Name: בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: למדו בידול עצבי של תאי גזע עכבריים עובריים בשיטת שכבה בודדת ללא סרום. הפרוטוקול כולל ציפוי ג'לטין, דילול לצפיפות מתאימה ואישור באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה מומנה על ידי מלגת פיתוח וקידום מדע וטכנולוגיה ממשרד החינוך התאילנדי ל-W.W. ומענקים מ-Tenovus ו-Anonymous Trust ל-M.P.S.

1. הכנת מדיה הערה: הפרוטוקול מסתמך על השימוש בשילוב של שני כלי התקשורת נפרד: DMEM / F12 בתוספת תוסף שונה N2 וNeurobasal השלים עם תוסף B27, בדרך כלל בביחס של 1: 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תוספת N2 שונה על ידי ערבוב הרכיבים בשפופרת 15 מיליליטר. לא מערבולת או לסנן זה; מערבב על ידי היפוך הצינור עד הפתרון הוא ברור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי pipetting 7.2 מיליליטר של DMEM / F12, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של 25 מ&quot;ג / מיליליטר אינסולין (המורכב ב0.01 M HCl) ומערבבים היטב על ידי צינור היפוך. זה לוקח כמה דקות עד שהפתרון הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של 100 מ&quot;ג / מיליליטר apo-transferrin (מורכב במים), 33 μl של 0.6 מ&quot;ג / מיליליטר progesternone (מורכב באתנול), של 160 מ&quot;ג / מיליליטר (1 מ &#39;) פוטרסין 100 μl (מורכב במים ), 10 μl של 3 מ&quot;מ הסלניום נתרן (מורכבים במים) וμl 666 של 7.5% אלבומין בסרום שור ומערבבים היטב הצינור. Aliquot לתוך 2.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 °C עד 2 חודשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התקשורת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מיליליטר של DMEM / F12 להוסיף 2.5 מיליליטר של N2. מערבבים היטב, אבל לא ללחוץ או מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מיליליטר של Neurobasal תקשורת להוסיף 5 מיליליטר של תוסף B27. מערבבים היטב, אבל לא ללחוץ או מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התקשורת מ1.2.1 צעדים ו1.2.2 ביחס של 1: 1. בחלק מהמקרים 1: ייתכן שתידרש 3 תערובת (בתוספת כ1: תערובת 1 בצעד 1.2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתערובת להוסיף 0.5 מיליליטר של L-גלוטמין (ריכוז סופי 0.2 מ&quot;מ) ושל 3.5 μl של 2-mercaptoethanol (ריכוז סופי 0.1 מ&quot;מ) ומערבבים היטב בלי ללחוץ. אחסן את המדיה ב- C ° 4 עד 3 שבועות ולהימנע מחשיפה לאור. מיקס סופי זה נקרא N2B27. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ג&#39;לטין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון ג&#39;לטין 1% במי ultrapure וחיטוי ב 121 ° C, 15 psi, במשך 15 דקות. חשוב שהבקבוק משמש לכך הוא נקי לחלוטין מחומרי ניקוי או חומרי חיטוי, ולכן מומלץ שבקבוק חדש הואמשמש לזה ואי זה רק לשטוף במי ultrapure בין שימושים. Aliquot פתרון 1% ל -50 aliquots מיליליטר ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם aliquot של ג&#39;לטין 1% באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה ולהוסיף 500 מיליליטר של תמיסת מלח חם שנאגרו פוספט (PBS). מערבבים היטב וpipet מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של כל טוב או צלחת. לאפשר את הג&#39;לטין למעייל המשטח לפחות 30 דקות. </li></ol></li></ol> 2. ציפוי התאים הערה: פרוטוקול זה חל באופן שווה על ESC העכבר גדל בסרום% 10 עם גורם מעכב לוקמיה (LIF), החלפת סרום עם LIF או סרום ללא מדיה עם חלבון LIF והמוךפו&quot;גנטי עצם 4 (BMP4) או מעכבי MEK וGSK3 (תקשורת 2i) עם או בלי LIF. עם זאת, העיתוי והיעילות של הבידול עשוי להשתנות בהתאם לתקשורת ותאים (ראה דיון). לניסויים המוצגים כאן השתמשנו בקו 46C עכבר ESC (שיש לו כתב EGFP דפק לone של אללים Sox1 אנדוגני), גדל בGMEM עם סרום 10% וLIF. לקבלת תוצאות אופטימליות חשוב שהתאים הם ניתקו וreplated בתקשורת N2B27; פשוט המשתנה של תקשורת מGMEM / סרום / LIF לN2B27 תמיד תוצאות ביעילות בידול מופחתת בהשוואה לreplating התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התאים בGMEM עם סרום 10%, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, חומצות אמינו לא חיוניות 1x, 0.1 מ &#39;2-mercaptoethanol, ו 100 יחידות / מיליליטר LIF 13. כדי לקבל תרבות subconfluent של העכבר ESC, צלחת 1 x 10 6 תאים לבקבוק תרבות T25 שייקח 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב תאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. כאשר התאים subconfluent ומוכנים למעבר, לשטוף אותם פעמים PBS. הוסף 1 מיליליטר של מגיב תא דיסוציאציה ולחזור לחממה עבור 2-5 דקות. למרות טריפסין ואנזימים אחרים יכולים לשמש גם לתא דיסוציאציה, הם יכולים להיות השפעה שלילית על קובץ מצורף תא כך צפיפות הציפוי צריכה להיות adjusted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים מתחילים להרים מהצלחת, הקש על הכלי כדי לסלק אותם להשעית תא בודדת. לאסוף את התאים לסכום כולל של 10 מיליליטר של תקשורת ותא דיסוציאציה מגיב וpipet לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים ב XG 300 דקות 3 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של N2B27 מראש חימם על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-5 פעמים. כאשר pipetting ההשעיה למטה, pipet נגד הצד של הצינור, כדי למנוע יצירת בועות. ספירת התאים עם דלפק תא אוטומטי או haemocytometer ולהקליט את הריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן השעיה תא המכילה את המספר הרצוי של תאים ליחידת הנפח להיות מצופה בכל טוב בN2B27 מראש חימם. צפיפות של 10,500 תאים לכל 2 סנטימטר בצלחת 6 היטב (כלומר, 1 x 10 5 תאים לכל גם מנה 6 היטב) הוא אופטימלית. ראה טבלת 1 למספר הציע של תאים לכל 2 סנטימטר וPLAכרכי תקשורת טינג עבור מגוון רחב של כלי תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ג&#39;לטין מכלי התרבות וצלחת ההשעיה התא לפי הצפיפות הציעה ונפח בטבלה 1. אל מערבולת הצלחות כמו זה להתרכז התאים למרכז. מניחים את התרבויות בחממה לחה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות תקשורת כל 1-2 ימים על ידי החלפת כל התקשורת עם N2B27 הטרי. פיפטה בעדינות כמו שטיפת התאים עשויים להשפיע על צפיפות ולהפחית את יעילות בידול בימים הבאים. איפה כדאיות ראשונית לאחר הציפוי היא עניה, צלחת התאים ב1: 3 שילוב של תקשורת N2 ותוספת-B27 ולשנות את זה לN2B27 אחרי היומיים הראשונים. תאים יתחילו להבחין וצריכה להראות ביטוי Sox1 (גלוי על ידי הקרינה ירוקה של הכתב בקו 46C התא משמש כאן) בתוך 4-6 ימים. </li></ol> 3. Immunofluorescent מכתים NOTE: הפרוטוקול יכול להיות מיושם על כל סוג כלי. הנפח של כל מגיב מתואר בכל טוב של 6-גם צלחת וניתן לשנותם לכל שטח פנים. Replating אינו מומלץ בשל הכדאיות הנמוכה לאחר מכן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני בידול ולתקן את התאים על ידי הוספת 500 μl של 4% (V / V) paraformaldehyde, להשאיר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף וpermeabilize התאים עם 2 מיליליטר של PBS-T (שנאגרו מלוח פוספט עם 0.5% (V / V) tween-20) פעמיים. יכולים להיות כל הזמן בתאים PBS-T של עד 2 חודשים ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף PBS-T עם 1 מיליליטר של PBS-T עם 10% (V / V) בסרום (מאותו המין כמו נוגדנים משני). דגירה שעה 1 בנדנדת הצלחת ב RT לחסום כל מחייב שאינו ספציפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מיליליטר של PBS-T, והדגירה בIgG עכבר 500 μl נגד βIII טובולין (בדילול 1: 1,000 ב PBS-T עם סרום 10%). לשים על הנדנדה הצלחת, ולהשאיר O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהצעד הזה, תמיד להגן על כלי השיטמהאור. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS-T, ולאחר מכן להוסיף 500 μl של נוגדן שכותרת הקרינה אנטי העכבר IgG (בדילול 2 מיקרוגרם / מיליליטר PBS-T עם סרום 10%). שים את זה על הנדנדה הצלחת עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS-T, ולאחר מכן להוסיף 500 μl של DAPI (בדילול 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ב PBS-T) ולהשאיר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים שוב ולשמור אותם בPBS-T. תאים מוכנים להצטלם ויכולים להישמר לתקופה של עד 2 שבועות על 4 מעלות צלזיוס. שים לב שאות ה- GFP מתעמעמת עם זמן, כך אין זה ראוי להשוות את עוצמת ה- GFP של תאים קבועים וחיים או של תאים קבועים בזמנים שונים. </li></ol>

<ol><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li>
<li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li>
<li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+orchestrates+fibroblast+growth+factor+signalling+to+drive+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 137, 881-890 (2010).</li>
<li>Speakman, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li>
<li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells%3A+a+new+ES+cell+regulatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li>
<li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li>
<li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול הבידול העצבי monolayer כבר בשימוש במשך יותר מעשור 6. הפרוטוקול הוא יעיל ביותר, מורכב מבינוני מוגדרים, ונעשה במערכת monolayer מה שהופך את המערכת מתאימה יותר לפרה-קליני (למשל, הקרנת סמים) משתמשת. עם זאת, ישנם כמה גורמים קריטיים הקובעים את יעילות בידול. מאמר זה מצביע על גורמים אלה והפתרון לכל מכשול. צפיפות של התאים לאחר ציפוי במצב הבידול היא אולי הגורם הקריטי ביותר. ציפוי התאים בצפיפות ג...

תאי גזע עובריים הם תאי pluripotent נגזרו מהעובר המוקדם עם היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן במבחנה תוך השמירה על היכולת להתמיין לכל סוגי התאים בוגרים הבאים השבה לעובר בשלב מתאים (על ידי יצירת חזיון תעתועים), הזרקה למארחי syngeneic או מדוכאי חיסון (על ידי יצירת תפלצת) או בנושא המבחנה 1 רמזים מתאימים. הבידול במבחנה של תאי גזע העובריים של עכבר לשושלות עצביות תואר לראשונה בשנת 1995 ומעורב ההיווצרות של אגרגטים השעיה תאיים (גופי embryoid, EBS) בתקשורת סרום המכיל תוספת החומצה רטינואית מורפוגן 2-4. מאז מגוון רחב של פרוטוקולים פותחו כדי לאפשר בידול עצבי 5. רב עדיין לנצל צבירה, אחרים תרבות משותפים עם גרימת סוגי תאים וכמה כרוכים בשימוש בסרום ללא מדיה. כל הפרוטוקולים יתרונותND חסרונות ואת האופי המדויק של עצבי או תאים עצביים המיוצרים גם משתנים בהתאם לפרוטוקול בשימוש. הפרוטוקול האידיאלי יהיה חזק, ניתן להרחבה ולעשות שימוש באמצעי תקשורת ומצעים מוגדרים באופן מלא, להיות נוח לניטור לא פולשני של תהליך הבידול ולגרום לדור של אוכלוסיות טהורות של אבות עצביים יכול להיות בדוגמת ידי רמזים חיצוניים ולהבדיל לכל תת עצבי וגליה עם יעילות גבוהה ותשואה בזמן קצר יחסית. בעשרות השנים האחרונות שכבר משתמשים בשיטה ליצירת אבות עצביים ותאי עצב מהעכבר ESC בצפיפות נמוכה, תרבות monolayer חסיד סרום ללא 6-10. פרוטוקול זה ממלא רב של הקריטריונים המפורטים לעיל: בידיים שלנו את היעילות של בידול כבר די עקבית לאורך שנים רבות ומגוון של שורות תאים, וניתן לשנות אותו או למטה (אנו משתמשים בהצלחה כלי מ96-גם צלחות ל די קוטר 15 סנטימטריםshes) והתקשורת משמשת הם מוגדר היטב. התהליך ניתנים למיקרוסקופיה בהילוך איטי לניטור של הבידול ומגוון של רמזי דפוסים ניתן להוסיף כדי לגרום לדור של סוגים שונים של תת עצביים (למשל, ששש וFgf8 לנוירונים דופאמין 6). עם זאת, יש כמה אתגרים ליישום המוצלח של פרוטוקול זה. אחד ההיבטים המרכזיים הוא הכנה קפדנית של התקשורת. אנחנו תמיד להכין את התקשורת בבית למרות זמינותן של חלופות מסחריות. יש שינויים על תקן גרסאות זמינות מסחרי, אחד התוספים המשמשים (ראה פרוטוקול N2). לבסוף, אחד הצעדים החשובים ביותר ליישום מוצלח של שיטה זו היא צפיפות התאים האופטימלית בציפוי. זה בעיקר בגלל זמן שטבע autocrine של אחד מאותות התרמה (Fgf4 11) דורש כי תאים מספיקים נוכחים כדי לאפשר viabil האופטימליity ובידול, בבידול צפיפויות גבוהות מדי הנו פגום (אולי בחלק בשל ייצור autocrine של 12 LIF). לכן חשוב שהכנת שתי התקשורת וציפוי תא מבוצעות בזהירות ובעקביות כדי להבטיח תוצאות אופטימליות.

<table><tbody><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 תוסף, Life Technologies ללא סרום</td><td></td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>סיגמא</td><td>I6634</td><td>להרכיב מחדש עם סטרילי 0.01 M HCl</td></tr><tr><td>אפו-טרנספרין</td><td>סיגמא</td><td>T1147</td><td>להרכיב מחדש עם מים סטריליים</td></tr><tr><td>פרוגסטרון</td><td>סיגמא</td><td>P8783</td><td>להרכיב מחדש עם אתנול</td></tr><tr><td>פוטרסין</td><td>סיגמא</td><td>P5780</td><td>להרכיב מחדש עם מים סטריליים</td></tr><tr><td>נתרן סלניט</td><td>סיגמא</td><td>S5261</td><td>להרכיב מחדש במים סטריליים</td></tr><tr><td>שבר אלבומין בקר V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>ודא שהוא מומס לחלוטין לפני השימוש מכיוון שגלוטמין בדרך כלל משקע</td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 6 בארות</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 24 בארות</td><td>תרמו Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 96 בארות</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>גורם מעכב לוקמיה</td><td>שהוכן בבית כמו ב- Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td> <td>Sigma</td><td>D9542</td><td>הגן מפני</td></tr><tr><td>אור עכבר אנטי ובטא; III טובולין נוגדן IgG</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr> נוגדן <tr><td>IgG נגד עכבר עם תווית פלואורסצנטית</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>הגן מפני</td></tr><tr><td>אור 25 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמות</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

היכולת להבחין בתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) לאבות עצביים מאפשרת המחקר של מנגנוני שליטה מפרט עצבי, כמו גם את הדור של סוגי תאים עצביים בוגרים למחקר נוסף. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לבידול של ESC לאבות עצביים באמצעות, תרבות monolayer סרום ללא. השיטה היא מדרגי, יעילה וגורמת לייצור של תאים עצביים ~ 70% בתוך 4-6 ימים. זה יכול להיות מיושם על ESC מזנים שונים גדלו תחת מגוון רחב של תנאים. יכולים להיות מותר אבות עצביים להבחין נוספת לנוירונים וגליה או ניתח תפקודיים על ידי מיקרוסקופ, cytometry זרימה או מולקולרי טכניקות. תהליך ההתמיינות ניתנים למיקרוסקופיה זמן לשגות ויכול להיות משולב עם השימוש בקווי כתב כדי לפקח על תהליך המפרט העצבי. אנו מספקים הוראות מפורטות על הכנת תקשורת וצפיפות תאי אופטימיזציה כדי לאפשר את התהליך לbהדואר חל על רוב קווי ESC ומגוון כלי תרבית תאים.

בניסוי זה, השתמשנו בקו תא 46C 14, תאי גזע עובריים של עכבר עם כתב Sox1-GFP אנדוגני, כדי לעקוב אחר בידול עצבי. באמצעות קו זה תא, ביטוי של Sox1, סמן עצבי, יכול להיות מזוהה על ידי הקרינה ירוקה. ציפוי צפיפות מהווה גורם קריטי להשגת בידול עצבי. תאי גזע עוברי של עכבר היו מצופים בצלחת 6-גם בצפיפויות שונות משתנות מ10,500 ל88,500 תאים / 2 סנטימטר. איור 1 א מציג את יעילות בידול מושגת על ידי צפיפות ציפוי שונה בצלחת 6 היטב. ביום 6 של בידול, תאים היו קבועים...

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את השיטה ליצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים בשיטה חד-שכבתית נטולת סרום. ניתן להשתמש באבות אלה כדי לגזור סוגי תאים עצביים בוגרים או לחקור את תהליך המפרט העצבי והם ניתנים לקנה מידה של פורמט מרובה בארות עבור סינון מורכב.

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגזור תאי גזע עובריים של עכבר לשושלת עצבית בתרבית תאים בשכבה אחת ללא סרום. דבר זה מושג תחילה על ידי ציפוי כלי התרבית בג'לטין. בשלב השני, תאי הגזע העובריים מופרדים לתליה של תאים בודדים בתווך גזירה ומדוללים לצפיפות הזריעה המתאימה.בשלב הסופי, התאים נזרעים על פלטה מצופה ב-gel ENC. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה כדי לאשש את הצלחתה של הדיפרנציאציה על ידי ויזואליזציה של סממנים עצביים רלוונטיים. בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקשיים, שכן זריעה בצפיפות המתאימה היא קריטית להשגת דיפרנציאציה טובה.ישנם מספר גורמים המשפיעים על צפיפות הזריעה הן באופן ישיר והן באופן עקיף. לפני זריעת התאים, חממו מנה של 1%gelatin באמבט מים של 37 °C עד להמסה מלאה. לאחר מכן, ערבבו את ה-gelatin עם 500 milliliters של PBS חמים וכסו את תחתית כלי תרבית התאים בכמות מספקת של התמיסה כדי לצפות את הפנימה בזמן שה-gelatin נספג.שטפו את תרבית תאי הגזע העובריים של עכבר שאינה נמצאת בקונופלואנס (sub confluent) פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של ריאגנט לפירוק (dissociation reagent) לתרבית. לאחר שתיים עד חמש דקות, הקישו על הכלי כדי לשחרר את השכבה החד-שכבתית (monolayer) לתליה של תאים בודדים (single cell suspension), ואספו את התרבית לנפח כולל של 10 מיליליטר של מצע וריאגנט לפירוק תאים.העבירו את התאים למבחנה קונית בנפח 50 מיליליטר והספירו אותם בצנטריפוגה. לאחר שאיבה זהירה של הנוזל העליון (supernatant), השעיקו מחדש את המשקע ב-10 מיליליטר של N2B27 שחומם מראש, על ידי דפיקה קלה של המבחנה כנגד הדופן. כדי למנוע היווצרות בועות, ספרו כעת את התאים, רשמו את הריכוז והשעיקו אותם מחדש ב-N2B27 שחומם מראש, לפי מספר התאים המתאים ליחידת נפח לכל באר, בהתאם לטבלה.לאחר מכן, שאבו את הג'לטין מכלי התרבית ופזרו את התאים ללא סיבוב של המכל. הניחו את התרביות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. החליפו את המדיום בכל יום עד יומיים.עם N2 B27 טרי, התאים יתחילו להבדיל את עצמם ולהפגין ביטוי של Sox1 תוך ארבעה עד שישה ימים. כדי לצבוע את התאים לצורך דימוי באימונופלואורסצנציה, הסר את מצע ההבדלה מהתרביות וקבע את התאים ב-500 µl של 4% Paraformaldehyde. לאחר 15 דקות, שטוף וחלחל את התאים פעמיים עם 2 mL של PBS עם tween. לאחר מכן, חסום קשירה לא ספציפית באמצעות אינקובציה של התאים למשך שעה אחת.במיליליטר אחד של PBS tween מועשר בסרום, על נדנדה לצלחות (plate rocker), לאחר שטיפת התאים כפי שהודגם כעת. הוסף 500 microliters של mouse IgG נגד beta three tubulin לתרביות, לדגירה לילה שלם על נדנדת הצלחות בטמפרטורה של 4 °C. למחרת.לאחר שטיפת התאים, דגרו את הדגימות עם נוגדן שני anti-US IgG המסומן פלואורסצנטית בטמפרטורת החדר, בהגנה מאור ובשעקשוק, למשך שעה אחת. שטפו את התאים שוב וצבעו אותם ב-500 microliters של DPI למשך חמש דקות. לבסוף, לאחר שטיפת התאים פעם אחרונה, אחסנו אותם ב-PBS tween למשך עד שבועיים בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius.עד לצילום. בניסוי זה, נעשה שימוש בתאי גזע עובריים של עכבר עם רפורטר GFP אנדוגני של SOX1 כדי לעקוב אחר דיפרנציאציה עצבית. ביום השישי, התאים קובעו ונצבעו עבור הסמן הנוירונלי beta three tubulin.בצפיפות האופטימלית, התאים התבדלו לתאי אב עצביים ולנוירונים, בעוד ששימוש בצפיפות גבוהה יותר הוביל לירידה במספר התאים החיוביים ל-SOX1 GFP ול-beta three tubulin. נפח כלי תרבית התאים משפיע אף הוא על צפיפות הזריעה האופטימלית. לדוגמה, תאים הגדלים בלוחית 96 בארות דורשים צפיפות תאים הגבוהה פי 10 בערך מזו.התאים נזרעו בצלחת תרבית בעלת שישה בארות כדי להגיע לשתי צפיפויות תאים של התמזגות (confluence) אופטימלית. במהלך הגמישה, תאי גזע עובריים משנים בהדרגה את המורפולוגיה שלהם. לדוגמה, בתמונות אלו ניתן להוסיף את המורפולוגיה של התאים והמושבות מהיום הראשון ועד היום השישי לאחר הזריעה בצפיפות תאים אופטימלית.ביום הרביעי, התאים מתחילים להפוך לתאי אב עצביים, כפי שמעיד הופעתו של אות פלואורסצנציה ירוקה מדוח ה-SOX1 GFP. ועד היום השישי, רוב התאים הם SOX1 חיוביים. עם זאת, קיומם של תאים שאינם עצביים הוא צפוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להתחיל את ההבחנה העצבית של תאי גזע עובריים של עכבר בתרבית תאים בשכבה אחת.

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פיתחנו פרוטוקול חדש כדי לשפר את היעילות של של בידול חוץ גופית של עובריים של עכברים לתאי גזע לתוך הנוירונים המוטוריים. בתאי גזע עובריים הבדיל רכשה המנוע נוירונים תכונות כפי שמעיד הביטוי של עצביות ומוטוריות סמנים הנוירונים באמצעות טכניקות immunohistochemical.

בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע

הסרטון מדגים פרוטוקול המשתמש במדיה נטולת סרום כדי ליצור אבות עצביים מתאי גזע עובריים של עכברים. הריכוז הרצוי של תאי גזע עובריים, המרחפים במדיה נטולת סרום, מצופה על כיסויים מצופים ג'לטין. בצפיפות תאים אופטימלית, תאים מייצרים גורמי איתות אוטוקריניים, אשר, יחד עם הגורמים מעוררי התמיינות עצבית במדיה נטולת הסרום, מפעילים את התמיינות תאי גזע עובריים לאבות עצביים.

יצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים בתרביות חד-שכבתיות נטולות סרום

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת תאי אב עצביים (NPCs) במבחנה מתאי גזע עובריים של עכברים (mESCs). mESCs מתורבתים בתרחיף ליצירת גופים עובריים (EBs), אשר מונחים לאחר מכן להתמיין NPCs באמצעות טיפול בחומצה רטינואית בתרבית דבקה.

טכניקה ליצירת תאי אב עצביים מתאי גזע עובריים של עכברים

הסרטון הציג שיטה לתרבית תאים למיון תאי אב עצביים לנוירונים. על ידי דגירה של תאים בתווך עשיר בחומרים מזינים בתוספת גורמי גדילה, תאי האב התבגרו לנוירונים עם אקסונים ודנדריטים מפותחים. חומר מייצב הבטיח את קיום התא והגן מפני נזקי חמצון לאורך כל תהליך ההתמיינות.

התמיינות של תאי אב עצביים לתאי עצב

סרטון זה מדגים טכניקה להתמיינות תאי גזע עובריים לאוכלוסייה מרושתת של נוירונים עם סינפסות מתפקדות. הוא מתאר את השלבים המעורבים בהתמיינות תאי גזע עובריים לנוירונים, השראת היווצרות רשת עצבית והעשרת התרבית עם נוירונים מרושתים.

התמיינות תאי גזע עובריים של עכברים לאוכלוסיית נוירונים מרושתת

סרום מנוצל בתרבויות עובר מכיל מרכיבים לא ידועים שיכול להשפיע על התוצאה של ניסויים במיוחד במחקרים שכלל אינטראקציות איתות. כאן אנו מנוצלים מערכת תרבות מחומצן בסרום ללא ולהראות שעוברי עכברים באמצע ההריון תרבותי ל16-40 שעה להפגין פיתוח מורפולוגיים דומה לעוברים המתפתחים ברחם.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

אנו מתארים שיטה לשימוש בתאי גזע עובריים בעכברים ליצירה שניים או שלושה גופי embryoid ממדים. לאחר מכן נסביר כיצד להשרות התמיינות עצבית של תאי הגוף Embryoid ידי חומצה רטינואית, וכיצד לנתח מצב הבידול שלהם על ידי immunofluorescence סמן תא אב ו immunoblotting.

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

אנו מתארים את ההליך של הבחנה במבחנה של תאי גזע עובריים עכבר לתאים עצביים באמצעות שיטת טיפה תלויה. יתר על כן, אנו מבצעים ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנטיות, RNA-seq, וציטומטריית זרימה.

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

למדו בידול עצבי של תאי גזע עכבריים עובריים בשיטת שכבה בודדת ללא סרום. הפרוטוקול כולל ציפוי ג'לטין, דילול לצפיפות מתאימה ואישור באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

גלה סרטונים נוספים