Name: Au-Interactie van SLP1 Polymeren en monolaag van Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS en de AFM als gereedschap voor Biomolecuul-metal Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Ontdek goudsorptie door S-laag eiwitten van Lysinibacillus sphaericus met QCM-D, ICP-MS en AFM. Deze technieken maken real-time detectie van metaalbinding en nanodeeltjesadsorptie mogelijk voor milieutechnologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het huidige werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de IGF-project &quot;S-Sieve&quot; (490 ZBG / 1) gefinancierd door de BMWi en de BMBF-project &quot;Aptasens&quot; (BMBF / DLR 01RB0805A). Speciale dank aan Tobias J. Günther voor zijn waardevolle hulp tijdens AFM studies en Erik V. Johnstone voor het lezen van het manuscript als een native speaker Engels. Verder zou de auteur van dit document graag Aline Ritter en Sabrina Gurlit bedanken (van Institute for Resource Ecology voor hulp bij het ICP-MS-metingen), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava en de groep biotechnologie van het Helmholtz-instituut Freiberg voor Resource Technology.

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit werk onderzochte de binding van Au S-laag-eiwitten werd onderzocht met behulp van een combinatie van verschillende analysemethoden. Vooral de binding van Au is zeer aantrekkelijk, niet alleen voor de terugwinning van Au uit de mijnbouw water of procesoplossingen, maar ook voor de constructie van materialen, bijvoorbeeld sensorische oppervlakken. Voor studies van de interactie Au (Au (III) en Au (0) -NPs) met onderbroken en herkristalliseerd monolaag van SLP1 het eiwit moesten worden geïsoleerd. Daarom he...

Als gevolg van het toenemende gebruik van goud voor verschillende toepassingen, zoals elektronica, katalysatoren, biosensoren, of medische instrumenten, de vraag van dit edelmetaal is gegroeid in de afgelopen paar jaar tijd 6-9. Goud evenals vele andere edelstenen en zware metalen in het milieu via industrieel afvalwater in verdunde concentraties, door middel van mijnbouw, en afvalverwerking 7,8,10, hoewel de meeste milieuvervuiling door zware of edele metalen is een continu proces vooral veroorzaakt door de technologische activiteiten. Dit leidt tot een aanzienlijke verstoring van de natuurlijke ecosystemen en zou kunnen bedreigen de volksgezondheid 9. Weten deze negatieve uitkomsten bevordert het zoeken naar nieuwe technieken om metalen uit vervuilde ecosystemen en verbeteringen te verwijderen in de recycling van metalen uit industrieel afvalwater. Gevestigde fysisch-chemische methoden zoals neerslaan of ionenwisseling zijn niet zo effectief, vooral in de hogely verdunde oplossingen 7,8,11. Biosorptie, hetzij met levende of dode biomassa, is een aantrekkelijk alternatief voor de behandeling van afvalwater 10,12. Het gebruik van dergelijke biologische materialen kan het gebruik van giftige chemicaliën verminderen. Veel micro-organismen zijn beschreven ophopen of immobiliseren metalen. Bijvoorbeeld, cellen Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 toonden hoge bindingscapaciteiten van edele metalen, bijvoorbeeld Pd (II), Pt (II), Au (III) en andere toxische metalen zoals Pb (II) of U (VI) 4,13, cellen van Bacillus megaterium van Cr (VI) 14, cellen van Saccharomyces cerevisiae van Pt (II) en Pd (II) 15 en Chlorella ordinaire voor Au (III) en U (VI) 16 , 17. De binding van de voorgaande metalen zoals Au (III), Pd (II) en Pt (II) is eveneens gerapporteerd Desulfovibrio desulfuricans 18 en L. sphaericus JG-B53 19,20. Toch niet all microben binden grote hoeveelheden metalen en hun toepassing als sorptieve materiaal is beperkt 12,21. Bovendien metaal bindingscapaciteit is afhankelijk van verschillende parameters, bijvoorbeeld celsamenstelling, de gebruikte bio-component, of milieu- en experimentele condities (pH, ionsterkte, temperatuur etc.). De studie van geïsoleerde celwandfragmenten 22,23, zoals membraanlipiden, peptidoglycaan, eiwitten of andere bestanddelen, helpt metaalbindingseigenschappen processen complex geconstrueerde gehele cellen 8,21 begrijpen. De celcomponenten gericht in deze studie zijn S-layer eiwitten. S-layer eiwitten delen van de buitenste celwand van vele bacteriën en archaea, en zij vormen ongeveer 15 - 20% van de totale proteïnemassa van deze organismen. Als eerste interface naar de omgeving, deze mobiele verbindingen sterk beïnvloeden de bacteriële sorptie-eigenschappen 3. S-layer eiwitten met molecuulgewichten variërend van veertigtot honderden kDa wordt geproduceerd in de cel, maar buiten gemonteerd waar ze kunnen lagen op lipidemembranen of polymere celwand componenten vormen. Eenmaal geïsoleerd, bijna alle S-laag eiwitten hebben de intrinsieke eigenschap om spontaan zichzelf assembleren in suspensie, aan interfaces, of op oppervlakken vormen vlakke of buis-achtige structuren 3. De dikte van het eiwit monolaag afhankelijk van de bacteriën en ligt binnen een bereik van 5 - 25 nm 24. In het algemeen kan de gevormde S-layer eiwitstructuren een schuine (p1 en p2), vierkant (p4) of zeshoekig (p3 of p6) symmetrie roosterconstanten 2,5 tot 35 nm 3,24 hebben. Het rooster formatie lijkt in veel gevallen afhankelijk van tweewaardige kationen en voornamelijk Ca 2 + 25,26, Raff, J. et al. S-laag op basis van nanocomposieten voor industriële toepassingen op basis van eiwitten Engineered nanostructuren. (eds Tijana Z. Grove &amp; Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (ingediend)). Toch is de volledige reactie cascade monomeer vouwen, monomeer-monomeer interactie de vorming van een rooster, en de rol van verschillende metalen, vooral van divalente kationen zoals Ca2 + en Mg2 +, zijn nog niet volledig begrepen. De gram-positieve stam L. sphaericus JG-B53 (hernoemd van Bacillus sphaericus na nieuwe fylogenetische classificatie) 27 werd geïsoleerd uit de uraniumwinning afval stapel &quot;Haberland&quot; (Johanngeorgenstadt, Saksen, Duitsland) 4,28,29. De functionele S-layer-eiwit (SLP1) bezit een vierkant rooster, een molecuulgewicht van 116 kDa 30 en een dikte van ≈ 10 nm op levende bacteriecellen 31. In eerdere onderzoeken werd de in vitro vorming van een gesloten en stabiel eiwit met een dikte van ongeveer 10 nm in minder dan 10 min 19 bereikt. De gerelateerde stam L. sphaericus JG-A12, ook een isolaat uit de &quot;Haberland&quot; pile, bezit hoge metaal binding capaciteiten, geïsoleerde S-layer-eiwit blijkt een hoge chemische en mechanische stabiliteit en goede sorptie bekijken van edelmetalen zoals Au (III), Pt (II), en Pd (II) 4,32,33. Deze binding van edelmetalen meer of minder specifiek voor bepaalde metalen en afhankelijk van de beschikbare functionele groepen op de buitenste en binnenste eiwit oppervlak van het polymeer en in zijn poriën, ionsterkte en pH. Relevante functionele groepen voor metalen interactie door de eiwitten COOH, NH 2 -, OH, PO 4 -, SO 4 - en SO. In principe, metaal bindende capaciteiten opent een breed spectrum van toepassingen, Raff, J. et al. S-laag op basis van nanocomposieten voor industriële toepassingen op basis van eiwitten Engineered nanostructuren. (eds Tijana Z. Grove &amp; Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (ingediend)). bv als biosorptive componenten voor de verwijdering of het herstelopgeloste toxische of waardevolle metalen, sjablonen voor synthese of gedefinieerd afzetting van regelmatig gestructureerde metalen nanodeeltjes (NP) voor katalyse en andere bio-engineered materialen zoals bio-zintuiglijke lagen 3,5,18,33. Regelmatig gerangschikte NP arrays zoals Au (0) -NPs zouden kunnen worden voor belangrijke toepassingen gaande van moleculaire elektronica en biosensoren, ultrahoge opslagdichtheid apparaten en katalysatoren voor CO-oxidatie 34-37. De ontwikkeling van dergelijke toepassingen en slimme ontwerp van deze materialen vereist een dieper begrip van het onderliggende metaal bindende mechanismen. Een voorwaarde voor de ontwikkeling van dergelijke materialen op biologische basis is de betrouwbare uitvoering van een tussenlaag tussen het biomolecuul en de technische oppervlak 38,39. Bijvoorbeeld, polyelektrolyten samengevoegd met de laag-voor-laag (LbL) techniek 40,41 zijn gebruikt als interface laag voor herkristallisatie van S-layer eiwitten 39 </sup&gt;. Dergelijke interface biedt een relatief eenvoudige manier de proteïne bekleding te voeren op een reproduceerbare en kwantitatieve wijze. Door uitvoeren van verschillende experimenten met en zonder modificatie met lijm promoters, is het mogelijk om uitspraken betreffende deklaag kinetiek, layer stabiliteit en interacties van metalen met biomoleculen 19,42, Raff, J. et al maken. S-laag op basis van nanocomposieten voor industriële toepassingen op basis van eiwitten Engineered nanostructuren. (eds Tijana Z. Grove &amp; Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (ingediend)). Echter, het complex mechanisme van eiwitadsorptie en interactie eiwit-oppervlak niet volledig begrepen. Vooral informatie over de conformatie, patroon oriëntatie en coating dichtheden wordt nog steeds vermist. Kwartskristalmicrobalans met dissipatie bewaking (QCM-D) techniek heeft de aandacht getrokken in de afgelopen jaren als een instrument voor het bestuderen eiwitadsorptie, coating kinetiek en interactie proprocessen op de nanometerschaal 19,43-45. Deze techniek maakt het mogelijk om gedetailleerde detectie van massa adsorptie in real-time, en kan worden gebruikt als indicator voor het eiwit zelfassemblerende proces op proteïne roosters 19,20,42,46-48 koppeling van functionele moleculen. Daarnaast QCM-D metingen opent de mogelijkheid om metalen interactie processen te bestuderen met de proteïneachtige laag onder natuurlijke biologische omstandigheden. In een recente studie, de interactie van de S-layer-eiwit met bepaalde metalen zoals Eu (III), Au (III), Pd (II) en Pt (II) is onderzocht met QCM-D 19,20. Het geadsorbeerde eiwit laag kan dienen als een vereenvoudigd model van een celwand van Gram-positieve bacteriën. Het onderzoek van deze ene component kan bijdragen tot een beter begrip van metaal interactie. Echter, alleen QCM-D experimenten geen uitspraken over oppervlaktestructuren en invloeden van metalen eiwit mogelijk te maken. Andere technieken zijn nodig om dergelijke informatie te verkrijgen. Een poswoordelijkheid voor bio-imaging nanostructuren en verkrijgen van informatie over structurele eigenschappen is de atomaire kracht microscopie (AFM). De doelstelling van dit onderzoek was om de sorptie van goud (Au (III) en Au (0) -NPs) S-layer eiwitten te onderzoeken, met name SLP1 van L. sphaericus JG-B53. Experimenten werden uitgevoerd met charge gesuspendeerd eiwitten op schaal in een pH traject van 2,0 - 5,0 behulp van ICP-MS en geïmmobiliseerd S-lagen gebruikt QCM-D. Bovendien is de invloed van metaalzoutoplossing aan het rooster stabiliteit onderzocht latere AFM studies. De combinatie van deze technieken draagt ​​bij aan een beter begrip van de in vitro metaal interactie processen als een instrument voor het leren meer over bindende gebeurtenissen op de hele bacteriecellen over specifieke metalen affiniteiten. Deze kennis is niet alleen cruciaal voor de ontwikkeling van de toepasselijke filter materialen voor de recycling van metalen voor de bescherming van het milieu en het behoud van de rebronnen 49, maar ook voor de ontwikkeling van arrays van sterk geordende metalen NP voor diverse technische toepassingen.

<table><tbody><tr><td>Equipement en software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System</td><td>Applikon Biotechnology, Netherlands</td><td>Z6X</td><td>Inclusief dO2, pH sensoren van Applikon Biotechnology en BioXpert software V2</td></tr><tr><td>Noninvasief biomassa monitor BugEye 2100</td><td>BugLab, Concord (CA), USA</td><td>Z9X</td><td>---</td></tr><tr><td>Spectrometer Ultrospec 1000</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Groot-Brittannië</td><td>80-2109-10</td><td>Bedrijf nu GE Healthcare Life Sciences</td></tr><tr><td>MiniStar microcentrifuge</td><td>VWR, Duitsland</td><td>521-2844</td><td>Voor centrifugatie van kweekmonsters</td></tr><tr><td>Onderzoekssysteem microscoop BX-61</td><td>Olympus Germany LLC, Duitsland</td><td>037006</td><td>Microscoop in combinatie met beeldvormingssoftware</td></tr><tr><td>Cell^P (versie 3.1)</td><td>Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Duitsland</td><td>---</td><td>samen met microscoop</td></tr><tr><td>Powerfuge Pilot Separatie System Serie 9010-S</td><td>Carr Centritech, Florida, USA</td><td>9010PLT</td><td>Voor biomassaoogst</td></tr><tr><td>T18 basic Ultra Turrax</td><td>IKA Labortechnik, Duitsland</td><td>431-2601</td><td>Voor flagella verwijdering en monsterhomogenisatie</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>728411</td><td>Gebruikt binnen eiwitisolatie</td></tr><tr><td>Mobiele hoge scheur vloeistofprocessor, M-110EH-30 Pilot</td><td>Microfluidics, Massachusetts, USA</td><td>M110EH30K</td><td>Gebruikt voor celruptuur</td></tr><tr><td>Alpha 1-4 LSC Freeze dryer</td><td>Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Duitsland</td><td>102041</td><td>---</td></tr><tr><td>UV-VIS spectrofotometrie (NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>91-ND-2000C-L</td><td>Voor bepaling van eiwitconcentratie</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN verticale elektroforese kamer</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Duitsland</td><td>165-3322</td><td>Voor SDS-PAGE</td></tr><tr><td>VersaDoc Beeldvormingssysteem 3000</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Duitsland</td><td>1708030</td><td>Gebruikt voor beeldvorming van SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>ICP-MS Elan 9000</td><td>PerkinElmer, Waltham (MA), USA</td><td>N8120536</td><td>Voor bepaling van metaalconcentratie</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Instruments, Worcestershire Verenigd Koninkrijk</td><td>ZEN3600</td><td>Voor bepaling van nanodeeltje grootte</td></tr><tr><td>Q-Sense E4 apparaat&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Zweden</td><td>QS-E4</td><td>besteld via LOT quantum design (software inbegrepen bij E4 platform)</td></tr><tr><td>Q-Soft 401 (data opname)</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Zweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Tools 3 (data evaluatie en modellering)</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Zweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D flow modules QFM&nbsp;401&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Zweden</td><td>QS-QFM401</td><td>besteld via LOT quantum design</td></tr><tr><td>QSX&nbsp; 303 SiO2 piëzo-elektrische AT-cut kwarts sensoren</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Zweden</td><td>QS-QSX303</td><td>besteld via LOT quantum design</td></tr><tr><td>Ozon reinigingskamer</td><td>Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA</td><td>QS-ESA006</td><td>besteld via LOT quantum design</td></tr><tr><td>Atomische kracht microscoop MFP-3D Bio AFM</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td>MFP-3DBio</td><td>AFM metingen en beeldvormingssoftware</td></tr><tr><td>Asylum Research AFM Software AR Versie 120804+1223</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td>---</td><td>beeldvormingssoftware inbegrepen in Cat. Nr. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>Igor Version Pro 6.3.2.3 Software</td><td>WaveMetrics, Inc., USA</td><td>---</td><td>beeldvormingssoftware inbegrepen in Cat. Nr. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>BioHeater</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td>Bioheater</td><td>Sample heater voor AFM metingen</td></tr><tr><td>Biolever mini cantilever,&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>Olympus Germany LLC, Duitsland</td><td>&nbsp;BL-AC40TS-C2</td><td>Voorkeurs cantilever voor AFM metingen</td></tr><tr><td>WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)</td><td>Nanotec Electronica S.L., Spanje</td><td>freeware</td><td>Software voor AFM analyse</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Detergenten en overige apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>azijnzuur, 100 %, p.A.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO.KG</td><td>3738.5</td><td>Gevaar, ontvlambare en corrosief vloeibaar en damp. Veroorzaakt ernstige huidverbrandingen en oogbeschadiging.</td></tr><tr><td>Antifoam 204</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>A6426</td><td>Voor schuimonderdrukking</td></tr><tr><td>bromofenolblauw, natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>B5525</td><td>---</td></tr><tr><td>Coomassie Brillant Blauw R (C45H44N3NaO7S2)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO.KG</td><td>3862.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease II uit varkensmilt</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>D4138</td><td>Typ IV, 2.000 - 6.000&nbsp;Kunitz eenheden/mg proteïne</td></tr><tr><td>Ethanol, 95%</td><td>VWR, Duitsland</td><td>20827.467</td><td>Gevaar, ontvlambaar</td></tr><tr><td>glycerine, p.A.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO.KG</td><td>3783.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride (GuHCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO.KG</td><td>0037.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma GmbH &amp; Co. KG</td><td>9-307-011-4-507</td><td>---</td></tr><tr><td>Zoutzuur (HCl) (37%)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO.KG</td><td>4625.2</td><td>Gevaar; Corrosief, gebruikt voor pH aanpassing</td></tr><tr><td>Lysozyme uit kippeneiwitje</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>L6876&nbsp;</td><td>Gelyofiliseerd poeder, proteïne = 90 %, = 40.000 eenheden/mg proteïne (Sigma)&nbsp;</td>

au-interactie van slp1 polymeren en monolaag van<em&gt; lysinibacillus sphaericus</em&gt; jg-b53 - qcm-d, icp-ms en de afm als gereedschap voor biomolecuul-metal studies

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

In deze publicatie wordt het gedrag van goud-adsorptie van oppervlaktelaag (S-laag) eiwitten (Slp1) van Lysinibacillus sphaericus JG-B53 beschreven. Deze biomoleculen schikken zich in parakristallijne tweedimensionale arrays op oppervlakken, binden metalen en zijn daarom interessant voor verschillende biotechnische toepassingen, zoals biosorptieve materialen voor het verwijderen of terugwinnen van verschillende elementen uit het milieu en industriële processen. De afzetting van Au(0) nanodeeltjes op S-lagen, hetzij door S-laag gerichte synthese 1 of adsorptie van nanodeeltjes, opent nieuwe mogelijkheden voor diverse sensorische toepassingen. Hoewel talloze studies de biosorptieve eigenschappen van S-lagen hebben beschreven 2-5, blijft een dieper begrip van eiwit-eiwit en eiwit-metaal interactie nog steeds een uitdaging. In het volgende onderzoek werd inductief gekoppelde massaspectrometrie (ICP-MS) gebruikt voor de detectie van metaal adsorptie door opgeschorte S-lagen. Dit werd gecorreleerd met metingen van quartzkristal microbalans met dissipatie monitoring (QCM-D), die de online detectie van eiwitmonolayer vorming en metaalafzetting mogelijk maakt, en dus een meer gedetailleerd begrip van metaalbinding.
De ICP-MS resultaten gaven aan dat de binding van Au(III) aan de opgeschorte S-laag polymeren pH afhankelijk is. De maximale binding van Au(III) werd verkregen bij een pH van 4,0. De QCM-D onderzoeken maakten de detectie van Au(III) adsorptie evenals de afzetting van Au(0)-NP's in real-time mogelijk tijdens de in situ experimenten. Verder maakte deze methode het mogelijk om de invloed van metaalbinding op de eiwit latwerk stabiliteit van Slp1 te bestuderen. Structurele eigenschappen en eiwitlaag stabiliteit konden direct na QCM-D experiment worden gevisualiseerd met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM). Kortom, de combinatie van deze verschillende methoden biedt een dieper begrip van metaalbinding door bacteriële S-laag eiwitten in suspensie of als monolayers op bacteriële cellen of herkristalliseerde oppervlakken.

Teelt van micro-organismen en SLP1 karakterisering De opgenomen gegevens van bacteriegroei geeft het einde van de exponentiële groeifase bij ongeveer 5 uur. Eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat SLP1 kunnen worden geïsoleerd uit het ogenblik van de oogst (4,36 g / L natte biomassa (≈ 1,45 g / L (BDW)) met een maximale opbrengst 19. Niettemin optimalisatie van de teelt met gedefinieerde media com...

Om basisinformatie te verkrijgen over de sorption en het recyclen van goud uit waterige systemen, werd de interactie van Au(III) en Au(0) nanodeeltjes op S-laag-eiwitten onderzocht. De sorption van eiwitpolymeren werd onderzocht door ICP-MS en die van eiwitmonolagen door QCM-D. Daaropvolgend AFM maakt de beeldvorming van de nanostructuren mogelijk.

Au-Interactie van SLP1 Polymeren en monolaag van<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS en de AFM als gereedschap voor Biomolecuul-metal Studies

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

Het algemene doel van dit experiment is om het goudsorptiegedrag van S-laageiwitten van de gepresenteerde bacteriële stam te onderzoeken vanuit een ecologisch en technologisch perspectief. Deze methoden kunnen kernvragen in milieugerelateerde wetenschappen beantwoorden, zoals in de vakgebieden van sorptieprocessen en het verwijderen en terugwinnen van metalen. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat u metaalsorptie en nanopartikeladsorptie in een ander schaalbereik kunt detecteren.Door gebruik te maken van QCM-D is het mogelijk om dit in een real-time meting te detecteren. Om deze procedure te starten, worden de vloeistofcellen voorzien van sensordummies. Pomp per module ten minste 20 milliliters van een 2% alkalisch vloeibaar reinigingsmiddel in ultrapuur water door het QCM-D- en buizensysteem.Pomp vervolgens, volgens het protocol van de fabrikant, een volume ultrapuur water dat vijfmaal het volume per module bedraagt door het systeem, met een stroomsnelheid tot 300 microliters per minuut. Reinig de siliciumdioxidesensoren buiten de stroommodules door deze gedurende ten minste 20 minuten te incuberen in een 2% sodium dodecyl sulfate-oplossing. Spoel de sensoren daarna meerdere keren af met ultrapuur water.Nadat de kristallen zijn gedroogd met gefilterde perslucht, worden ze gedurende 20 minuten in een ozoonreinigingskamer geplaatst. Herhaal daarna de reinigingsprocedure tweemaal om alle organische bestanddelen te verwijderen. Om gebonden metalen van het sensoroppervlak te verwijderen, worden de sensoren gespoeld met één molar salpeterzuur.Spoel de sensoren vervolgens meerdere keren af met ultrapuur water. Modificeer de sensoren daarna met afwisselende lagen polyethyleenimine en polystyreensulfonaat in een concentratie van drie gram per liter via dip-coating met de layer-by-layer (LBL) techniek. Plaats de sensoren in de overeenkomstige polyelektrolytoplossing in deep-well platen en incubeer deze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens de sensoren uit de polyelektrolytoplossing en spoel ze tussen elke dipcoatingstap grondig af met ultrapuur water. Zodra de externe modificatie is voltooid, plaatst u de sensoren in de stroommodule. Equilibreer de sensoren door ze met ultrapuur water te spoelen voordat u met de experimenten begint.Los op dit punt het eerder geïsoleerde en gezuiverde Slp1 op in ureumformule om de polymeren in monomeren om te zetten. Centrifugeer de gemonomeriseerde eiwitten gedurende één uur bij 15.000 ×g en 4 °C om grotere eiwitaggregaten te verwijderen. Meng het gesolubiliseerde en gecentrifugeerde Slp1-supernatant met rekristallisatiebuffer tot een uiteindelijke eiwitconcentratie van 0,2 g/L.Na een succesvolle eiwitrecristallisatie op de polyelektrolyt-gemodificeerde sensoren in de stroommodules, worden de gecoate sensoren intensief gespoeld met recristallisatiebuffer bij een stroomsnelheid van 125 microliters per minuut, totdat stabiele waarden voor de frequentie- en dissipatieshifts worden waargenomen. Na een succesvolle Slp1-coating in de stroommodules wordt de verkregen Slp1-laag intensief gespoeld met 1,6 millimolair citraatbuffer pH 5,0, totdat stabiele waarden voor de frequentie- en dissipatieshifts worden waargenomen. Pomp vervolgens een vooraf bereide één millimolaire nanodeeltjesoplossing naar de stroommodules met een stroomsnelheid van 125 microliters per minuut.Volg vervolgens de massa-adsorptie aan de Slp1-laag. Spoel na voltooiing van de interactie met metaalnanodeeltjes de laag af met een nanodeeltjesvrije buffer om zwak gebonden metalen of nanodeeltjes te verwijderen. Leg met een atoomkrachtmicroscoop of AFM met een geïnverteerde optische microscoop beelden vast in vloeistof met ultrapuur water direct op de gecoate QCM-D-sensoren.Spoel de sensoren na de QCM-D-experimenten af met ultrapuur water en plaats ze in de AFM-vloeistofcel. Gebruik een cantilever met een resonantiefrequentie van ongeveer 25 kilohertz in water en een stijfheid van minder dan 0,1 newton per meter. Stel de scansnelheid in tussen 2,5 en 10 micrometers per seconden.Maak beelden in dynamische contactmodus terwijl de cantilever door een piezo wordt aangestuurd op zijn resonantiefrequentie. Bepaal tot slot de afstand van de cantilever tot het oppervlak aan de hand van de demping van de oscillatie. De maximale metaalbindingscapaciteiten van goud(III) door gesuspendeerd Slp1 tonen aan dat het stabiel gebonden was tijdens de incubatie van 24 uur binnen het onderzochte pH-bereik.De onmiddellijke afname in frequentie duidt op een snelle adsorptie en een hoge affiniteit van de eiwitten voor het met polyelektrolyt gemodificeerde oppervlak. De dissipatie neemt eveneens onmiddellijk toe, wat wijst op een adsorptie van visco-elastische moleculen aan het oppervlak vanwege snelle demping, wat resulteert in stijgende dissipatiewaarden. Vooraf gesynthetiseerde gouden nul-nanodeeltjes werden geïncubeerd met Slp1 en geanalyseerd via SDS-PAGE, wat de QCM-D data bevestigde die aantonen dat nanodeeltjes de Slp1-structuur niet verstoren.De adsorptie van vooraf gesynthetiseerde metallische goud-nul-nanodeeltjes wordt voor QCM-D-experimenten weergegeven in delta F-delta D-plots en als dikte- en massaprofielen. Het eiwitrooster van Slp1, hergekristalliseerd op polyelektroliet-gemodificeerde sensoren, wordt hier getoond. De roosterconstante werd bepaald op 13 tot 14 nanometers en de laagdikte bleek 10 plus of minus twee nanometers te zijn.AFM-studies bevestigden dat het Slp1-rooster na de interactie met goud volledig intact bleef, wat de QCM-D-resultaten die de stabiliteit van de coating voorspelden, bevestigt. AFM bevestigt de adsorptie van goud nanodeeltjes op het Slp1-rooster, maar vanwege de deeltjesgrootte volgen deze niet de p4-symmetrie van Slp1. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen één werkdag worden uitgevoerd mits deze correct wordt uitgevoerd.Na toepassing van deze methoden kunnen andere technieken, zoals infraroodspectroscopie of heliumionmicroscopie, worden uitgevoerd om verdere vragen te beantwoorden, zoals specifieke bindingsplaatsen of de interactie met goud of goudnanodeeltjes. De gepresenteerde techniek heeft de weg vrijgemaakt voor de uzrachem om de interacties van biomoleculen met metalen te bestuderen en bijvoorbeeld het adsorptie- en desorptiegedrag op verschillende soorten oppervlakken. Na het bekijken van deze video zou u nu een goed begrip moeten hebben van hoe u de interacties van metalen met biologische oplosmiddelen kunt onderzoeken; vergeet alstublieft niet om bij het gebruik van deze methode een veiligheidsbril, een labjas en uiteraard handschoenen te dragen.

au-interaction-slp1-polymers-monolayer-from-lysinibacillus-sphaericus

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Cellulosomen zijn multi-enzymcomplexen die zijn ontworpen voor het verteren van cellulose. AFM-gebaseerde SMFS werd gebruikt om de mechanische eigenschappen en vouwconfiguratie van cellulosome-geassocieerde eiwitassemblages te bestuderen. We presenteren een complete workflow voor eiwit-immobilisatie, dataverzameling en data-analyse om de interacties van individuele receptor-ligandcomplexen te bestuderen die betrokken zijn bij cellulosome-assemblage.

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Er wordt een protocol gepresenteerd om een grote verscheidenheid aan enkele moleculen covalent aan een AFM-tip te koppelen. Procedures en voorbeelden om de adhesiekracht en vrije energie van deze moleculen op vaste ondergronden en bio-interfaces te bepalen, worden gegeven.

Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

We beschrijven de fabricage en karakterisering van nanobiologische systemen die geïnterfacede nanogestructureerde substraten met geïmmobiliseerde eiwitten en aptameren. De relevante experimentele stappen met betrekking tot lithographische fabricage van nanogestructureerde substraten, bio-functionalisering en karakterisering met behulp van oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie (SERS) worden gerapporteerd. SERS-detectie van op het oppervlak geïmmobiliseerde eiwitten en het onderzoek van...

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detectie van biomoleculen met behulp van EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

Dit werk geeft een protocol voor vloeistofverwerking en monsterintroductiemethode een microkanaal in situ time-of-flight secundaire ionen massaspectrometrie analyse van biomoleculen eiwit in een waterige oplossing.

In Situ karakterisering van gehydrateerde Eiwitten in Water door SALVI en ToF-SIMS

Wij presenteren een protocol glas functionaliseren met nanometrische eiwit pleisters omgeven door een vloeibare lipide dubbellaag. Deze substraten zijn compatibel met geavanceerde optische microscopie en zullen naar verwachting om te dienen als platform voor celadhesie en migratie studies.

Ligand Nano-cluster Arrays in een ondersteunde lipide dubbellaag

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

Hier presenteren we een protocol om eiwitmonomeer te vervoegen door enzymen die eiwitpolymeer vormen met een gecontroleerde sequentie en het op het oppervlak immobiliseren voor spectroscopiestudies met één molecuul.

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Ontdek goudsorptie door S-laag eiwitten van Lysinibacillus sphaericus met QCM-D, ICP-MS en AFM. Deze technieken maken real-time detectie van metaalbinding en nanodeeltjesadsorptie mogelijk voor milieutechnologisch onderzoek.

Au-Interactie van SLP1 Polymeren en monolaag van Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS en de AFM als gereedschap voor Biomolecuul-metal Studies (Video) | JoVE Journal

Au-Interactie van SLP1 Polymeren en monolaag van

Meer video's verkennen