Name: 플로우를 통해 마이크로 반응기와 MS 검출을위한 단백질의 빠른 효소 처리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 학습하세요 플로우스루 트립신 마이크로반응기를 이용한 단백질의 신속한 효소 소화 및 질량분석기를 통한 단백질 식별 방법을. 이 기법은 빠르고 비용 효율적이며 고분자량 분석에 적합합니다.

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모세관 마이크로 반응기 1. 준비 <ol><li> 100 μm의 내경 (ID)이 360 ㎛의 외경 (OD) 7-8cm 길이로 모세관 유리 모세관 칼 3-5 센티미터 20 μm의 ID X 0.09의 OD 모세관 X 컷; 어떤 돌출 버없이, 모두 모세관 끝이 깨끗하고 스트레이트 컷을 현미경으로 확인합니다. </li><li> ~ 6mm의 길이, 100 μm의 ID X 360 μm의 외경 모세관의 한쪽 끝으로 20 μm의 ID X 90 μm의 외경 모세관을 삽입; 필요한 경우에, 현미경이 동작을 관찰한다. </li><li> 면봉의 끝이 90 μm의 OD / 100 μm의 아이디 모세 혈관의 교차점 주위에 접착제 E6000의 작은 방울을 적용하고 RT에서 접착제 경화 O / N을 할 수 있습니다. </li><li> ~ 10-15mm의 길이에 삽입 된 20 μm의 ID X 90 μm의 외경 모세관을 잘라; 이것은 전기 분무 이온화 방출 될 것입니다. </li><li> 미리 잘라 1/32 &quot;OD의 PEEK, 1/16&quot;OD의 PEEK 및 1/16 &quot;OD의 PTFE 욕조길이 4-5cm의 조각 보내고; 이러한 누출이없는 연결을 제공하기 위해 모세관 조합에 사용되는 소매 될 것입니다. </li><li> 까꿍 조합에 100 μm의 ID X 360 μm의 외경 모세관의 반대쪽 끝을 연결합니다; 누출이없는 연결을 제공하기위한 1/32 &quot;PEEK 슬리브를 사용합니다. </li><li> 삽입 / 노조의 반대쪽에 5cm 길이 1/16 &quot;PTFE 튜브 ~의 조각을 조입니다. </li><li> 사전 세척 / 2 ㎖의 유리 병을 건조에 C18 (5 μm의) 입자 ~ 4 mg의 무게; 0.5 ml의 이소프로판올을 추가 바이알을 닫고 초음파 목욕 슬러리를 분산. </li><li> , 250 μL 주사기 약 200 ㎕의 슬러리를 철수 PEEK 조합의 1/16 &quot;PTFE 튜브에서 주사기 바늘을 삽입하고 천천히 100 μm의 ID X 360 μm의 외경 모세관에 슬러리를 분배하며로서 현미경으로 관찰 모세 혈관이 달성된다 2-3mm 포장의 길이까지 입자로 채우고, 이것은 마이크로 반응 할 것이다 (그림 1) 20 μ.m의 ID 모세관은 키스톤 효과를 통해 마이크로 반응기에서의 입자를 유지한다. (15) </li><li> H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / V를 50 μl의 솔루션 ~와 마이크로 반응기를 씻어하고 H 2 O / CH 3 CN (98)의 50 μl의 솔루션 ~와 : 2 v / V를. </li></ol> 샘플 솔루션의 2. 준비 주 : 유기 용매 및 산 및 용액 제제의 운반 작업 것을 포함 흄 후드에서 수행되어야한다. 고글, 장갑 및 보호 복을 착용 할 것. <ol><li> CH 3 OH 씻어 몇 유리 병 (4 ㎖) 및 폴리 프로필렌 튜브 (15 ml)에 건조. </li><li> H 2 O / CH 3 CN 용액 10 ㎖를 준비 (98 : 2 v / v)로 15 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 200 μL의 CH 3 CN로 9.8 ml의에게 H 2 O를 혼합하여; 초음파로 섞는다. </li><li> 용액 10 ㎖를 준비 H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v)로 15 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 5 ML의 H 2를 혼합하여 &lt;/ 서브&gt; O 5 ml의 CH 3 CN; 초음파로 섞는다. </li><li> H 2 O / CH 3 CN 4 ml의 4 μL TFA (10 %)를 추가하여 산성화 된 수용액 (TFA 0.01 %의 v / v)의 4 ml의 준비 : 4 ㎖의 유리 병에 (98 2 v / v)의; 초음파로 섞는다. </li><li> 4 ml의 H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v)로에서 4 mL 유리 바이알에 4 μl를 TFA (10 %)를 추가하여 산성화 된 유기 용액 (TFA 0.01 %의 v / v)의 4 ml의 준비; 초음파로 섞는다. </li><li> 16 mg의 NH 4 HCO 3 무게 4 mL 유리 바이알에서 분석 마이크로 밸런스와; (: 2 v / V를 98) 솔루션 및 초음파에 의해 분산 2 O / CH 3 CN에게 H의 4를 가하여 이 수성 버퍼 NH 4 HCO 3 (산도 ~ 7.8)의 50 mM의 솔루션을 초래한다. </li><li> 표준 단백질의 5 mg의 체중 (예를 들면, 소 혈청 알부민, 헤모글로빈 α / β, 시토크롬 C, 탄산 탈수 효소, α-2-HS 당 단백질 등) 4 mL 유리 바이알에서 분석 마이크로 밸런스와; 4 ML의 DI의 물 공급을 추가연구 및 초음파에 의해 분산; 이것은 일반적으로 높은 수준 μM 농도 용액을 초래한다. </li><li> NH 4 HCO 3 (50 mM)을 수성 완충액 적절한 부피 μM 높은 수준의 농도로 용액을 희석하여 1 mL의 단백질 용액 (1-2 μM)를 준비; 초음파로 섞는다. </li><li> (50 mM의 께) NH 4 HCO 3 170 μL 수성 완충액을 20 μg의 서열 분석 등급 트립신 용해 트립신 용액 (5 μM)를 준비; 초음파에 의해 분산. </li></ol> 3. 실험 설정 주 : LTQ-MS 시스템은 다양한 샘플 입력 방식으로 질량 분석 장치의 인터페이스 수있는 조립식 XYZ 스테이지를 포함하는 변성 ESI 공급원이 장착된다. <ol><li> 픽 조합에서 모세관 마이크로 반응기를 분리하고 PEEK 티에 연결합니다. </li><li> 픽 티 옆을 팔에 ~ 2cm 긴 백금 와이어를 삽입; 를 제공하는 1/32 &quot;PEEK 슬리브를 사용누수없는 연결과 백금 와이어를 절연합니다. </li><li> 픽 티의 반대쪽에 (~ 0.5 m 길이) 샘플 전송 모세관 50 μm의 ID X 360 μm의 외경을 연결합니다; 누출이없는 연결을 제공하기위한 1/32 &quot;PEEK 슬리브를 사용합니다. </li><li> XYZ 단계에 PEEK 티를 안전하고 멀리 질량 분석기 입구 모세관에서 ESI 터 ~ 2mm의 위치. </li><li> 질량 분광기의 ESI 전원부에 백금 와이어를 연결한다. </li><li> 스테인리스 연합 샘플 이송 모세관의 대향 단부에 연결; 누출이없는 연결을 제공하는 1/16 &quot;PEEK 슬리브를 사용한다. </li><li> 스테인레스 스틸 노동 조합의 반대 끝에 4-5cm 길이 1/16 &quot;PTFE 튜브를 연결하고 PTFE 튜브에 250 μL 주사기 바늘을 삽입, 예를 들어 (펌프를 켜고 원하는 값에 유량을 설정, 2 μL / 분). </li><li> 이동국 구을 제어하는​​ 소프트웨어 패키지에 입력 탠덤 MS 데이터 수집 매개분석을 수행하기위한 준비를 설치하는 방법 파일로 저장 거라고; LTQ-MS 시스템에 대해 다음 데이터 분석 의존 파라미터를 사용 제외 질량 폭 180 초 동안 활성화 된 동적 배제를 1.5 m / z ±; 하나의 MS는 한 줌 다음 스캔과 MS는 상위 5 가장 강렬한 봉우리 2 스캔, 5m / Z ± 스캔 폭을 확대; 충돌 유도 해리 분리 폭 3m / Z, 정규화 된 충돌 에너지 35 %, 활성화 Q 0.25 및 활성화 시간 30 밀리 초 설정 (CID) 매개 변수를 설정합니다. </li></ol> 4. 미세 유체 설치 <ol><li> 유리 또는 폴리머 기판으로부터 마이크로 유체 장치 준비, 입구에 접속 16-18 장치의 레이아웃이도 2a에 제공되고, 마이크로 반응기로 이루어진 (1) (0.13 mm 폭 × 2 mm 길이 × 50 μm의 깊이) (2 ), 배출구 (3) 측의 포트 (4); 유체 조작에 대한 상호 연결 채널은 ~입니다110 μm의 폭 ~ 50 μm의 깊이; 다중 채널 구조는 (5)로 이루어진 ~ 1.5 ㎛의 깊이 × 10 ㎛ 폭 X 위치 100 μm의 길이 25 ㎛의 미세 간격, 마이크로 리액터에 입자를 유지하기위한 필터로서 작용한다. </li><li> 또는 유체 전달 (그림 2B)에 대한 피팅을 수용하는 고분자 스탠드를 고안하여 입구 포트에 특수 커넥터를 접착하여 칩에 유체 전달 연결을 사용하도록 설정합니다. (16) </li><li> 단계 1.8에 기재된 바와 같이 입자 C18 (5 μm의)의 슬러리를 조제; 칩 측 포트에 접속 1/16 &quot;PTFE 튜빙을 사용하여 주사기와 마이크로 반응기에 상기 슬러리를 제공하는 것은 (4) 90 ºC 오븐에서 에폭시 접착제와 1 시간 동안 경화와 함께 입자 로딩 후 포트를 밀봉 (16). </li><li> 경화 O / N을 E6000 접착제로 밀봉하고,하자, 출구에 모세관 (20 μm의 ID X 90 μm의 OD × 10 mm 길이)를 삽입; 이합니다 (ESI의 터가 될 것이다 <strong&gt; 6). </li><li> 50㎛의 ID X 360 μm의 지름을 연결 (~ 0.5 m 길이) 칩 유입구 샘플 이송 모세관 (2); 3.6-3.7에 기재된 바와 같이, 250 μL 주사기 및 주사기 펌프 모세관의 대향 단부를 연결한다. </li><li> 흡기구 직전 샘플 전송 라인상의 경량 PEEK 티 커넥터 배치 (2) 및 티 측 아암 편에 와이어를 삽입 3.2에 기재된 바와 같고; 이것은 ESI 전극 될 것입니다. </li><li> 질량 분석기 입구 모세관에서 ~ 2mm 거리에 위치하는 ESI 이미 터와 XYZ 스테이지에 미세 유체 소자를 고정; 3.8에 기재된 바와 같이 분석을 위해 MS를 준비한다. </li></ol> 5. 샘플로드, MS 분석을위한 단백질 분해 소화 및 용출 모든 용액 / 샘플 전송 단계를 주사기 펌프의 도움으로 수행되고, 데드 있습니다 volum 보상하기 위해, 완료하기 위해 몇 분 동안 추가로 허용한다 참고및 상기 마이크로 반응기에서 이송 라인과 관련된 ES; 필요한 시간이 포함 된 유량에 따라 달라집니다. <ol><li> 마이크로 반응을 씻어 2 O / CH 3 CN H의 수성 NH 4의 솔루션 HCO 3 (50 mm)를 주입하여 분석 준비를 5 분 동안 2 μL에서 (98 2 v / v)의 / 분; 250 μL 주사기를 사용합니다. </li><li> 2 μL의 시료 용액을 주입하여 미세 반응기에 단백질 샘플 (1 μM)을로드 / 분, 5 분; 250 μL 주사기를 사용합니다. </li><li> 1-3 분 / 2 μL에서 분 마이크로 리액터에 흡착 된 단백질을 통해 트립신 용액 (5 μM)을 주입. </li><li> TFA의 산성화 수용액으로 마이크로 반응기를 세척하여 단백질 분해 소화 과정을 끄다 (0.01 % v / v)의 H 2 O / CH 3 CN에서 (98 : 2 v / v)의 2 μL / 분 5 분; 250 μL 주사기를 사용합니다. </li><li> (단백질의 TFA 산성화 된 유기 용액을 주입하여 미세 반응기로부터 0.01 % 다이제스트 용출 시작v / v)로 H 2 O / CH 3 CN에서 (50:50 v / v)의 300 NL / 분. </li><li> 단말기 데이터 수집 과정과 ESI 전압 (~ 2000 V)를 켭니다; 단계 3.8에 제공된 데이터 수집 매개 변수를 사용하여 MS 데이터를 획득; 트립신 펩타이드의 용출을 관찰합니다. </li></ol> 6. 데이터 처리 <ol><li> 원시 MS 데이터 포맷과 호환되는 검색 엔진 탠덤 MS 데이터를 처리한다. <ol><li> 생체의 특정 최소 중복 단백질 데이타베이스를 사용하여 LTQ-MS 원시 파일을 처리; 검색 엔진의 원시 데이터를 업로드, 각각 2 및 1 다에 부모 및 조각 이온 질량 공차를 설정하고, 최대 두 개의 검색에 대한 분열을 놓친 만 완전히 트립신 단편을 사용한다; 번역 후 변형을 허용하지 않습니다 각각 1 %와 3 %로 높은 및 중간 신뢰 거짓 발견 비율 (FDR)를 설정하고, 번역 후 변형을 허용하지 않습니다. </li></ol></li><li> 만 높은 신뢰를 선택하기 위해 데이터를 필터링펩타이드는 데이터베이스의 단백질과 일치; 단백질 및 펩타이드 수준의 결과를 평가합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 작품에서 설명하는 마이크로 반응기가 제공하는 간편한 구현 미만 30 분에서 MS 분석 및 식별을 가능하게하는 단백질의 효소 소화를 수행하기위한 실험 장치를. 기존의 방법에 비해이 시스템의 뚜렷한 장점은 단순성, 속도, 낮은 시약 소모와 낮은 비용을 포함한다. 특히, 고가의 트립신 고정화 비드 카트리지가 필요 없다. 모세관 마이크로 리액터의 제조는 간단 (도 1a), 그리고 통상적으로 크로마토 그래피 실험에서 발견 된 표준 용품에서 분 이내에 달성 될 수있다. 역상 C18 입자 흡착 단백질 또는 펩티드의 완전한 제거를위한 높은 유기 함량 용제 (CH 3 CN 또는 CH 3 OH)로 세정 할 수있어, 마이크로 리액터는 간단하고 비용 효과적인 제조 공정을 다시 사용할 수 있지만 일회용 APPLIC 일회용 유닛의 제조를 위해 초대관리 포인트. 모세관 마이크로 반응기는도 1b에 도시 된, 또는 표준 상업적인 이온 소스에 삽입 할 수 ...

정제 된 단백질의 동정 및 특성화 자주 MS 기술을 사용함으로써 달성된다. 단백질은 효소로 분해되고 그 펩티드는 더 간단한 주입 실험 장치를 사용하여 MS로 분석된다. 단백질 분해 소화 가장 MS 분석기의 유효 질량 범위에 속하는 작은 펩티드 단편을 생성하기 위해 필요하고, 그 용이 아미노산 서열 정보를 생성하기 위해 저 에너지 충돌 유도 된 분해를 통해 단편화 될 수있다. 절연 단백질 또는 단순 단백질 혼합물, MS 검출하기 전에 펩티드의 크로마토 그래피 분리에 대한 추가적인 필요가 없다. 25-50 펩티드의 혼합물을 용이 MS 이온 소스에 직접 주사기 펌프 시료를 주입하여 분석 할 수있다. 질량 분석 장치는 분석을 수행하고, 짧은 시간 프레임 내에서 단백질의 서열을 확인할 수있다. 현대 데이터 수집 방법과,이 프로세스는 승 달성 될 수있다몇 분 또는 초 ithin. 단시간 스케일에 대한 전체 프로세스를 완료하는 제한 요인이 단백질 분해성 분해 공정이다. 일반적으로, 이것은 수 시간에 걸쳐 수행된다 (또는 O / N) 용액에 37 ºC에서 사용한 기판 (50-100) 효소의 비를 1. 설명 된 미세 반응기 또는 시판되는 카트리지의 형태로, 분, 초, 고정화 효소의 마이크로 리액터의 효소 소화 시간을 감소시킨다. 1-6 일반적으로 효소를 공유 결합, 비 - 공유 / 물리 흡착 복합체가 고정화 형성 또는 캡슐화, 효소 처리의 -3,6- 향상된 효율으로 사용되는 큰 표면 대 부피 및 효소에 대한 기판 비. 고정화 반응기의 추가 이점은 MS 분석에서자가 분해 효소와의 간섭을 감소 효소 안정성 및 재사용 성을 향상시킬 것을 포함한다. 접근법을 이용하여 유리 또는 중합 미세 다양한 장치가 설명되었지만항체 - 항원 상호 작용에 의해 자성 비드에 고정화 효소를 이용하여, 7,8- 9는 티타니아, 알루미나 졸 - 겔 10 nanozeolites 11에 캡슐화 또는 니켈 NTA 또는 그의 태그 복합체 형성을 통해 캡처 된 금 나노 입자의 네트워크에 포획. 6 대안 고정화 효소 개방 관형 모세관도 개발되어있다. (12) 또한, 향상된 단백질 분해 절단은 30-120에 대한 반응 시간을 감소시키기위한 제어 마이크로파 조사 (13) 또는 압력 보조 또는 압력 사이클링 기술 (PCT)을 사용하여 입증되었다 분. (14) 고정화 효소 반응기의 여러 장점에도 불구하고, 상업적 카트리지의 비용이 높고, 일상적인 사용을위한 미세 유체 장치의 유용성은 제한되어, 추가 계측을 필요로하는 전자 또는 PCT 기술 결과의 용도. 이 연구의 목적은 circumve 방법을 개발했다이러한 단점을 NTS, 그것은 쉽게 분 이내 MS 분석에 대비 단백질의 효소 적 분해를 수행하기위한 간단하고 효과적인 방법으로 연구자 강화할 각 실험실에서 구현 될 수있다. 접근법은 모세관 또는 미세 유동 장치에 사전로드 된 소수성 C18 입자의 사용에 의존하며 통해 효소의 주입 중에 효소 분해 한 다음 이들 입자에 관심 단백질 (들)의 흡착 충전 층 및 캡처 단백질 (들). 이 방법에서, 기판은 비 - 공유 상호 작용을 통해 고정되고, 상기 효소가 고정화 된 단백질을 통해 주입된다. 단백질 분해 소화 효율을 효소 처리, 환원 및 입자의 표면으로부터의 거리와, 확산 시간은 단백질을 노출 큰 입자 표면적이 증가 질량 전사 효소의 활성에 영향을 미칠 수없는 공유 결합, 기능 향상 빠르게 evaluat다른 효소 처리 성 및 다중화 E의 조합이 과정은 미세 형식으로 실행되는 경우. 이 방법은 표준 단백질 및 ESI-MS 검출 이전에 단백질 분해 소화 트립신 가장 일반적으로 사용되는 효소의 혼합물을 이용하여 설명된다. 본 연구에 사용 된 검출 질량 분석기는 선형 트랩 중극 (LTQ)기구이다.

<table><tbody><tr><td>이온 트랩 ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>LTQ 질량 분석기는 탠덤 MS 데이터</td></tr><tr><td>XYZ 스테이지</td><td>Newport</td><td>다중 부품을</td> 획득하는 데 사용됩니다 <td>가정용 XYZ 스테이지는 다양한 샘플 전달 시스템에서 입력을 수신하도록 상용 LTQ nano-ESI 소스를 조정하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Edmund optics</td><td>G81-278</td><td>현미경은 마이크로 리액터 패킹 프로세스를 관찰하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>분석 저울 / Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>저울은 단백질 샘플의 무게를 측정하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>초음파 수조 / Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>음파 수조는 샘플을 혼합 / 균질화하고 C18 입자 슬러리</td></tr><tr><td>주사기 펌프 22</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552222</td>를 분산시키는 데 사용됩니다.<td>마이크로 펌프는 패킹된 모세관 마이크로리액터</td></tr><tr><td>Milli-Q 초순수 시스템</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&nbsp;</td><td>MilliQ 정수 시스템은 정제된 DI 물을 준비하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>피펫터/에펜도르프 (1,000&nbsp; &마이크로; l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>피펫터는 소량의 시료 용액을 측정하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&nbsp; &마이크로; l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>피펫터는 소량의 샘플 용액을 측정하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&nbsp; &마이크로; l)</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>피펫터는 소량의 샘플 용액을 측정하는 데 사용됩니다</td></tr>. 용융 <tr><td>실리카 모세관(100 &micro; m ID x 360 &마이크로; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>이 모세관은 마이크로리액터</td></tr><tr><td>용융 실리카 모세관(20&nbsp; &마이크로; m ID x 100 &마이크로; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>이 캐필러리는 ESI 이미터</td></tr><tr><td>융합 실리카 캐필러리(50&nbsp; &마이크로; m ID x 360 &마이크로; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>이 모세관은 주사기 펌프에서 샘플과 용리액을 모세관 마이크로리액터</td></tr><tr><td>유리 모세관 식칼</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td>로 옮기는 데 사용됩니다. 이것은 <td>원하는 길이로 융합 실리카 모세관을 절단하는 도구입니다.</td></tr><tr><td>Glue</td><td>Eclectic Products</td><td>E6000 Craft</td><td>이 접착제는 ESI 이미터를 모세관 마이크로리액터 또는 미세유체 칩</td></tr> 에폭시 <tr><td>접착제</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td>에 고정하는 데 사용됩니다. 이 <td>접착제는 C18 입자가 로드되는 미세유체 입구 구멍을 밀봉하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. 역위상 C18 입자 (5&nbsp; &마이크로; m)</td> <td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>이들은 단백질이 흡착 된 C18 입자입니다. 입자는 4&nbsp에서 추출되었습니다. mm x 20cm C18 LC 컬럼, 애질런트</td></tr><tr><td>주사기/유리(250 &micro; l)</td> <td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>유리 주사기는 모세관 마이크로 반응기에 C18 입자 슬러리를 적재하고 샘플과 용리액을 마이크로 반응기에 전달하는 데 사용됩니다</td></tr>. 내부 <tr><td>환원 PEEK Union (1/16 "에서 1/32")</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>이 조합은 250 &micro; l 5 &micro를 적재하기 위한 microreactor에 주사기; m 입자 슬러리</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 유니온 (1/16 ")</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>스테인리스강 유니온은 유리 주사기 바늘을 주입 모세관</td></tr><tr><td>미량 PEEK 티 커넥터(1/32")</td>에 연결하는 데 사용됩니다.<td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>Peek 티는 샘플 전송 모세관을 모세관 마이크로 리액터에 연결하는 데 사용됩니다. 측면 암에는 Pt 와이어</td></tr><tr><td>Tee 커넥터 (경량)</td>를 삽입 할 수 있습니다 <td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td> 이 Tee 커넥터는 샘플 전송 라인 Pt 와이어 (0.404 mm)를 <td>통해 미세 유체 칩에 ESI 전압을 적용하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td></td><td>VWR</td><td>66260-126</td><td>Pt 와이어는 ESI 생성을 위한 전기 연결을 제공하며 질량 분석기 ESI 전원 공급 장치</td></tr><tr><td>PTFE 튜브(1/16") OD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>테플론 튜빙은 주사기 바늘과 스테인리스 스틸 유니온 사이의 밀폐 연결을 가능하게 하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK 튜빙 (0.015 " ID x 1/16 인치 OD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>Peek 튜빙은 스테인리스 스틸 유니온과 50&nbsp; &마이크로; m ID 전달 모세관</td></tr><tr><td>PEEK 튜빙(0.015" 아이디 x 1/32 " OD)</td> <td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>Peek 튜빙은 융합 실리카 모세관과 Peek Tee</td></tr><tr><td>클린 컷 폴리머 튜빙 커터</td><td>Valco</td><td>JR-797</td> 사이의 누출없는 연결을 가능하게하는 슬리브로 사용됩니다. 이 <td>커터는 1/16 "및 1/32"를 미리 절단하는 데 사용됩니다. 길이가 ~4-5cm 인 조각에서 누출 없는 연결을 위한 슬리브로 사용되는 Peek 폴리머 튜</td></tr><tr><td>빙 호박색 바이알(2ml)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>바이알은 샘플 용액과 C18 입자 슬러리를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>호박색 바이알 (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>바이알은 샘플 용액을 준비하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. 폴리프로필렌 튜브 (15&nbsp; ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>바이알은 버퍼 용액을 준비하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>실린더(100ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>실린더는 용매</td></tr><tr><td>실린더(10ml)</td>의 부피를 측정하는 데 사용됩니다.<td>VWR</td><td>24710-441</td><td>실린더는 용매</td></tr><tr><td>피펫 팁(1,000 &micro; l)</td><td>VWR</td><td>83007-386</td><td>피펫 팁은 소량의 샘플 용액을 측정하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. 피펫 팁(100 &micro; l)</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>피펫 팁은 소량의 샘플 용액을 측정하는 데 사용됩니다</td></tr>. 피<tr><td>펫 팁(10 &micro; l)</td><td>VWR</td><td>53511-681</td><td>피펫 팁은 소량의 샘플 용액을 측정하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>유리 기판 나</td><td>노필름</td><td>B270 흰색 크라운, 3" x 3"</td><td>이들은 마이크로칩 제조를 위한 유리 기판입니다</td></tr><tr><td>수 너트 피팅 (1/16 ")</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>이 피팅은 전송 캐필러리를 미세유체 칩 Nanoport 어셈블리에 연결하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td></td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>이 피팅은 전송 캐필러리를 미세유체 칩</td></tr><tr><td>단백질 표준</td><td>Sigma</td><td>Multiple #</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC 등급</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, HPLC 등급</td><td>Fisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올, HPLC 등급</td><td>시그마</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>시그마</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 암모늄</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>트립신, 시퀀싱 등급</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

플로우를 통해 마이크로 반응기와 ms 검출을위한 단백질의 빠른 효소 처리

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

질량 분석 (MS)의 대부분은 단백질 분석 방법은 일반적으로 트립신, 검출 효소 분해 단계 전에 수반 기반. 이 단계는 질량 분석 기기의 유효 주사 범위 내에 MW &lt;3,000-4,000 다 함께 일반적으로 분자량이 작은 펩타이드의 생성을 위해 필요하다. 종래의 프로토콜은 37 ºC에서 O / N 효소 소화를 포함한다. 최근 발전은 전형적으로 예를 들면, 전자 렌지 나 고 고정화 효소 또는 몇 분에 단백질 가수 분해에 필요한 시간을 단축 상보 물리적 처리 (범위의 마이크로 리액터의 이용을 포함하는 다양한 전략의 개발을 주도 압력). 본 연구에서는 단백질을 빠르게 분해 효소를 달성하기 위해 임의의 실험실에서 구현 될 수있는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명한다. 단백질 (또는 단백질의 혼합물)은 결합 된 C18 역상 높은 퍼포에 흡착모세관 컬럼에서 사전로드 된 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 실리카 입자를 필요치 않는, 수성 완충액 트립신은 짧은 시간 동안 입자를 통해 주입된다. 온라인 MS 검출을 사용하려면 트립신 펩티드는 MS 이온 소스에 직접 증가 유기물 함량과 용매 시스템과 용출된다. 이 방법은 고가의 고정화 효소 입자의 사용을 회피하고, 처리를 완료하는 처치를 필요로하지 않는다. 단백질 소화 완전한 샘플 분석은 각각 ~ 30 분 이하 ~ 3 분 이상으로 달성 될 수있다.

단백질 분해 소화 공정의 대표적인 결과가 상기 마이크로 반응기 (도 1, 2) 표 1에 제공하여, 단백질의 혼합물을 동시에 수행 하였다.이 표는 특정 단백질을 식별하는 고유의 펩티드 서열을 포함하는 십자가 상관도 스코어 (Xcorr) (즉, 대응하는 탠덤 질량 스펙트럼 실험 투 이론적 매치의 품질 특징 스코어) 놓친 분열 횟수, 펩티드 충전 상태 (z) 및 질량 / 전하 ( 양성자 펩티드 m / z). 단백질 수준에서의 표는 단백질, 단백질 및 단백질의 점수 범위의 UniProt 단백질 ID, 설명 (명칭)을 제공한다. 단백질 분해 소화 90 초 동안 수행 한 후에 모든 단백질은 여러 펩타이드에 의해 식별했다. 에 필요한 시간모든 펩타이드의 용출은 300 NL / 분, 나노 ESI 최...

전기 분무 이온화(ESI) 질량 분석기와 결합된 사내 내장 플로우 스루 트립틱 마이크로리액터를 사용한 단백질 분해 분해를 위한 빠른 프로토콜이 제시됩니다. 마이크로 리액터의 제작, 실험 설정 및 데이터 수집 프로세스에 대해 설명합니다.

플로우를 통해 마이크로 반응기와 MS 검출을위한 단백질의 빠른 효소 처리

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 전기분무 이온화 질량 분석기를 이용한 단백질 식별이 가능하도록 단백질의 신속한 효소 소화를 수행하는 유동형 트립신 마이크로반응기의 제작 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 분리 및 정제된 단백질의 아미노산 서열을 규명하여 구조와 기능에 대한 하위 특성 분석을 지원하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 프로토콜의 주요 장점은 속도가 빠르고 비용 효율적이며, 미세 가공 플랫폼을 활용하는 워크플로우에 통합하기 용이하다는 점입니다.먼저, 유리 모세관 절단기를 사용하여 더 큰 유리 모세관을 7~8cm 길이로, 더 작은 모세관을 3~5cm 길이로 자릅니다. 현미경을 사용하여 두 모세관의 끝단이 돌출된 거스러미 없이 깨끗하고 직선으로 잘렸는지 확인합니다. 작은 모세관을 큰 모세관의 한쪽 끝에 약 6mm 정도 삽입합니다.그 후, 면봉을 사용하여 모세관의 접합부 주변에 접착제를 소량 바르고, 실온에서 하룻밤 동안 경화시킵니다. 다음으로, 삽입된 모세관을 약 10에서 15 mm 길이로 자릅니다. 이 끝부분이 전기분무 이온화 방출체 역할을 하게 됩니다.직경이 더 큰 모세관의 반대쪽 끝을 4~5cm 길이로 미리 절단하여 PEEK 유니온에 연결된 1/32인치 PEEK 튜브에 삽입합니다. 그런 다음, 5cm 길이의 1/16 PTFE 튜브 조각을 유니온의 반대쪽 끝에 삽입하고 조입니다. 깨끗하고 건조한 2mL 유리 파일에 C18 입자 4mg을 정량하여 넣은 후, 이소프로판올 0.5mL를 첨가합니다.바이알을 닫습니다. 이를 초음파 세척기에 넣고 초음파 처리를 하여 용액 내의 입자들을 균일하게 분산시킵니다. 다음으로, 250 µL 시린지를 사용하여 C18 슬러리 200 µL를 흡입합니다.주사기를 1/16인치 PTFE 튜브에 삽입하고 슬러리를 커다란 모세관 속으로 천천히 분주합니다. 모세관에 입자가 채워지는 것을 현미경으로 관찰하며, 입자 충전 층의 두께가 2~3mm가 될 때까지 진행합니다. 더 작은 모세관 튜브는 키스톤 효과(keystone effect)를 통해 이러한 입자들을 마이크로리액터 내에 유지시킵니다.마지막으로, 물과 아세토니트릴의 50:50 혼합 용액 50 µL로 마이크로리액터를 헹구고, 이어서 물 49 µL와 아세토니트릴 1 µL를 혼합한 용액 50 µL로 헹굽니다. 모세관 마이크로리액터를 PEEK 유니온에서 분리하여 PEEK-T에 연결합니다. 그런 다음, 누설 없는 연결을 위해 1/32인치 PEE

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

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플로우를 통해 마이크로 반응기와 MS 검출을위한 단백질의 빠른 효소 처리

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