Name: הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: למד הדמיית אברונים תת-תאיים בדג הזברה החי. שיטה זו מאפשרת מחקר דינמיקת מיטוכונדריה וצנטרוזומים in vivo ללא ניתוח, עם יישומים במחלות כמו אלצהיימר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PE נתמך על ידי קבוצת ההכשרה למחקר 1373 של Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) ובית הספר לתארים מתקדמים של האוניברסיטה הטכנית של מינכן (TUM-GS). G.P. נתמך על ידי TUM-GS. L.T. נתמך על ידי מלגת EMBO (EMBO ALTF 108-2013). עבודתו של ד.פ. על דג הזברה נתמכה על ידי ה-DFG באמצעות Sonderforschungsbereich "מנגנונים מולקולריים של ניוון עצבי" (SFB 596); המרכז למדעי החלבון המשולבים (מינכן) ותוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013) תחת הסכם מענק מס' 200611 (MEMOSAD). כיום הוא עמית דרוקנמילר של קרן תאי הגזע של ניו יורק ונתמך על ידי מלגה מהאקדמיה הגרמנית למדעים לאופולדינה. LG נתמך על ידי מימון מ-DFG באמצעות SFB 870 "הרכבה ותפקוד של מעגלים עצביים", פרויקט A11. 
אנו אסירי תודה לקריסטינה וולימן על תחזוקת מתקן הדגים שלנו, לאיבון הופנגל על התמיכה הטכנית ולתומאס מיסגלד על ההערות על כתב היד. אנו אסירי תודה ל-R. Köster (Technische Universität Braunschweig) על שסיפק את וקטור M1 Medusa (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) שממנו שיבטנו את Centrin-YFP ו-S.C. Suzuki ו-T. Yoshimatsu (אוניברסיטת וושינגטון) על שסיפקו את קלטת 14xUAS:MA-cerulean בה השתמשנו כדי ליצור את מבנה המדווח ליצירת CentrinFish. אנו מודים גם ל-S.C. Suzuki ו-T. Yoshimatsu (אוניברסיטת וושינגטון) על הקו הטרנסגני Otx2:Gal4, ל-A. Sagasti על המבנה Sensory:Gal4-VP16 (UCLA) ול-M. Nonet (אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס) על וקטור pCold Heart Tol2. אנו מודים לבטינה שמיד, אלכסנדר הרושה וכריסטיאן האס (המרכז הגרמני למחלות נוירודגנרטיביות במינכן - DZNE) על תרומתם לפיתוח MitoFish.

למחברים אין מה לחשוף.

הנה, אנחנו מדגימים את הרבגוניות של מערכת ביטוי Gal4-כטב&quot;מ למיטוכונדריה תג פלורסנטי, centrosomes ואת קרום התא של תא-סוגים ספציפיים in vivo עוברי דג הזברה. חלבונים היתוך ניאון רבים כי תווית אברונים אחרים או מבנים subcellular ניתן למצוא בספרות שפורסמו ניתן להשיג מהמעבדה בהתאמה, ממקורות מסחריים או משמורת פלסמיד לא מסחרי (למשל, Addgene). כדי לעצב חלבון היתוך ניאון חדש, מספר פרמטרים צריכים להילקח בחשבון, כולל אשר FP להשתמש והאם למזג את FP בתחנה הסופית אמינו או car...

בשנת vivo הדמיה מספק ראיה ישירה של התנהגויות הסלולר בהקשר הפיזיולוגי ביותר. השקיפות של עוברי דג זברה, ההתפתחות המהירה והחיצונית שלהם מגוון עשיר של כלים גנטיים המאפשרים תיוג פלורסנט תרמה כולם בשימוש הגובר של מיקרוסקופיה in vivo על מנת להבהיר את הדינמיקה של אירועים התפתחותי חשובים. בדיקות הדמיה של התפתחות מערכת עצבים של דג זברה יש למשל הרחיבו את הידע שלנו מאוד של ההתנהגות של ובתאים עצביים ועל גורל הצאצאים שלהם כוללים שילוב ההגירה, בידול המעגל הבא שלהם 1-8. השלב מוגדר כעת לחקור את הדינמיקה subcellular שבבסיס התנהגויות הסלולר אלה. ואכן, דג זברה כבר מנוצל ככלי ביולוגיה של תא vivo. עכשיו זה אפשרי לדמיין המיטוכונדריה 9-11, centrosomes 2,8,12-14, Golgi 15, שלד התא microtubule 4 ו אקטין 16, endosomes 17 ורכיבים של קרום הפסגה מורכבים 1,18, בין מבנים subcellular אחרים עוברי דג הזברה in vivo. עד כה, הרבה ממה שידוע על הפונקציה של אברונים אלה מגיעים מלימוד התנהגותם בתאים בתרבית. בעוד מחקרים במבחנה ב הניבו תובנה אדירה לתוך ביולוגיה של התא, התאים בתרבית לא מייצגים במלואם את המורכבות של המצב vivo ולכן לא בהכרח משקפים את תפקוד ודינמיקה של אברונים subcellular in vivo. עוברי דג הזברה מציעים קיימא בחלופה vivo לבחינת הדינמיקה subcellular. כפי חוליות, דג זברה להחזיק מערכות איברים רבות (למשל, רשתית עצבית) כי הם הומולוגיים לאלה שנמצאו מיני יונקים. בנוסף, עוברי דג הזברה משמשים יותר ויותר למודל מחלות אנושיות 19,20 </sעד&gt;, כולל אלה הקשורים בתפקוד centrosomal (למשל, מיקרוצפליה 21 amaurosis מולדים לבר 22) ו לתפקוד המיטוכונדריה (למשל, מחלת פרקינסון 23, tauopathies 10,24 ובארט תסמונת 25). הדמיה בשנת vivo ברמה התאית ו subcellular במקרים אלה יאפשר הבנה טובה יותר של ביולוגיה של התא הבסיסי מצבים פתולוגיים אלה. המטרה הכללית של השיטות שתוארו כאן היא לספק מדריך מקיף לחקור אברונים מבנים subcellular אחרים עוברי דג הזברה באמצעות במיקרוסקופ אור vivo. עבודת הזרימה כולו מעורבת הדמית מעקב מבני subcellular in vivo מתוארת - מגישות תיוג גנטיות, ליצירה להביע זמנים ודגים מהונדסים יציבים, ולבסוף הדמיה באמצעות שדה רחב מיקרוסקופיה confocal. בעוד כל אחד proc אלהedures משמש מעבדות דג זברה רבות, בפרוטוקולים מתוארים ממוטבות יעילות לחקירת הדינמיקה של מבני subcellular. שני היבטים ספציפיים של העבודה המתוארת כאן מתחייבים להזכיר: ראשית, השימוש במערכת ביטוי Gal4-כטב&quot;מ בתצורות מרובות אברונים תווית גנטי-סוגי תאים מסוימים. שנית, השוואה ישירה של שדה רחב מיקרוסקופיה confocal למבני subcellular תמונת in vivo. אסטרטגיות שוטפות אברונים תווית גנטית ומבני subcellular אחרים דג זברה או לעשות שימוש 1,4,8 mRNA כתרים או בונה מבוסס DNA שבו אלמנטי אמרגן ישירות לנהוג הביטוי של חלבוני היתוך 9,14,15. במבחנת תוצאות RNA כתרים הועתקו מהירה ביטוי רחב, שאינו רקמות ספציפיות זאת. בנוסף, רמות הביטוי להפחית לאורך זמן כמו RNA כתרים הוא מדולל או מושפל. לכן השימוש RNA מבוססבונה לבחון הדינמיקה אברון בשלבים מאוחרים יותר בהתפתחות מוגבלת (בדרך כלל עד 3 ימים לאחר ההפריה). ניתן להתגבר על מגבלות אלה באמצעות בונת DNA, שבו שליטה במרחב ובזמן של ביטוי נקבעה על ידי גורמי אמרגן ספציפיים. כאשר בונה מבוססת DNA משמשת בהקשר של השיפורים המשמעותיים במערכת Gal4-כטב&quot;מ לרמות ביטוי transgene הם נצפו 26,27. במערכת ביטוי bipartite זה, אלמנטים האמרגן תא ספציפי מסוג לנהוג הביטוי של Gal4 activator תעתיק, בעוד גנים הכתב הם משובטים במורד הזרם של רצף הפעלת Gal4 מחייב במעלה הזרם (כטב&quot;מ). על ידי שילוב של כתבים כטב&quot;מ עם נהגי Gal4 מתאימים, ביטוי יכול להיות מוגבל-סוגי תאים מסוימים, לעקוף את הצורך לשבט גני כתב מאחורי יזמים שונים בכל פעם דפוס ביטוי מבוקש הוא רצויה. יתר על כן, הביטוי של גני כתב מספר כטב&quot;מ יכול להיותמונע על ידי מפעיל Gal4 יחיד. מערכת Gal4-כטב&quot;מ ובכך מספקת גישה גנטית צדדית וגמישים תיוג subcellular. שדה רחב ומיקרוסקופים confocal הם סוסי העבודה של ברוב המעבדות. מערכות-שדה רחב משתמשות בדרך כלל מנורת קשת כמקור אור לזהות את האור הנפלט עם מצלמה רגישה כי הוא מוצב בסוף נתיב האור. שיטת הדמיה זו מוגבלת בדרך כלל כדי דגימות רזה כמו out-of אור המוקד מטשטש מידע הפוקוס בדגימות עבות. מיקרוסקופים confocal שונים ממערכות רחב בתחום בכך שהם בנויים להעדיף אותות שמקורן במישור המוקד על פני אלה שמקורן מחוץ לפוקוס (כלומר, &quot;חתך אופטי&quot;) 28. כדי להשיג חתך אופטי חריר מושם בנתיב פליטה בעמדה המצומד אל מקור האור לנקודה. לייזרים משמשים כמקורות אור אותות מזוהים עם צינורות מכפילים (PMTs). מבחינה מעשית, לייזרקרן הוא סחב על המדגם, נקודה אחר נקודה ואת פליטת הקרינה בכל נקודה (פיקסל) הוא זוהה על ידי PMT. כאן אנו תמונה זהה מאוד מבנים subcellular לחיות עוברי דג הזברה הן באמצעות שדה רחב מיקרוסקופיה confocal לספק השוואה ישירה של שתי שיטות מיקרוסקופיה. המטרה הבסיסית של מתן השוואות כאלה היא להציע הנחיות לבחירת טכניקת מיקרוסקופיה המתאימה ביותר עבור השאלה ספציפית בהישג היד. באמצעות הגישות המתוארות כאן אנחנו מדגימים תיוג גנטי המבוסס Gal4-כטב&quot;מ של מיטוכונדריה centrosomes. אברונים אלה הם צילמו ב-תאים מסוגים שונים של מערכת העצבים בתאי השריר באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב ו confocal כדי להדגים את התאמתו של כל שיטת הדמיה. השיטות שתוארו כאן ניתן להתאים בקלות על חקירת אברונים אחרים ומבני subcellular בעובר דג הזברה לחיות.

<table><tbody><tr><td>אגרוז (2-הידרוקסיאתילאגרוז)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018-10G</td><td>טמפרטורת ג'ל נמוכה סוג VII</td></tr><tr><td>מחמם בלוק</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermomixer קומפקטי</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2 סידן חנקתי הידרט, 99.996%&nbsp;</td><td>אולדריץ'</td><td>202967-50 גרם</td><td>להכנת מצלמת CCD 30x של דניאו</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Qimaging Retiga Exi Fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>דומונט מצופה קרמיקה #5 מלקחיים</td><td>דומונט - כלי מדע עדינים</td><td>11252-50</td><td>#5 מלקחיים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td>FV1000 Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>מחמם כלים</td> תרבות <td>וורנר אינסטרומנט קורפוריישן</td><td>DH-35</td><td>טבעת חימום</td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפט</td><td>PharmaQ</td><td>טריקאין PharmaQ-25g</td><td>טריקאין (הרדמה)</td></tr> <tr><td>מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>ערכת GeneClean MP</td><td>ביו-רפואי</td><td>111001200</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבות תחתון זכוכית</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td>צלחת פטרי 35 מ"מ, מיקרווול 14 מ"מ, זכוכית כיסוי מס' 0</td></tr><tr><td>מחטי זכוכית</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>למיקרו-הזרקות</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250g</td> להכנת גריז ואקום <td>גבוה 30x של Danieau</td></tr><tr><td></td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>DCC000001242 150 גרם</td><td>גריז סיליקון דו חמצני</td></tr><tr><td>KCl 99%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7643-5 ק"ג</td><td>להכנת 30x</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O &nbsp; &nbsp; מגנזיום גופרתי הפטהידראט 98+% מגיב ACS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>230291-500 גרם</td><td>להכנת 30x</td></tr><tr><td>Microinjector&nbsp;</td><td>טיפים</td> למיקרו-מטען Eppendorf <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>0.5-20 ul</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Maerzhaeuser Wetzlar</td><td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מיקרופיפטה</td><td>Intracel</td><td>P/N 50-00XX-130-1</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 ערכת תמלול</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>לתמלול PCS-Transposase</td></tr><tr><td>NaCl BioXtra >99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1kg</td> להכנת ננופוטומטר <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 30x של Danieau <td>למדידת ריכוז DNA/RNA</td></tr><tr><td>מושך מחט</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Flaming/Brown</td></tr><tr><td>NIR Apo 40x/0.80W&nbsp;</td><td>ניקון</td><td></td><td>טבילה במים-חרוט אובייקטיבי</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea דרגה I, כ. 98%</td> <td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>PTU (מונע פיגמנטציה)</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>821472</td><td>92 x 16 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>תבניות פלסטיק&nbsp;</td><td>כלי מדע אדפטיביים</td><td>TU-1</td><td>למיקרו-הזרקות</td></tr><tr><td>כיסוי פרספקס עם חור</td><td>בהתאמה</td><td></td> אישית <td>החור בכיסוי הפרספקס צריך להיות גדול ב-3 מ"מ מקוטר מטרת חרוט הטבילה במים</td></tr><tr><td>מסננת תה (פלסטיק)</td><td></td><td></td> <td>לאיסוף ביצי דג זברה</td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td>טמפרטורה אוטומטית כפולה </td></tr><tr><td>בקר העברת פיפטות</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>86.1171</td><td>פיפטות העברת פלסטיק 3.5 מ"ל</td></tr><tr><td>UMPlanFI 100x/1.00W</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>מטרת חרוט טבילה במים</td></tr><tr><td>UMPlanFLN 20x/0.50W&nbsp;</td><td>מטרת חרוט טבילה במים</td> <td>אולימפוס</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שדה רחב</td><td>אולימפוס</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>PTU (מלאי 50x)</td><td></td><td></td> <td>ממיסים 76 מ"ג PTU ב-50 מ"ל מים מזוקקים מערבבים במרץ בטמפרטורת החדר&nbsp; יש לאחסן בטמפרטורה של -20 oC ב-1 מ"ל מינקוטים יש להשתמש בתמיסת עבודה אחת</td></tr><tr><td>טריקאין (20x ציר)יש</td><td></td><td></td> <td>להמיס 200 מ"ג טריקאין ב-48 מ"ל מים מזוקקים להוסיף 2 מ"ל 1M Tris base (pH9) להתאים ל-pH 7&nbsp; יש לאחסן ב-20 oC ב-1 מ"ל השתמש ב-1x פתרון עבודה</td></tr><tr><td>הפתרון של דניאו (30x מלאי)</td><td></td><td></td><td>1,740 mM&nbsp; NaCl&nbsp; 21 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; KCl&nbsp; 12 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MgSO4.7H2O&nbsp; 18 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Ca (NO3)2 150 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; מאגר HEPES&nbsp; מים מזוקקים עד 1 ליטר&nbsp; חנות ב-4 oC&nbsp; שימוש בפתרון עבודה של 0.3x</td></tr></tbody></table>

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

הדמיה in vivo מספקת גישה חסרת תקדים להתנהגות הדינמית של מבנים תאיים ותת-תאיים בהקשר הטבעי שלהם. ביצוע ניסויי הדמיה כאלה בבעלי חוליות גבוהים יותר כמו יונקים דורש בדרך כלל גישה כירורגית למערכת הנחקרת. הנגישות האופטית של דג הזברה העוברי והזחל מאפשרת לעקוף הליכים פולשניים כאלה ומאפשרת הדמיה באורגניזם השלם. ואכן, דג הזברה הוא כיום מודל מבוסס היטב להמחשת התנהגויות תאיות דינמיות באמצעות מיקרוסקופיה in vivo במגוון רחב של הקשרים התפתחותיים, החל מהתפשטות ועד נדידה והתמיינות. התפתחות עדכנית יותר היא השימוש הגובר בדג הזברה לחקר אירועים תת-תאיים, כולל סחר במיטוכונדריה ודינמיקה של צנטרוזומים. הקלות היחסית שבה ניתן לתייג גנטית את המבנים התת-תאיים הללו על ידי חלבונים פלואורסצנטיים והשימוש בטכניקות מיקרוסקופ אור כדי לדמות אותם הופכת את דג הזברה למודל in vivo של ביולוגיה של התא. כאן אנו מתארים שיטות ליצירת מבנים גנטיים המסמנים אברונים באופן פלואורסצנטי, תוך הדגשת מיטוכונדריה וצנטרוזומים כדוגמאות ספציפיות. אנו משתמשים במערכת Gal4-UAS הדו-חלקית במספר תצורות כדי להגביל את הביטוי לסוגי תאים ספציפיים ולספק פרוטוקולים ליצירת דגים טרנסגניים בעלי ביטוי חולף ויציבים. לבסוף, אנו מספקים הנחיות לבחירת שיטות מיקרוסקופ אור המתאימות ביותר להדמיית דינמיקה תת-תאית.

כאן השימוש רחב בתחום מיקרוסקופיה confocal למיטוכונדריה תמונה centrosomes לחיות עוברי דג הזברה מושווה באופן ישיר בניגוד. בהתאם למיקום של התאים בהם הדינמיקה אברון ייבחנו ואת תדירות הטבועה של אירועים subcellular ספציפיים, בדרך כלל גם רחב בתחום או confocal הוא בחירה טובה יותר. אנחנו צלמנו אברונים בנוירונים RB ממוקמים על פני השטח של העובר בתאי רשתית הממוקם עמוק. המיקום שטחית של נוירונים RB יחד עם גיאומטריה דו-ממדי שלהם להפוך אותם מועמדים טובים להיות הדמ...

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

המטרה הכוללת של שיטת הדמיה זו היא לחקור אבנים תת-תאיות בבעל חוליות in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי עצב, כגון דינמיקה של מיטוכונדריה או סנטרוזומים בהקשר של in-vivo. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את הניסוי כולו בבעל חוליות שלם, ללא צורך בכל הליך כירורגי.שיטה זו יכולה לספק תובנות לא רק לגבי דינמיקה תת-תאית בתנאים פיזיולוגיים, אלא היא יכולה להיות מיושמת גם במחקרים של מודלי מחלה, כגון מחלת אלצהיימר. לאחר יצירת עוברים המבטאים את הגן באופן זמני באמצעות מיקרו-הזרקה, או השגת עוברים מקווי טרנסגניים יציבים, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בסוף היום הראשון, יש לסנן ביצי מתים או לא מופרים. באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק, העבירו את העוברים החיוניים לתמיסת Danieau המכילה 1x PTU למניעת היווצרות פיגמנט, והחזיקו את העוברים בתמיסת Danieau המכילה 1x PTU עד לבדיקת ביטוי הטרנסגן.ביום של ניסוי הדימות, השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי כדי לסרוק עוברים שהורדמו לצורך ביטוי של הגן החולף (transgene). לאחר מכן, העבירו את העוברים שנבחרו לפטרי דש נפרדת המכילה באפר דניאו (Danieau's buffer) עם 1x PTU ו-1x tricaine. לאחר הרדמת העוברים, העבירו בעדינות בעזרת פיפט מספר עוברים לתוך אגרוז בנקודת התכה נמוכה המכיל 1x PTU ו-1x tricaine, תוך העברה של כמות מינימלית של נוזל כדי למנוע דילול של האגרוז.העבירו את העוברים עם כמות קטנה של אגרוז למנת Petri בעלת תחתית זכוכית. לאחר מכן, בעבודה מהירה יחסית, השתמשו בפינצטה כדי למקם את העוברים באוריינטציה הרצויה, בהתאם למבנה שיידגם. יש לוודא שהעוברים מונחים באוריינטציה נכונה; למשל, שכיבה שטוחה על הצד לצורך דימוי של הרשתית או של נוירון Rohon-Beard.סידור מדויק יבטיח את איכות הדימות הטובה ביותר ויבצע אופטימיזציה של מהירות הרכישה. לאחר המתנה של לפחות 15 דקות להתגבשות האגרוז, יש להוסיף באפר דניו (Danieau's buffer) עם 1x PTU ו-1x tricaine כדי לכסות את העוברים. לצורך ביצוע מיקרוסקופיה בשדה רחב (wide-field microscopy), לאחר הרגלת צלחת של דגים מקובעים בתא חימום בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsuis, על הבמה של מיקרוסקופ בשדה רחב, ובחירת אזור עניין, יש לפתוח את תוכנת המיקרוסקופ.תחת תפריט תאורה (Illumination), לחצו על הגדרות תצורה (Configuration settings) כדי להגדיר את סטים של המסננים המתאימים לאורך הגל הרצוי. תחת הגדרות מצלמה (Camera settings), הזינו את זמן החשיפה הדרוש לרכישת תמונה מתאימה. לאחר מכן, בחרו בעדשה אובייקטיבית מסוג water dipping cone בעלת מרחק עבודה ארוך, עם הגדלה הנעה בין 40x ל-100x, בעלת הממספר האפראטורי (numerical aperture) הגבוה ביותר ותיקון כרומטי.לחצו על Live כדי לבחור את שדה הראייה. במקרה של נוירון R-B, דגמו תמונות של הובלת מיטוכונדריה באקסון הגזע, היוצא מגוף התא או בענפי הקצה (peripheral arbor). לאחר מכן, בתפריט ImageJ, לחצו על כפתור הברירה המלבנית והגדירו אזור עניין, או ROI.לחצו על ROI בחלון ה-micromanager. לאחר בחירת ה-ROI לצילום, לחצו על Stop and Save כדי להקליט את המורפולוגיה הנוירונלית בערוץ ה-YFP. כדי לצלם את התובלה המיטוכונדריאלית, לחצו על Multi-D Acquisition.לאחר מכן, בחלון שנקרא Multi-dimensional Acquisition, בחרו את מספר נקודות הזמן ואת המרווח בין נקודות הזמן. בחלון ה-Multi-dimensional Acquisition, לחצו על Channels, והוסיפו והגדירו את אורך הגל עבור הדימות ואת זמן החשיפה. לחצו על Save images כדי לשמור באופן אוטומטי את הקבצים בתיקייה הספציפית המוגדרת בנתיב הספריה.כעת, לחצו על Acquire בפינה הימנית העליונה כדי להתחיל בצילום time lapse. עבור מיקרוסקופיה קונפוקאלית, לאחר הנחת העוברים המורכבים בתא חימום בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius על במת המיקרוסקופ הקונפוקאלי, פתחו את תוכנת המיקרוסקופ ולחצו על Trans Lamp או Epi Lamp. לאחר מכן, באמצעות העיניות של המיקרוסקופ, השתמשו באור תמסורת או באור פלואורסצנציה, בהתאמה, כדי לזהות את האזור הרלוונטי למחקר.בחלון הגדרות הרכישה (Acquisition), ודאו שהעדשה שנבחרה לדימוי תואמת לעדשה המופיעה בתפריט הנפתח של העדשות הזמינות. לאחר מכן, בחלון בקרת רכישת התמונה (Image Acquisition Control), לחצו על כפתור רשימת הצבעים ובחרו את הפלואורופורים המתאימים. לחלופין, ניתן ללחוץ על כפתור נתיב האור וצבעים (Light Path and Dyes) כדי להגדיר את הפרמטרים באופן ידני.בחלון הגדרות הרכישה (Acquisition Setting), התאימו את מקדם הזום ויחס הגודל של התמונה הסרוקה כדי להשיג את גודל הפיקסל הדרוש לרזולוציה מיטבית של המבנים המצולמים. הגדירו את גודל הפיקסל להיות כחצי מהרזולוציה התאורטית של העדשה, ובכך עמדו בקריטריוני הדגימה של ניקוויסט (Nyquist). כדי לקבוע את גודל הפיקסל של תמונה שנרכשה, לחצו על כפתור ה-I בחלון בקרת רכישת התמונה (Image Acquisition Control).בשלב הבא, הגדירו את מהירות הסריקה למהירה ביותר האפשרית. לאחר מכן, בחלון בקרת רכישת התמונה (Image Acquisition Control), לחצו על Kalman line averaging והגדירו מקדם של שתיים או שלוש כדי להפחית רעשים. כדי לבחור במצב סריקה רצפי עבור דימוי של פלואורופורים בעלי ספקטרומים חופפים, לחצו על Sequential ו-Line.לאחר מכן, כווננו את הספק הפלט של קווי הלייזר הרלוונטיים. כדי לסרוק ברצף את האזור הנבחר תוך כדי כיוון הגדרות הגלאי עבור כל ערוץ, לחצו על XY Repeat או על Focus x2 או Focus x4. לאחר מכן, כווננו את ה-HV, ה-Gain וה-Offset עבור כל ערוץ כדי לרכוש תמונות בעלות הטווח הדינמי הגבוה ביותר של ערכי אפור.כעת, לחצו על Control פלוס H כדי להציג את התמונות שנרכשו באמצעות טבלת ערכים (lookup table) המזהה פיקסלים עם רוויה נמוכה (undersaturated) בכחול, ופיקסלים עם רוויית יתר (oversaturated) באדום, כאשר יש להימנע משני המצבים. העריצו מחדש את הספק המוצא של קווי הלייזר הרלוונטיים ואת הגדרות הגלאי. כדי להגדיר את הגבול העליון והתחתון של הנפח שיצולם, לחצו ב-Acquisition Setting על כפתור End Set בגבול העליון, ולאחר מכן התמקדו בגבול התחתון ולחצו על Start Set.כדי לבדוק את רזולוציית ה-Z של העדשה, בלוח הבקרה לרכישת תמונות (Image Acquisition Control), לחצו על סמל ה-I. לאחר מכן, בחרו גודל צעד השווה למחצית מרזולוציית ה-Z עבור העדשה הנתונה. בחלון המשני של TimeScan, הזינו את התדירות שבה יש לרכוש את ה-Z-stacks, ואת מספר הפעמים שבהן יש לרכוש את התמונות, כדי להגדיר סדרת זמן המתאימה לדינמיקה של המבנה התת-תאי המיועד לדימוי.לחצו על כפתורי ה-Depth וה-Time כדי לוודא שסדרת ה-Z-stack וסדרת הזמן יירכשו. לבסוף, לחצו על כפתור ה-XY Zt כדי להתחיל ברכישת תמונות ה-time lapse. לאחר רכישת התמונות, לחצו בממשק התוכנה על Series Done.שמרו את התמונות בפורמט OIB כדי לתעד את התמונות ואת המטא-דאטה הנלווה. איור זה מציג אבנים ונוירוני R-B הממוקמים על פני השטח של העובר באמצעות מיקרוסקופיה בשדה רחב ובמיקרוסקופיה קונפוקלית. כאן, נעשה שימוש בדימוי רצף זמנים (time lapse) במיקרוסקופ בשדה רחב כדי לעקוב אחר התנועה של מיטוכונדריון בודד בענפית ההיקפית של נוירון R-B.דימוי קונפוקאלי הוא איטי משמעותית ועלול להוביל להערכה חסרה של הדינמיקה של אירועים תת-תאיים ספציפיים. תמונות של תאי רשתית שהושגו באמצעות מיקרוסקופיית שדה רחב (wide-field microscopy) סובלות מניגודיות נמוכה, שכן אותות פלואורסצנציה מנפח רקמה גדול מטשטשים את הפרטים במישור המוקד. כאן, יכולת החיתוך האופטי של מיקרוסקופיה קונפוקאלית משפרת באופן ניכר את הניגודיות.התמונות המוגדלות מציגות פרטים של אזור בשכבה הגרעינית הפנימית, עם סימון של ממברנות תאיות ומיטוכונדריה. באמצעות דרייבר Gau-4 ספציפי של נוירון חושי, הביטוי הפסיפסי הנובע מהזרקות של UAS-mito-CFP ו-UAS MAY-FP מאפשר מעקב אחר תאים בודדים לאורך מספר ימים, כפי שניתן לראות בנוירון חושי R-B זה יומיים ושלושה ימים לאחר ההפריה. בנוסף למיטוכונדריה, ניתן לסמן באופן פלואורסצנטי אבנינים תת-תאיים אחרים, כגון סנטרוזומים.בדוגמה זו, שתי קסטות UAS במבנה רצוף אחד הניעו ביטוי של YFP המכוון לסנטרוזום, ושל cerulean המכוון לממברנה בתאי רשתית. התמונות המוקטנות מראות תא בשלב M. פרוצדורה שלמה זו דורשת מספר ימים החל מההכלאה, איסוף ביצים, הזרקות, ולבסוף דימות שלושה או ארבעה ימים לאחר ההפריה.ניסוי הדימוג בפועל במיקרוסקופ עשוי להימשך מספר דקות ועד יום שלם. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לסמן ולדגום אברונים אחרים, כגון מיקרוטובוליים או פרוקסיסומים, כדי להבין את הדינמיקה שלהם in-vivo. זכרו כי PTU הוא חומר מסרטן ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון הרכבת כפפות, בעת ביצוע הליך זה.

imaging-subcellular-structures-in-the-living-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

מתוארת אסטרטגיית הכנת דגימה להדמיית עוברים מוקדמים של דגי זברה בתוך כוריון שלם באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור. הוא מנתח את הכיוונים השונים שהעוברים רוכשים בתוך הכוריון בשלבי 70% אפיבולי וניצן ומפרט אסטרטגיות הדמיה להשגת רזולוציה בקנה מידה תאי בכל העובר באמצעות מערכת יריעות האור.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

למד הדמיית אברונים תת-תאיים בדג הזברה החי. שיטה זו מאפשרת מחקר דינמיקת מיטוכונדריה וצנטרוזומים in vivo ללא ניתוח, עם יישומים במחלות כמו אלצהיימר.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

גלה סרטונים נוספים