Name: בVivo ההערכה של מכרסמים Plasmodium Parasitemia וMerozoite פלישה על ידי cytometry הזרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: למדו פרוטוקול cytometry זרימה להערכת פלישת merozoite וparasitemia בדגם עכברים של מלריה. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של פרמטרי הדבקה ותורמת להבנת דינמיקת המלריה בבVivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מכירים במימון התמיכה מהמועצה למחקר הבריאות והרפואה הלאומי (להעניק APP605524, 490,037 ו1,047,082), המועצה האוסטרלית למחקר (להעניק DP12010061), האסטרטגיה המחקר המשותפת התשתיות הלאומיות של אוסטרליה ושל קרן החינוך להשקעה מהמחלקה לחדשנות, תעשייה , מדע ומחקר. PML הוא נמען של הפרס שלאחר התואר הראשון באוסטרליה.

כל הנהלים בוצעו בהתאם למדיניות של אוניברסיטת Macquarie והותאמו למועצה הלאומית לבריאות והמחקר רפואי (NHMRC) הקוד אוסטרלי של תרגול. העבודה בוצעה תחת האתיקה הסכם לא ARA 2012/017 אושר והתקבל מוועדת האתיקה בבעלי חיים באוניברסיטת Macquarie. כל הניסויים בוצעו על עכברי SJL / J אלא אם צוין אחרת. 1. עכברים וזיהום ניסיון מלריה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי בית תחת טמפרטורה מבוקרת (21 מעלות צלזיוס) עם מחזור אור-חושך 00:12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של פ cryopreserved DS Adami chabaudi עם 5% RBCs parasitized (pRBCs) ולהזריק 200 μl לתוך חלל intraperitoneal של C57BL / 6 עכבר תורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג parasitemia עכבר תורם כל 1-2 ימים באמצעות cytometry זרימה כפי שתואר בסעיף 3 - 4 לפרוטוקול זה. ברגע שמגיעים לתורמים 5 - parasitemia 15%, לאסוף דם על ידי לנקב לב כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">לשאוב מפתרון הפרין (300 U הפרין / מיליליטר בפתרון העכבר Ringer (MTR) (154 מ&quot;מ NaCl, 5.6 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2.2 מ&quot;מ CaCl 2, 20 מ&quot;מ HEPES 100 μl, 10 גלוקוז מ&quot;מ, 30 U / ml הפרין, pH 7.4, 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר)) לתוך מזרק 1 מיליליטר עם מחט 26 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי שאיפה עם isofluorane 5%, המאשר את העומק הרצוי של הרדמה על ידי היעדר תגובת נסיגת דוושה ורפלקסים של קרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על צידו ומחט להכניס ניצב ממש מתחת למרפק, דרך הצלעות, ואל תוך הלב. משוך את בוכנת מזרק באיטיות ובלסובב מחט עד 0.5-1 מיליליטר של דם מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע המתת חסד הומנית נקע בצוואר רחם בהרדמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את pRBCs לכל נפח של דם תורם בהנחת ספירה של 9 x 10 6 RBC / μl (דם כלומר, אם התורם היה ב 10% parasitemia כאשר הקריבו, דם יכיל 9 x 10 5pRBC / μl). לדלל דם parasitized בקרבס נאגר מלוח (126 מ&quot;מ NaCl, 2.5 מ&quot;מ KCl, 25 מ&quot;מ NaHCO 3, 1.2 מ&quot;מ לאא 2 PO 4, 1.2 מ&quot;מ MgCl 2, 2.5 מ&quot;מ CaCl 2, גלוקוז 0.2%, pH 7.2, 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר) כך שהריכוז הוא 1 x 10 4 pRBCs ל-200 μl ולהזריק 200 μl לתוך חלל intraperitoneal של עכברים הנדרשים לתיוג RBC וניסוי עירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג parasitemia כל 1-2 ימים באמצעות cytometry זרימה כמתואר בסעיפים 3-4 לפרוטוקול זה. </li></ol> 2. תיוג של RBCs ועירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם heparinized מעכברים ידי לנקב לב כמתואר בשלב 1.3, ומניח על קרח. לשמור על דם על 4 מעלות צלזיוס בכל העת. לאסוף כ -200 דם μl לכל עכבר להיות מוזרק. במידת צורך, לפצל דם לשתי דגימות ולטפל דגימה אחת כרצוי. הערה: בדרך זו, פלישה של samp טופלניתן להשוות le לשליטה, לדוגמא מטופל (ראה איור 1 עבור סכמטית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 2x של כל תווית RBC ניאון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 2 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות של Atto 633-N-Hydroxysuccinimide (Atto 633-NHS) בMTR, כך שהריכוז הוא 20 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 25 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות של ביוטין-N-Hydroxysuccinimide (ביוטין-NHS) בMTR, כך שהריכוז הוא 250 מיקרוגרם / מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול דגימות דם לשני צינורות ולהוסיף נפח שווה של פתרון 633-NHS 2x Atto לצינור אחד, ונפח שווה של 2x יוטין-NHS לצינור האחר. מערבבים מייד. דגירה דם על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם ערבוב איטי קבוע, או לחלופין, לערבב מדגם כל 10 - 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים שכותרתו דם עם MTRC (MTR 0.5% אלבומין + סרום שור (BSA), 0.22 מסנן מיקרומטר מעוקר) כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לפחות 2 כרכים של MTRC, צנטריפוגות ב 750 XG במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, וresuspenד גלולה בלפחות 2 כרכים של MTRC. חזור על פי 2 יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופיים, צנטריפוגות ב 750 XG דקות ו -5 לשלב דם pelleted בשילובים שונים (כלומר, שלא טופל Atto 633 / ביוטין טופל, ביוטין שלא טופל / טופל Atto 633). להוסיף MTR לעשות עד נפח של 200 μl לכל עכבר להיות מוזרקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק דם שכותרתו intravascularly לעכברים נגועים במלריה מכרסם או בקרות נגוע כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע עירוי של 2 - parasitemia 15% בשיאו של רְבִיַת שֶׁסַע הטפיל. הערה: זה קורה בערך באמצע הדרך דרך המחזור הכהה (כלומר, בין 12-2 בבוקר במחזור אור רגיל, או 12-2 בערב במחזור אור הפוך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים חמים באמצעות מנורת חום למשך 5-10 דקות כדי להגביר את זרימת דם, אך לנקוט באמצעי זהירות שלא לחמם יותר מדי את העכברים. מניחים עכברים במכשיר הרחקה וintravascularly להזריק 200 μl דם שכותרתו (כ 1 - 2 x 10 RB 9Cs) דרך וריד הזנב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות דם בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה כפי שתואר בסעיף 3. ניתן לכמת שיעורי פלישה פחות מ -10 דקות לאחר הזרקה, בהתאם לparasitemia של עכבר הנמען: הערה. </li></ol> 3. איסוף דגימות דם והכנה לcytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 μl של פתרון מכתים לדגימה, בתוספת נוספת, ביום של הניסוי כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של 6 מ&quot;מ JC-1 המאוחסן ב -20 ° C בsulfoxide דימתיל (DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 μl החם של MTRC לדגימה, בתוספת נוספת, עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד ברציפות vortexing MTRC מראש חימם, להוסיף JC-1, כך שהריכוז הסופי הוא 12 מיקרומטר. הדבר נעשה כדי להפחית את היווצרות JC-1 אגרגטים; אם מצרפים אין טופס, לעשות צינור לא צנטריפוגות כמו זה יהיה למנוע הכתמה. הערה: כמות קטנה של צבירה לא תשפיע על תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אנטיCD45 APC eFluor 780 ואנטי-CD71 PerCP eFluor 710, כך שהריכוז הסופי הוא מיקרוגרם / מיליליטר 1. אם ביצוע ניסוי RBC שכותרתו, להוסיף streptavidin PE-Cy7 כך שהריכוז הסופי הוא מיקרוגרם / מיליליטר 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע דימום זנב על ידי קטיעה של קצה הזנב או קריעה של כלי הדם בתוך הזנב. מניחים ירידה של דם זנב על שקופית לשקול סירה או זכוכית קטנה. לאחר איסוף דם, לוודא שדימום הפסק. פיפטה 3 μl דם זנב לתוך 50 μl של פתרון מכתים מראש לחמם 37 ° C ו דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של 4 מ&quot;מ Hoechst 33342 מאוחסן ב -20 ° C במים מזוקקים (אם באמצעות לייזר 355 ננומטר) או 2 מ&quot;מ Hoechst 34580 מאוחסן ב -20 ° C במים מזוקקים (אם באמצעות לייזר 405 ננומטר). הכן 500 μl לדגימה, בתוספת נוספת, של פתרון 4 מיקרומטר או 2 מיקרומטר של Hoechst בMTRC, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 4 מיקרומטר Hoechst33342 או 2 מיקרומטר Hoechst 34580 לדגימות לדגור על RT במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 750 XG במשך 3 דקות על 4 מעלות צלזיוס, supernatant קלפים שנזרקו, להוסיף 700 μl MTRC ולנתח ידי cytometry זרימה. </li></ol> 4. cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות באמצעות לייזר 355/488/633 ננומטר או 405/488/633 מכשיר לייזר ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מסנן דרך מסננת תא 35 מיקרומטר מייד לפני הניתוח. יש לשטוף את מסננת תא במים מזוקקים בין דגימות ושימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט מספיק אירועים, כך שהאוכלוסייה הקטנה ביותר מכילה לפחות 500 אירועים (בדרך כלל 1,000,000 - 10,000,000 אירועים הכולל לדוגמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Excite Hoechst 33342 באמצעות לייזר 355 nm ולזהות אירועים דרך מסנן 460/50. Excite Hoechst 34580 באמצעות לייזר 405 nm ולזהות אירועים דרך מסנן 460/50. Excite JC-1, אנטי-CD71 PerCP eFluor 710 וstreptavidin PE-Cy7 באמצעות לייזר 488 ננומטר ולזהות אירועים דרך 530/40, 692/40, ו750LP לסנן בהתאמהly. Excite Atto 633 ואנטי-CD45 APC eFluor 780 באמצעות לייזר 633 ננומטר ולזהות אירועים דרך מסנן 670/30 או 750LP בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח ופיצוי באמצעות זרימה מתאימה cytometry תוכנת ניתוח כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תאים שלמים ולא לכלול רעש, פסולת, וטסיות דם המבוססת על FSC מאפיינים / SSC (איור 2 א). בחר תאים בודדים המבוססים על או רוחב דופק הדק (איור 2) או על ידי שימוש באזור שיא FSC יחס גובה (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר RBCs הבוגר, ולא לכלול אבות RBC וכדוריות דם לבנות, המבוסס על הקרינה שלילית בPerCP eFluor 710 וAPC eFluor 780 הערוצים (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ביצוע ניסוי RBC המסומן, בחר כל אוכלוסייה של RBCs שכותרתו מבוסס על PE-Cy7 וAtto 633 הקרינה ולנתח בנפרד (איור 3 א) אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר pRBCs המבוסס על הקרינה חיובית עבור שני JC-1 וHoechst ( <strאונג&gt; איור 2E-H). </li></ol></li></ol> 5. חישובים וסטטיסטיקות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב parasitemia על ידי חלוקת מספר pRBCs במספר הכולל של תאי דם אדומים (כלומר, מספר האירועים בQ2 שער מחולק במספר האירועים בG4 שער). בעת ביצוע parasitemia assay הפלישה של שתי האוכלוסיות שכותרתו יכולה להיות מחושב על ידי חלוקת מספר pRBCs שכותרתו במספר RBCs שכותרתו באוכלוסייה ש( כלומר, מספר האירועים שנמצאים בשני L1 השערים וQ2, מחולק במספר האירועים בשער L1). הערה: parasitemia תווית משתנה במידה ניכרת בהתאם לגורמים כגון parasitemia ומספר merozoites במחזור אנדוגני. מסיבה זו, כדאי לדווח על יחס parasitemia, המחושב כparasitemia של המטופלים האוכלוסייה שהכותרת מחולקת בparasitemia של אוכלוסיית השליטה שכותרתו בכל עכבר בודד. כדי לתקן את השפעות צבע אפשריות, דו&quot;ח תוצאותזה יחס parasitemia ממוצע על פני שני שילובי הצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע מובהקות סטטיסטיות של יחסים באמצעות דגימה אחת -test t עם 1 כממוצע היפותטי. </li></ol>

<ol><li>Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+malaria+parasite-infected+blood+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry.</a> Cytometry. 4 (3), 228-237 (1983).</li>
<li>Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+rapid+quantification+of+parasitemia+in+fixed+malaria+cultures+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry.</a> Exp Parasitol. 62 (2), 275-282 (1986).</li>
<li>Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange%3A+a+new+dye+for+Plasmodium+species+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis.</a> Cytometry. 8 (6), 568-570 (1987).</li>
<li>Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+hydroethidine+and+flow+cytometry+to+assess+the+effects+of+leukocytes+on+the+malarial+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 2 (4), 417-425 (1995).</li>
<li>Pattanapanyasat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+malaria+parasites+in+two+different+red+blood+cell+populations+using+biotin+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry.</a> Cytometry. 25 (3), 287-294 (1996).</li>
<li>Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Plasmodium+falciparum+growth+and+development+by+UV+flow+cytometry+using+an+optimized+Hoechst-thiazole+orange+staining+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy.</a> Cytometry A. 73 (6), 546-554 (2008).</li>
<li>Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptable+two-color+flow+cytometric+assay+to+quantitate+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites.</a> Cytometry A. 77 (11), 1067-1074 (2010).</li>
<li>Bei, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+assay+for+measuring+invasion+of+red+blood+cells+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum.</a> Am J Hematol. 85 (4), 234-237 (2010).</li>
<li>Clark, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBC+barcoding+allows+for+the+study+of+erythrocyte+population+dynamics+and+P.+falciparum+merozoite+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion.</a> PLoS One. 9 (7), e101041(2014).</li>
<li>Malleret, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+robust+tri-color+flow+cytometry+assay+for+monitoring+malaria+parasite+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development.</a> Sci Rep. 1 (118), (2011).</li>
<li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+Plasmodium-infected+erythrocytes+in+murine+models+of+malaria+by+flow+cytometry+using+bidimensional+assessment+of+SYTO-16+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence.</a> Cytometry A. 75 (3), 225-235 (2009).</li>
<li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+detection+specificity+of+Plasmodium-infected+murine+erythrocytes+by+flow+cytometry+using+autofluorescence+and+YOYO-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1.</a> Cytometry A. 67 (1), 27-36 (2005).</li>
<li>Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+Plasmodium+parasitemia+by+flow+cytometry+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy.</a> J Korean Med Sci. 27 (10), 1137-1142 (2012).</li>
<li>Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+assay+to+quantify+invasion+of+red+blood+cells+by+rodent+Plasmodium+parasites+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo.</a> Malar J. 13 (1), 100(2014).</li>
<li>Morohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+abnormalities+in+the+spleen+of+an+mFtz-F1+gene-disrupted+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse.</a> Blood. 93 (5), 1586-1594 (1999).</li>
<li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+platelet+abnormalities+in+Berkeley+sickle+cell+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice.</a> Blood Cells Mol Dis. 41 (1), 109-118 (2008).</li>
<li>Duraisingh, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+of+Plasmodium+falciparum+merozoite+proteins+directs+receptor+targeting+for+invasion+of+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes.</a> EMBO J. 22 (5), 1047-1057 (2003).</li>
<li>Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+field+isolates+commonly+use+erythrocyte+invasion+pathways+that+are+independent+of+sialic+acid+residues+of+glycophorin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A.</a> Infect Immun. 67 (11), 5784-5791 (1999).</li>
<li>Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+switching+mechanism+in+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum.</a> J Clin Invest. 86 (2), 618-624 (1990).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

יש לנו תיארתי שיטה למדידה של שתי פלישת parasitemia וmerozoite של דגימות in vivo. במונחים של מדידת parasitemia, שיטה זו מציעה יתרון על פני שיטות קודמות 10-13 שבHJ-RBCs ניתן להבחין בין pRBCs, ובכך להפחית את מספר האירועים חיוביים כוזבים. בעוד HJ-RBCs הוא בדרך כלל נדיר בבני אדם, כמה מחקרים מדווחים על רמות גבוהות בעכברים 15,16 עושים ההבחנה בין תאים אלה וpRBCs החשובים למדידה מדויקת של parasitemia מכרסמים. באמצעות שיטה זו המגבלה של זיהוי לparasitemia הוא כ ...

התסמינים הקליניים הקשורים למלריה מתרחשים במהלך מחזור השכפול הא-מיני של טפיל הפלסמודיום בתוך תאי הדם האדומים (RBCs). מרוזואיטים, המשתחררים בשלב הכבד של הזיהום, נצמדים במהירות ל-RBCs ופולשים אליהם. לאחר שנכנס לתא, הטפיל גדל ומתבגר, בסופו של דבר עובר סכיזוגוניה, מפצל את התא ומשחרר מקבץ של מרוזואיטים שזה עתה נוצרו וחוזרים על מחזור זה. ככזה, הערכה של זיהום במלריה כרוכה לעתים קרובות במעקב אחר טפילים, שהוא אחוז ה-RBCs המנוכסים על ידי טפיל אחד או יותר, ושיעור פלישת המרוזואיט ל-RBCs לא נגועים. 
ציטומטריית זרימה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לתעד את המאפיינים של מספר עצום של תאים בפרק זמן קצר. לטכניקה זו יש ישימות ברורה למדידת טפילי מלריה ופלישה, ומציעה מספר יתרונות על פני טכניקות מיקרוסקופיה מסורתיות. אלה כוללים מדידה מדויקת של טפילים נמוכים מאוד, אשר תיקח זמן רב על ידי מיקרוסקופיה, האופי הבלתי משוחד של המדידה והיכולת למדוד מספר פרמטרים של תאים בו זמנית. ציטומטריית זרימה נמצאת בשימוש נרחב לקביעת פלישת טפילים ומרוזואיט בתרבית חוץ גופית 1-9, עם זאת, טכניקות למדידת פרמטרים אלה in vivo פחות מפותחות, ועלולות להיות מסובכות על ידי נוכחותם של סוגי תאים נוספים המפריעים לניתוח. לא תוארו בדיקות למדידת פלישה in vivo, ובעוד שקיימות כמה בדיקות לניתוח טפילות in vivo, אלה חסרות את היכולת להבחין בין RBCs טפיליים (pRBCs) לבין RBCs המכילים גופי האוול-ג'ולי (HJ-RBCs)10-13. הנושא המאוחר חשוב במיוחד מכיוון שבעכברים HJ-RBCs עשויים להוות עד 0.9% מה-RBCs הבוגרים14-16, ובכך למנוע מדידה מדויקת של טפילים נמוכים. 
הדגמנו בעבר גישה למדידת פלישת טפילים ומרוזואיט במודל מכרסמים של זיהום במלריה14. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט יותר וסרטון נלווה. גישה זו מתבססת על מתודולוגיות קודמות ומאפשרת זיהוי מדויק של RBCs טפילים, להבדיל מלויקוציטים, אבות RBC ו-HJ-RBCs. בנוסף, בדיקה זו מאפשרת מדידה בו-זמנית של פלישת מרוזואיט לשתי אוכלוסיות RBC מסומנות, אוכלוסייה מטופלת או יעד ואוכלוסיית ביקורת, ובכך מספקת פלטפורמה חזקה להערכת פלישה לסוגי תאים שונים.

<table><tbody><tr><td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Hoechst 33342. אחסן פתרון מלאי של 4 מ"מ ב-20 מעלות; C במים מזוקקים</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63493</td><td>אחסן תמיסת מלאי של 2 מ"מ ב-20 מעלות; C במים מזוקקים</td></tr><tr><td>JC-1 Dye</td><td>Life Technologies</td><td>T-3168</td><td>אחסן מכסות קטנות של תמיסת מלאי של 6 מ"מ ב-20 מעלות; C ב-DMSO</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-0451-80</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0711-80</td><td>Clone R17217</td></tr><tr><td>Atto 633 NHS</td><td>ester Sigma-Aldrich</td><td>1464</td><td>Atto 633-NHS. אחסן תמיסת מלאי של 2 מ"ג/מ"ל בטמפרטורה של -20 מעלות; C ב- DMF</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21335</td><td>Biotin-NHS. אחסן תמיסת מלאי של 25 מ"ג/מ"ל בטמפרטורה של -20 מעלות; C ב-DMF</td></tr><tr><td>סטרפטווידין PE-ציאנין7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td>סטרפטווידין PE-Cy7</td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H478</td><td></td></tr><tr><td>35 ומיקרו; צינורות כובע מסנן M</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה: BD LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה: BD FACSria II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה: BD Influx</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה: CyAn ADP מנתח</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בvivo ההערכה של מכרסמים plasmodium parasitemia וmerozoite פלישה על ידי cytometry הזרימה

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

במהלך זיהום בשלב הדם, טפילי מלריה פולשים, מתבגרים ומשתכפלים בתוך תאי הדם האדומים (RBCs). התוצאה היא מחזור גדילה קבוע ועלייה אקספוננציאלית בשיעור ה-RBCs הנגועים במלריה, המכונה טפילים. אנו מתארים פרוטוקול מבוסס זרימה ציטומטרית המשתמש בשילוב של צבע ה-DNA Hoechst, וצבע פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, JC-1, כדי לזהות RBCs המכילים טפילים ולכן את הטפילים, של דגימות דם in vivo מעכברים נגועים ב-Plasmodium chabaudi adami DS. באמצעות גישה זו, בשילוב עם נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים, ניתן להבחין בין תאי דם אדומים טפיליים לבין לויקוציטים, אבות RBC ו-RBCs המכילים גופי האוול-ג'ולי (HJ-RBCs), עם מגבלת זיהוי של 0.007% טפילים. בנוסף, אנו מתארים שיטה להערכה השוואתית של פלישת מרוזואיט לשתי אוכלוסיות RBC שונות. בבדיקה זו RBCs, המסומנים בשתי תרכובות נפרדות הניתנות לזיהוי על ידי ציטומטריית זרימה, מועברים לעכברים נגועים. לאחר מכן ניתן להעריך את שיעור הפלישה היחסי לשתי האוכלוסיות על ידי זרימה ציטומטרית על סמך שיעור ה-RBCs הטפילים בכל אוכלוסייה לאורך זמן. גישה משולבת זו מאפשרת מדידה מדויקת של פלישת טפילים ומרוזואיט במודל in vivo של זיהום במלריה.

מדידה של parasitemia. למדידה parasitemia, צריכים להיות ראשון שנבחרו תאי דם, ורעש, פסולת וטסיות דם נשללו, המבוססים על מאפייני FSC / SSC (איור 2 א). בהתאם לcytometer משמש, אז צריכים להיות נבחרו תאים בודדים המבוססים על או רוחב דופק הדק (איור 2), או גובה שיא FSC ליחס שטח (איור 2 ג). נותר אירועים צריכים להיות מורכבים של לויקוציטים, מוכתם חיובי לAPC eFluor 780, אבות RBC (...

פולש טפיל המלריה והמשכפל בתוך תאי דם אדומים. ההערכה מדויקת של פלישת merozoite וparasitemia לכן חיונית בהערכה במהלך הידבקות במלריה. כאן אנו מתארים זרימה cytometry פרוטוקול מבוסס למדידת הפרמטרים הללו במודל עכבר של מלריה.

בVivo ההערכה של מכרסמים Plasmodium Parasitemia וMerozoite פלישה על ידי cytometry הזרימה

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד חדירה של טפילי malaria מסוג parat ו-mezo במודל עכבר של זיהום במלריה. הדבר מושג תחילה על ידי איסוף דם מבעלי חיים שאינם מזוהמים. לאחר מכן, תאי הדם האדומים מסומנים בתגי פלואורסצנציה ומוזרקים לבעלי חיים מזוהמים.לאחר מכן נאספות דגימות דם מהעכברים המודבקים ומסומנות בנוגדנים כנגד סממני פני השטח הרלוונטיים של התאים. לבסוף, ניתן למדוד באמצעות אנליזה של ציטומטריה זרימתית (flow cytometry) את מספר התאים שלא היו מזוהמים אשר פלשו אליהם *Plasmodium shabo meite*, כמו גם את רמת הפראזיטמיה הכוללת של בעלי החיים המודבקים. לפיכך, היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות למדידת פלישת meite ופראזיטמיה הוא שהבדיקה מבוצעת in vivo, ובכך היא מאפשרת לבחון גורמים כגון השפעת מערכת החיסון.בדרך זו ניתן לתשובת כמה שאלות מפתח בתחום המלריה, כגון מהם הגורמים הספציפיים המעורבים בחדירת המרונזית לתאי דם אדומים. לפני תחילת הבדיקה, השג שש עד שמונה עכברים הומואים ב-Plasmodium shabo בריכוז פרזיטמיה של 2% עד 15%, כשלוש שעות לפני העברה. אסוף 200 µL של דם עם הפרין מכל עכבר, שיוחליפו זריקות מבעלי חיים לא נגועים באמצעות דקירה של הלב. חלק את הדם לשתי מנות שוות עבור הדגימות המטופלות והבלתי מטופלות, והנח את המבחנות על קרח.בשלב הבא, חלק את הדגימות לשתי מנות שוות נוספות כל אחת. לאחר מכן, הוסף ל

in-vivo-assessment-rodent-plasmodium-parasitemia-merozoite-invasion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

חוצה גנטי של טפילי מלריה מכרסם מבוצעות על ידי האכלה two טפילים שונים גנטית יתושים. הצאצאים רקומביננטי הם משובטים מהדם לאחר עכבר המאפשר יתושים לנשוך עכברים נגועים. סרט הווידאו הזה מראה איך לייצר צלבי הגנטי...

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

אנחנו מראים את השיטה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הטחול בעזרת ה-GFP טפילי מלריה מהונדס ואת כימות של ניידות טפיל ואת זרימת הדם בתוך איבר זה.

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

סרטון זה מדגים בדיקת פאגוציטוזיס מבוססת ציטומטריה של זרימה הכוללת אריתרוציטים נגועים בפלסמודיום פלציפרום מסומנים ואופסוניים על ידי מונוציטים. ציטומטריית זרימה מזהה פלואורסצנטיות במונוציטים, המאשרת את הזיהוי המוצלח של אריתרוציטים opsonized באמצעות phagocytosis.

בדיקה לכימות פגוציטוזה בתיווך נוגדנים של אריתרוציטים נגועים בטפילים

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפילים במקרופאגים שמקורם במח עצם (BMM). תאי המקרופאגים נגועים בשלבים הפולשניים התנועתיים והלא תנועתיים של לישמניה, פרומסטיגוטים מטאציקליים ואמסטיגוטים, בהתאמה. הטפילים פולשים למקרופאגים, מופנמים לחלל טפילי ומתרבים בפנים. צמיחת הטפיל התוך-תאי מכומתת באמצעות מיקרוסקופ על צביעה פלואורסצנטית של גרעיני המקרופאגים והטפילים.

בדיקה חוץ גופית לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפיל במקרופאגים

שיטה לבידוד של לויקוציטים הדלקתי חסיד מכלי דם...

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

מאמר זה מדווח על שיטה מפורטת למדידה דינמית וכימות של מהירות זרימת הדם בתוך כלי דם בודדים של כלי הדם בכבד העכבר באמצעות הדמיית מיקרוסקופיה תוך-חיונית בשילוב עם מתודולוגיה ספציפית לרכישת וניתוח תמונה.

מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא<em&gt; שושנת יריחו</em&gt; זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה

קשה לשכפל הדבקה משותפת בבני אדם במבחנה. עם זאת, טפילי מלריה אנושיים ניתנים לתרבית בקלות במבחנה, כמו גם תאים חד-גרעיניים מבודדים מדם היקפי אנושי שנדבקו באופן טבעי ב-HIV. זה מספק מודל מצוין לחקר תגובות חיסוניות מוקדמות לטפילי מלריה בהקשר של הדבקה משותפת ב-HIV.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל למדידה של מערכת חיסונית למלריה בהקשר של HIV Co-זיהום

אנו מתארים מודל עכבר של מלריה מוחית ניסיונית ומראים כיצד ניתן לעקוב אחר פתולוגיה דלקתית ומיקרו-וסקולרית in vivo באמצעות הדמיית תהודה מגנטית.

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

כאן אנו מתארים שיטה חדשה כדי לעזור להבהיר את מנגנוני החסינות התאית פלסמודיום בשלב הדם של זיהום. זוהי בדיקת מבחנה המודדת הרג תאי דם אדומים נגועים על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים.

במבחנה בדיקה של הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים

למדו פרוטוקול cytometry זרימה להערכת פלישת merozoite וparasitemia בדגם עכברים של מלריה. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של פרמטרי הדבקה ותורמת להבנת דינמיקת המלריה בבVivo.

בVivo ההערכה של מכרסמים Plasmodium Parasitemia וMerozoite פלישה על ידי cytometry הזרימה

גלה סרטונים נוספים