Overview
Ensemble de montage in situ hybridation (WMISH) est une technique courante utilisée pour visualiser l’emplacement des ARN exprimés chez les embryons. Dans ce processus, des sondes d’ARN synthétiquement produits sont d’abord complémentarité lié, ou « hybride », à la transcription de gènes cibles. Immunohistochemistry ou fluorescence sert ensuite de détecter ces hybrides ARN, révélant les tendances spatiales et temporelles de l’expression génique. Contrairement aux traditionnels in situ hybridation techniques qui nécessitent des sections de tissu mince dont les images devront être rassemblés par le calcul, la technique de l’ensemble de montage permet gène patrons d’expression à s’évaluer à l’embryon entier ou de la structure.
Cette vidéo va introduire les concepts de base du Mont toute coloration et détail procédurales étapes clés, y compris sonde conception et production, fixation de l’embryon et coloration et détection des signaux de poteau-hybridation. Téléspectateurs apprendront alors postulez sur autres biologistes du développement comment WMISH aux études de recherche actuel.
Procedure
Ensemble de montage in situ hybridation est une technique puissante qui permet aux scientifiques de comprendre la base moléculaire du développement embryonnaire. « Ensemble-mount » indique que l’embryon entier sera utilisée, non seulement une tranche de tissu. «In situ» est une expression latine signifiant « en position ». Et enfin, « hybridation » désigne la liaison complémentaire d’une molécule d’ARN produite synthétiquement à une transcription de l’ARNm dans les cellules de l’organisme.
Cette vidéo fera la démonstration de la procédure, les résultats escomptés et certaines applications de cette technique qui peut permettre de mieux comprendre les troubles du développement.
Les gènes qui sous-tendent la morphogenèse de l’organisme sont exprimés en modèles limités dans le temps et dans l’espace au cours du développement embryonnaire.
Des sondes d’ARN produits synthétiquement, appelés cavitation, sont utilisés pour détecter les ARNm en se liant complémentaire. Cavitation est étiquetées avec des nucléotides spéciales contenant « haptènes, » comme le dinitrophénol, biotine ou dioxygénine. Haptènes sont des molécules qui peuvent déclencher une réponse immunitaire lorsqu’il est attaché aux molécules plus grosses et sont donc des cibles pour la liaison de l’anticorps. Ces anticorps de détection sont conjugués aux enzymes, comme la peroxydase de raifort ou de la phosphatase alcaline, qui catalysent des réactions chimiques où un colorant fluorescent ou coloré peut être déposé.
Techniques d’hybridation traditionnels in situ nécessitent la préparation des coupes de tissus de l’embryon afin de faciliter la détection des structures internes. En conséquence, une évaluation complète de l’expression des gènes dans l’ensemble de l’organisme devra être reconstruite à partir des 5-6 μm tranches avec l’aide de logiciels. Cependant, avec le développement des techniques de l’ensemble de montage, analyse de l’expression génique sur des distances plus grandes au sein de l’embryon entier peut être obtenue.
Après avoir examiné les principes qui sous-tendent l’ensemble de montage in situ hybridation, Let ' s go à travers le protocole expérimental étape par étape.
La première étape de cette procédure implique l’identification de la séquence cible dans l’organisme modèle pour être l’objet d’une enquête. L’objectif de la séquence d’ADN est ensuite amplifié par PCR avec des amorces contenant des séquences d’initiation de l’ARN polymérase. La matrice d’ADN amplifiée est maintenant transcrit in vitro avec des nucléotides marqués haptène. Cette ribosonde marqués au haptène est maintenant prêt pour l’étape d’hybridation.
Les embryons sont préparés pour l’hybridation par l’intermédiaire de fixation avec du formaldéhyde, un réactif de réticulation qui stabilise les protéines et protège contre les ribonucléases. Après fixation, le formaldéhyde est éliminé par l’embryon à laver plusieurs fois avec une solution saline tamponnée au phosphate, contenant une petite quantité de détergent, telles que l’interpolation. Pour supprimer les lipides cellulaires et faciliter la pénétration de la sonde dans les tissus, les embryons sont déshydratées dans une série graduée de méthanol lavages, par exemple : 25 %, 50 %, 75 %, 100 % de méthanol. Les embryons peuvent être conservés dans le méthanol à 100 % pour un mois (ou plus) à-20 ° C.
Pour préparer les embryons pour l’hybridation, ils doivent être réhydratés par une série graduée de méthanol lavages avec progressivement moins méthanol / cycle de lavage. Les embryons sont ensuite digérés avec une protéase pour faciliter la diffusion de ribosonde dans les tissus. Le ribosonde marqué est ajouté à l’embryon et l’hybridation est effectuée.
Lavages de poteau-hybridations sont effectuées pour enlever les hybridations non spécifiques. RNases A un T1 sont ajoutés pour enlever partiellement hybridées des sondes de digérer les ARN simple brin. Les sondes hybrides sont détectés avec un conjugué d’anticorps-enzyme qui lie la cavitation haptène-étiqueté. Tel que mentionné précédemment, les enzymes comme la phosphatase alcaline sont conjugués d’anticorps spécifiques haptène et sont détectés par l’ajout de substrats enzymatiques pour susciter un changement de couleur. Le produit de réaction forme un précipité violet foncé marquer l’endroit de l’ARNm exprimée, comme on le voit dans cet exemple.
Maintenant que vous savez comment ensemble monture hybridation in situ , regardons certaines applications de la technique.
Ensemble de montage in situ hybridation a été utilisée pour aider les scientifiques à lutter contre des maladies mortelles transmises par les moustiques, telles que le paludisme, la dengue et la maladie du Nil occidental. En caractérisant les gènes impliqués dans le développement et la reproduction des moustiques, les nouveaux insecticides biologiques ou chimiques peuvent être conçus pour mieux moustiques cible les porteurs de maladies.
Une autre application de cette technique implique la caractérisation du gène expression changements liés à l’exposition aux substances tératogènes ou d’agents qui interfèrent avec le développement du foetus.
Ici, entier-montent en situ hybridation a été utilisée dans un modèle de poisson-zèbre de fœtopathie alcoolique pour identifier les gènes dont les patrons d’expression sont modifiées après exposition à l’alcool. Cela peut aider dans le développement de thérapies pour atténuer les conséquences de l’exposition in utero à l’alcool.
Entier-Montez en situ hybridation permet également de valider les changements phénotypiques associés à des maladies congénitales. Mutations associées avec le syndrome de Bardet-Biedl ont été introduites dans des embryons de poisson-zèbre via synthétiquement produit mutant ARNm. Après une période de temps définie, les embryons ont été divisés en groupes selon la gravité des défauts. Visualisation de l’expression des gènes en aval du gène muté a été utilisé pour valider les changements phénotypiques. Ainsi, ensemble-mount in situ hybridation en combinaison avec pointage phénotypique peut faciliter une meilleure compréhension du rôle des mutations spécifiques qui sous-tendent les anomalies du développement.
Vous avez juste regardé video entier-montent en situ hybridation de JoVE. Cette technique est un outil puissant qui permet la caractérisation spatiale et temporelle précise de l’expression des gènes dans un organisme. Entier-montent en situ hybridation est actuellement utilisée pour générer un atlas des profils d’expression génique au cours du développement dans une multitude d’organismes modèles. Ces études peuvent faciliter le développement de nouvelles thérapies pour traiter des maladies humaines, y compris le cancer. Merci de regarder !
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