">High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens.</a> Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).</li>
<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%27DiOlistic%27+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+dye+staining+of+Cryptococcusneoformans+extracellular+vesicles+and+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule.</a> Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Utilizando este protocolo, a transformação biolística pode ser realizada na qual o DNA linear é integrado em um locus desejado no genoma de Cryptococcus neoformans por recombinação homóloga. Certas etapas do protocolo podem ter um efeito dramático na eficácia/eficiência da transformação. Para uma transformação bem-sucedida, é imperativo que o DNA utilizado na parte aérea tenha uma concentração de pelo menos 1 μg. No entanto, o volume de DNA adicionado às contas de ouro pode ser aumentado na chance de o rendiment...

Cryptococcus neoformans, um patógeno oportunista invasivo do sistema nervoso central, é a causa mais frequente de meningite fúngica, resultando em mais de 625.000 mortes por ano em todo o mundo 1. O acetato demonstrou ser um importante produto de fermentação durante a infecção criptocócica 2,3,4, e os genes que codificam enzimas de três possíveis vias de produção de acetato demonstraram ser regulados positivamente durante a infecção 5. Isso sugere que a produção e o transporte de acetato podem ser uma parte necessária e exigida do processo patogênico; no entanto, o significado disso ainda não é compreendido. Uma possível via para a produção de acetato é a xilulose 5-fosfato / frutose 6-fosfato fosfocetolase (Xfp) - acetato quinase (Ack), uma via anteriormente considerada presente apenas em bactérias, mas recentemente identificada tanto em euascomiceto quanto em fungos basidiomicetos, incluindo C. neoformans 6.
Para determinar a localização dessas enzimas dessa via na célula, uma construção carregando um gene de resistência à neomicina a jusante de uma fusão do gene ACK para a marca fluorescente mCherry (ACK:mCherry:Neo) será introduzida em C. neoformans usando o método bem estabelecido de transformação biolística 7,8. Embora a eletroporação seja um método eficiente para a transformação de plasmídeos que serão mantidos como epissomos em Cryptococcus 9, ela não é útil na criação de transformantes homólogos estáveis 8. Somente a entrega biolística usando uma arma genética fornece um meio eficaz de transformar DNAs lineares que serão integrados ao genoma por recombinação homóloga. Por exemplo, Edman et al. mostraram que dos transformantes resultantes da eletroporação de um marcador selecionável URA5 transportado por plasmídeo em mutantes ura5 de C. neoformans, apenas 0,001 a 0,1% dos transformantes eram estáveis 9. Chang et al. alcançaram apenas uma eficiência de transformação estável de 0,25% usando eletroporação para reconstituir a produção de cápsulas em um mutante acapsular 10. Ao contrário da eletroporação, a transformação biolística demonstrou resultar em eficiência de transformação estável de 2-50%, dependendo do gene que está sendo alterado 7,8,11. 
Este experimento visual fornecerá uma demonstração passo a passo da transformação biolística da construção linear do DNA ACK:mCherry:Neo em C. neoformans e descreverá como confirmar sua integração adequada por meio de recombinação homóloga no locus ack. O protocolo aqui demonstrado é uma modificação do método desenvolvido no laboratório Perfect 8.

<table><tbody><tr><td>0,6 &mu; m contas de ouro</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Base livre de espermidina</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S0266</td><td>https://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>G418 - Sulfato (Neomicina)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G-418-10</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>H-270-1</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>1350 psi Discos de ruptura</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Telas de parada</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Discos de macrotransportadores</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>YPD Caldo</td><td>Becton Dickinson & Co.</td><td>242820</td><td></td></tr><tr><td>www.bd.com Agar</td><td>Becton Dickinson & Co.</td><td>214530</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td>http://www.fishersci.com</td></tr><tr><td>PDS-1000/He System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257 http://www.bio-rad.com</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>Axio</td><td>http://www.zeiss.com/microscopy</td></tr><tr><td>KOD One Step PCR Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>71086-4</td><td>http://www.emdmillipore.com</td></tr><tr><td>One Kit de RT-PCR Step</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Wizard Kit de Purificação de DNA Genômico</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>www.promega.com</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Beadbeater - 1</td><td>BioSpecs</td><td>3110BX</td><td>http://www.biospec.com</td></tr><tr><td>Microfuge 18 Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>F241.5P</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro de microplacas</td> www.beckmancoulter.com <td>BioTek</td><td>EPOCH</td><td>www.biotek.com</td></tr></tbody></table>

transformação biolistic de uma fluorescente tagged gene para o oportunista fúngica pathogen<em&gt; cryptococcus neoformans</em

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

O basidiomycete Cryptococcus neoformans, um patógeno oportunista invasiva do sistema nervoso central, é a causa mais freqüente de meningite fúngica em todo o mundo, resultando em mais de 625 mil mortes por ano em todo o mundo. Embora electroporação foi desenvolvida para a transformação de plasmídeos em Cryptococcus, apenas entrega biolística fornece um meio eficaz para transformar o ADN linear que pode ser integrado no genoma por recombinação homóloga. Acetato tem sido demonstrado ser um importante produto de fermentação durante a infecção criptocócica, mas o significado de tal ainda não é conhecida. Uma via bacteriana composto das enzimas xilulose-5-fosfato / frutose-6-fosfato phosphoketolase (Xfp) e cinase de etilo (ACK) é uma das três vias possíveis para a produção de etilo em C. neoformans. Aqui, demonstramos a transformação biolística de uma construção,que o gene que codifica Ack fundido com o marcador fluorescente mCherry, em C. neoformans. Nós, então, confirmar a integração da fusão ACK -mCherry no locus ACK.

A transformação bem sucedida de biolística C. neoformans pode ser obtida com a seguinte esquema de protocolo (Figura 1). Com a transformação biolística, um ensaio bem sucedida das contas de ouro revestidas é indicado por um anel de ouro visível na chapa após o ADN é tiro (Figura 2A). Colônias deve aparecer dentro de 4 a 5 dias, quando deixada à temperatura ambiente após o plaqueamento das células recuperadas das placas de sorbitol YPD + 1M em mídia seletiva. Transformando 2 ug ...

Biolistic transformação é um método usado para gerar a integração estável de ADN no genoma das oportunistas Cryptococcus neoformans patogénio através de recombinação homóloga. Iremos demonstrar transformação biolística de uma construção, o qual tem o gene que codifica a quinase de etilo fundido com o marcador fluorescente mCherry em C. neoformans.

Transformação Biolistic de uma fluorescente Tagged Gene para o oportunista fúngica Pathogen<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma demonstração passo a passo da transformação biótica de uma construção linear que contém uma etiqueta fluorescente. Isso é feito primeiro revestindo contas de microcarros de ouro com o DNA de interesse. Na segunda etapa, o DNA é transferido para as células C neo forin por arma genética.As células transformadas são então plaqueadas e a integração da construção do DNA é avaliada por PCR e RTPCR. Em última análise, a microscopia fluorescente é usada para confirmar a integração adequada do produto de DNA por meio de recombinação homóloga. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a eletroporação, é que a transformação BIC resulta em uma integração estável no genoma do escritório de criptografia.Quase desempenho. Demonstrando essa técnica está Tanya Taylor, uma estudante de doutorado em meu laboratório que se tornou proficiente nessa técnica. Comece usando uma pinça para submergir os discos BIC macroportadores laranja em 100% de etanol e, em seguida, transfira os discos para uma grande placa de Petri contendo secador, tomando cuidado para que os discos não toquem no dessecante.Uma vez a seco, pressione os disco

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Este artigo apresenta um protocolo de isolamento de membrana plasmática de pequena escala para a caracterização da proteína Cdr1 (cassete de ligação ATP) da Candida ABC (fita adesão a ATP), superexpressa em Saccharomyces cerevisiae. Uma mGFPC terminal de protease com um linker de 16 resíduos entre o Cdr1 e a tag foi projetada para facilitar a purificação e o detergente-triagem do Cdr1.

Preparação de membrana plasmática em pequena escala para a análise de cânbicas cânbicas cdr1-mGFPHis

Devido à opacidade do solo, as interações entre seus micróbios constituintes não podem ser facilmente visualizadas com resolução celular. Aqui, são apresentadas duas ferramentas microfluidas, que oferecem novas oportunidades para investigar interações fúngicas-microbianas. Os dispositivos são versáteis e simples de usar, permitindo alto controle espesso e imagens de alta resolução no nível celular.

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

Este manuscrito descreve um método para triagem de bibliotecas mutantes de Candida albicans de tamanho moderado para fenótipos de morfogênese durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero usando microscopia confocal não invasiva.

Uso de imagens in vivo para rastrear fenótipos de morfogênese em cepas mutantes de Candida albicans durante a infecção ativa em um hospedeiro mamífero

Este protocolo emprega um repórter bioluminescente, permitindo medições da atividade transcricional em Saccharomyces eubayanus para monitorar a transição glicose-maltose, permitindo a análise em tempo real das adaptações metabólicas e apoiando a otimização da cepa para fermentação industrial sob diversas condições.

In vivo Monitoramento da atividade transcricional durante a transição metabólica usando um repórter bioluminescente em levedura

Aprenda a transformação biolística para integração de DNA marcado com fluorescência no patógeno fúngico oportunista Cryptococcus neoformans. Este método permite a integração estável via recombinação homóloga.

Transformação Biolistic de uma fluorescente Tagged Gene para o oportunista fúngica Pathogen

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