Name: Epicardiale uitgroei Cultuur en Assay Ex Vivo Evaluatie van Epicardial-afgeleide Cell Migratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Leer de uitgroei-cultuurmethode voor het isoleren van primaire epicardiale cellen uit muizenembryo's. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar epitheel-mesenchymale transitie en cardiale regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

EMS werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) [licentienummer R01HL120919]; de American Heart Association [subsidie ​​aantal 10SDG4350046]; University of Rochester CTSA onderscheiding van de NIH [toekenningsnummer UL1 TR000042]; en inbedrijfstelling fondsen van de Aab CVRI. MAT werd mede ondersteund door een subsidie ​​van de Universiteit van Rochester School of Medicine en Tandheelkunde van het Howard Hughes Medical Institute Med-Into-Grad Initiative; en een Institutioneel Ruth L. Kirschstein National Research Service Award van de NIH [toekenningsnummer GM068411].

LET OP: Alle experimenten met muizen werden goedgekeurd door de Universiteit Commissie Animal Resources aan de Universiteit van Rochester. 1. Epicardiale uitgroei Cultuur Assay (Figuur 1A) <ol><li> voorbereidingen <ol><li> Bereid 5 ml medium A voor primaire epicardiale celisolatie aanvulling Medium 199 (M199) met 5% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (Pen / Strep). </li><li> Voorverwarmen medium A en 100 ml Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS) in een 37 ° C waterbad. </li><li> Sta-collageen beklede objectglaasjes kamer opwarmen tot kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Voeg 100 ul medium A aan elk putje van de kamer glijbaan en voorzichtig zwenken gelijkmatig bekleden het collageen oppervlak. Herhaal dit voor 8-12 putten. Verwijder media na coating kamers. </li><li> Aliquot voorverwarmde HBSS in twee 10 cm2 platen die 50 ml van HBSS. </li></ol></li><li> Isoleer Embryonale Harten van Zwangere Dam op 11.5 Days bericht coïtum (DPC).30 <ol><li> Verdoven muis met 0,5 ml 13 mg / ml ketamine / 0,88 mg / ml xylazine cocktail in 1 x Dulbecco&#39;s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) via intraperitoneale injectie. Bevestig de juiste verdoving met behulp van een teen pinch-test. Een zachte pinch volstaat om te bepalen of de muis reageert. Elke beweging of poot te trekken geeft het dier onvoldoende verdoofd om een ​​operatie te doen. Euthanaseren door cervicale dislocatie. </li><li> Leg de muis gericht ventrale zijde naar boven en spuit de buik met 70% ethanol om verontreiniging met haar te verminderen. </li><li> Knijp de huid met een tang en snijd een laterale incisie in de buik met chirurgische schaar. Houd de huid stevig vast en trek uit elkaar in tegengestelde richtingen in de richting van de kop en de staart. </li><li> Knijp het buikvlies met een pincet en snijd met een schaar om de buikholte bloot te leggen. </li><li> Verwijder de decidua voorzichtig door te snijden langs de mesometrium. Breng de ontleed decidua aan voorverwarmde HBSS in de eerste10 cm 2 plaat. </li><li> Scheid de decidua door te snijden tussen embryo&#39;s. </li><li> Transfer een embryo tot de tweede 10 cm 2 plaat met voorverwarmde HBSS onder een dissectie microscoop. Verwijder de extra-embryonale weefsel en dooierzak, daarna onthoofden het embryo. </li><li> Knijp de thoracale wand met een pincet en scheur het weefsel uit elkaar op de middellijn, waardoor de borstholte. </li><li> Plaats de tang achter het hart. Pak de uitstroom-darmkanaal en trek het hart van het embryo. Scheid de luchtwegen en de longen uit het hart, als er nog aan. </li></ol></li><li> Transfer het hart om een enkel putje van de met collageen beklede glijbaan en plaats het dorsale zijde naar beneden (Figuur 1B). Herhaal stap 1.2.7-1.3 voor elk embryo. </li><li> Zodra alle harten werden overgebracht naar afzonderlijke putjes Incubeer de kamer glijbaan voor 30 min bij 37 ° C, 5% CO 2 voldoende hechting aan de collageenmatrix mogelijk. </li><li> voeg voorzichtig20-50 ul voorverwarmde explantatie medium A rond elk hart. Belangrijk: het medium niet te snel of op een niveau boven het hart toe te voegen, anders harten los te maken van het collageen substraat. </li><li> Cultuur het hart bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende ongeveer 24 uur tot epicardiale uitgroei mogelijk. Opmerking: uitwassen kan worden waargenomen zo vroeg 3-4 uur van de cultuur (figuur 1C) en voornamelijk bestaat uit mesotheelcelsuppletie weergeven van geplaveide morfologie, met een minimale mesenchymale cel contaminatie (figuren 1D, E). Representatieve resultaten werden verkregen onder toepassing van een dissectie microscoop uitgerust met een camera. </li></ol> 2. Genetische Ablation en inductie van EMT in Epicardial uitwassen Let op: Behandel adenovirussen met zorg volgens de goedgekeurde richtlijnen bioveiligheid. <ol><li> Bereid 15 ml medium B (M199 aangevuld met 1% FBS en 1% Pen / Strep) en voorverwarmen tot 37 ° C in een waterbad. </li><li> Voor excisie vanfloxed allelen, voor te bereiden explantatie medium B, aangevuld met 2,5 x 10 4 pfu / ml adenovirus uitdrukken Cre recombinase (Ad / Cre) of de controle virus. Opmerking: Adenovirale gemedieerde overexpressie van kandidaatgenen kan ook worden uitgevoerd om overexpressie-fenotypen evalueren. Virale titers worden bepaald door de eindgebruiker. </li><li> Trek-epicard uitgeputte harten van uitgroei culturen behulp van een tang. Overdracht harten 1,5 ml buizen met 800 ul Trizol en bewaar bij -80 ° C voor latere RNA-isolatie en genexpressie analyse. </li><li> Was elk putje DPBS met bloedcellen en overmatige celresten te verwijderen. </li><li> Voeg 500 ul explantaat medium gesupplementeerd met B adenovirus (n) bij elke uitgroei cultuur en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Voor EMT inductie, verwijder de media en aan te vullen met 37 ° C explantatie medium B, aangevuld met recombinant transformerende groeifactor (TGF) -β1 [10 ng / ml] of voertuig (4 mm hydrochloric zuur (HCl) bevattende 1 mg / ml runderserumalbumine (BSA)). Explantaten cultuur nog eens 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Ga verder met gen / eiwit expressie analyses of immunocytochemie zoals beschreven in de daaropvolgende protocollen. Noot: Inductie van epicardiale EMT werd gestimuleerd met diverse concentraties van TGF-β1 variërend van 0,5 ng / ml - 10 ng / ml 26,31-33. Hogere concentraties van ligand kan leiden tot niet-specifieke binding aan alle TGF-β receptoren. De concentratie van TGF-β1 moet de specifieke experimentele doelen weerspiegelen. </li></ol> 3. genexpressie analyse van Epicardial uitwassen <ol><li> Dooi-epicard uitgeputte harten eerder opgeslagen in Trizol (2.2). </li><li> Aspireren media van EPDC culturen en twee keer wassen met DPBS. </li><li> Voeg 800 ul kamertemperatuur Trizol culturen explantatie. </li><li> Incubeer-epicard verarmd harten en EPDC culturen in Trizol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur tempera<html> opnieuw. Pipet op en neer tien keer aan de gelyseerde monster homogeniseren. Opmerking: Hearts kan verder pipetteren nodig om volledig te homogeniseren. </li><li> Transfer lysaten naar 1,5 ml buisjes en vult totaal RNA geïsoleerd volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 10 pg glycogeen vóór precipitatie van RNA opbrengst te verhogen. Een gegeven explantaat wordt ongeveer 0,5-1,0 ug RNA werd verkregen. </li><li> Verwijder verontreinigend DNA met DNase I en reverse transcriberen 0,5 ug mRNA instructies van de fabrikant. </li><li> Valideer de zuiverheid van epicardiale explantaten en / of inductie van EMT kwantitatieve reverse transcriptie (qRT) -PCR 34 middels SYBR groen en de in Tabel 1 beschreven. Normaliseren mRNA niveaus glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) markers en bereken relatieve expressie middels de 2 - methode ΔΔCt 35. Typische resultaten worden getoond in Figuur 2A. </li></ol>title &quot;&gt; 4. Protein Analyse van Epicardial uitwassen <ol><li> Aspireren media van EPDC culturen en twee keer wassen met DPBS. </li><li> Voeg 10 ul ijskoude eiwit lysisbuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM natriumchloride, 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur pH 8,0, 1% Triton X-100, 1x proteaseremmer cocktail) naar elke kamer goed en plaats de kamer dia ijs. Snijd ongeveer ¼ van de bodem op een P200 pipet tip en het gebruik van de resterende stuk naar de cellen af ​​te schrapen van de dia. Pipet op en neer om Lyse epicardiale cellen en transfer naar een 1,5 ml buis. </li><li> Ultrasone trillingen gelyseerde explantaten op laag (160 W) gedurende 5 minuten in een ijswaterbad met 30 sec ON en OFF cycli. </li><li> Centrifuge lysaten gedurende 10 min bij 10.000 xg, 4 ° C. Transfer supernatant naar een nieuwe buis en bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een proteïne assay 36. Opmerking: Een gegeven explantatie tot 1,5 ug totaal eiwit werd verkregen. We hebben ontdekt dat het bundelen van explantaten uit twee harten eend laden 2 ug eiwit per putje is voldoende om gladde spier α-actine (ACTA2) en GAPDH 9 detecteren. De detectie van andere doeleiwitten nodig bundeling meerdere explantatie monsters zoals bepaald door de eindgebruiker. </li></ol> 5. Immunocytochemie van Epicardial uitwassen <ol><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit Explantatie culturen en twee keer wassen met DPBS. </li><li> Voorzichtig voeg 500 pl 4% (v / v) paraformaldehyde of ijskoude methanol aan elk putje en vast explantaten gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur of 10 minuten bij -20 ° C, respectievelijk. Fix volgens antilichaam specificaties zoals aanbevolen door de fabrikant. </li><li> Verwijder fixatief en spoel elk putje DPBS met driemaal gedurende 5 minuten. </li><li> Permeabilize de cellen met 500 pl 0,1% (v / v) Triton X-100 in DPBS gedurende 5 min. </li><li> Verwijderen permeabilisatie oplossing en spoelen met DPBS driemaal gedurende 5 minuten. </li><li> Blokkeer de cellen met 10% serum in DPBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur temperaopnieuw. </li><li> Doorgaan met primair antilichaam kleuring volgens de aanbevelingen van de fabrikant en optimale condities zoals bepaald door de eindgebruiker. </li><li> Verwijderen antilichaamoplossing en spoelen met DPBS driemaal gedurende 5 minuten. </li><li> Solliciteer secundair antilichaam volgens de instructies en tegenkleuring van de fabrikant met een geschikte nucleaire kleurstof. </li><li> Verwijderen antilichaamoplossing en spoelen met DPBS driemaal gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder kamer glijwanden instructies van de fabrikant en deze direct in waterig montage medium aan de cellen. Plaats een dekglaasje over de cellen en de afdichting met nagellak. Typische resultaten worden getoond in Figuur 2B - 2D middels omgekeerde confocale scanning microscopie. </li></ol> 6. Ex Vivo Cultuur Assay (figuur 3A) <ol><li> voorbereidingen <ol><li> Bereid 12 ml ex vivo kweekmedium met een (1: 1) mengsel van Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM): M199 aangevuld met 10%FBS en 1% Pen / Strep. </li><li> In een 37 ° C waterbad, pre-warm ex vivo kweekmedium en 100 ml HBSS. </li><li> Aliquot 1 ml voorverwarmd medium in 8-12 putjes van een plaat met 24 putjes. </li><li> Overdracht voorverwarmd HBSS twee 10 cm 2 platen gemaakt met 50 ml elk. </li></ol></li><li> Isoleer muis embryonale harten in HBSS (zoals beschreven in 1.2) van zwangere dammen op 12,5 dpc. </li><li> Transfer elk hart om een enkel putje van de plaat met 24 putjes met ex vivo kweekmedium. Incubeer de plaat bij 37 ° C, 5% CO 2 onder zacht schommelen handmatig of met behulp van een schudapparaat om hechting te voorkomen. Onmiddellijk ga dan naar stap 7.1. </li></ol> 7. Epicardiale Labeling en EMT inductie in Ex Vivo Cultures <ol><li> Om de epicard labelen, voor te bereiden 12 ml van 37 ° C ex vivo kweekmedium aangevuld met 3,0 x 10 6 pfu / ml van Ad / GFP. Voor gerichte ablatie van floxed allelen, overdracht 6 ml Ad / GFP aangevuld kweekmedium om een ​​nieuwe 15 ml conische buis. Voeg Ad / Cre of adenovirus regelen tot een uiteindelijke concentratie van 1,5 x 10 6 pfu / ml. Noot: overexpressie-analyses kunnen worden uitgevoerd met geschikte adenovirale gemedieerde genafgifte uitgevoerd. </li><li> Verwijder voorzichtig het kweekmedium uit elk putje van de plaat met 24 putjes met behulp van een P1,000 pipet tip. </li><li> Voorzichtig voeg kweekmedium aangevuld met adenovirus (n) aan elk putje. </li><li> Incubeer de plaat bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur onder voorzichtig schommelen. </li><li> Voor EMT inductie bereiden 12 ml van 37 ° C ex vivo kweekmedium dat 10 ng / ml TGF-β1 en 20 ng / ml van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) -BB of drager (4 mM HCl dat 1 mg / ml BSA ). </li><li> Haal kweekmedium uit elk putje van de plaat met 24 putjes met behulp van een P1,000 pipet tip. Voorzichtig spoel de harten met 1 ml DPBS. </li><li> Verwijder de DPBS en vul harten met ex vivo cultuur medium met TGF-β1 en PDGF-BB of voertuig. </li><li> Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C, 5% CO 2 onder voorzichtig schommelen. </li></ol> 8. Cryopreservatie en Immunohistochemie van ex vivo culturen <ol><li> Bereid de Harten voor Cryopreservatie. <ol><li> Verwijder het kweekmedium en was harten tweemaal met ijskoud DPBS. </li><li> Voeg 1 ml van 4% (v / v) paraformaldehyde elk hart en vaststellen voor 2 uur bij 4 ° C onder voorzichtig schommelen. </li><li> Verwijder het fixeermiddel en was tweemaal met DPBS harten. Breng de harten verse putjes met 1 ml 10% (w / v) sucrose bereid in DPBS. Incubeer de plaat overnacht bij 4 ° C met zachte wiegen. </li><li> Zorgvuldig overdragen harten nieuwe putjes met 18% (w / v) sucrose bereid in DPBS. Incubeer de plaat overnacht bij 4 ° C met zachte wiegen. </li><li> Transfer elk hart een cryomold die weefsel bevriezen medium. Onmiddellijk te bevriezen blokken met behulp van vloeibare stikstof en bewaar bij -80 &amp; #176; C. </li></ol></li><li> Sectie harten op 5 micrometer met behulp van een cryostaat en plaats weefselcoupes op positief geladen objectglaasjes. WINKEL glijdt bij -80 ° C tot kleuring. </li><li> Voer immunohistochemie op de afdelingen voor de detectie van de sub-epicardiale basaal membraan. <ol><li> Slides ontdooien gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Hydrateren de secties door twee keer wassen in DPBS gedurende 5 min met zachte wiegen. </li><li> Doorlaatbaar gedeelte met 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de dia&#39;s twee keer in DPBS gedurende 5 min met zachte wiegen. </li><li> Dep het overtollige DPBS en definieer de kleuring regio met een hydrofobe etikettering pen. Blokdelen met 10% serum in DPBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder blok en gelden collageen type IV antilichaam (ColIV, 1: 200) verdund in blok. Incubeer overnacht bij 4 ° C in een vochtigheid geregelde kamer. </li><li> Was de glaasjes drie keer in DPBS voor5 min met zachte wiegen. </li><li> Verdunnen fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam (1: 500) en DAPI (1: 5000) in DPBS en gelden voor de glijbanen. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Kies een geschikte secundair antilichaam met een emissiegolflengte en excitatie onderscheiden van GFP. </li><li> Was de dia&#39;s drie keer in PBS gedurende 5 minuten met zachte wiegen. Mount dia&#39;s met montage medium. </li></ol></li></ol> 9. Imaging en kwantificering van ex vivo culturen <ol><li> Hebben afbeelding een geblindeerde gebruiker en kwantificeren gekleurde coupes. Van minimaal vijf niet-opeenvolgende weefselcoupes van een bepaald hart in 4-5 willekeurige plaatsen langs het epicard (rand van het hart) met een fluorescerende of confocale microscoop bij een vergroting van 40x. Typische resultaten worden getoond in figuur 3B middels omgekeerde confocale scanning microscopie. </li><li> Handmatig tellen het aantal GFP-positieve cellen in dezelfde afbeelding. Identificeer migreren EPDC als GFP positive cellen die zich binnen of buiten de ColIV subepicardiale basaal membraan. Bepaal het percentage GFP migrerende cellen als het aantal migrerende GFP positieve cellen over het aantal GFP-positieve cellen in dezelfde afbeelding. Typische resultaten worden getoond in figuur 3C-D middels omgekeerde confocale scanning microscopie. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier schetsen we gedetailleerde methoden om primaire epicardiale cellen te isoleren door uitgroei en volgen EPDC migratie in ex vivo hart culturen. Voor uitgroei culturen, het juiste moment om de epicard uitgeputte hart te verwijderen verschilt enigszins tussen de experimenten. Periodieke controle van de explantaten na een nacht incubatie wordt aanbevolen om te peilen naar de omvang van de epicardiale uitgroei en het hart uit te pakken voordat fibroblasten verschijnen. Om de zuiverheid te garanderen, moet harte...

Het epicard is een enkele laag van mesotheelcellen lijnen die het hart en effecten cardiale ontwikkeling, rijping en reparatie. Via een sterk gecoördineerde uitwisseling van paracriene signalen, de intieme dialoog tussen het myocardium en epicardium onontbeerlijk cardiale groei en de vorming van niet-cardiale myocyten lineages 1. -Epicardiale afgeleide cellen (EPDC) komen uit een subset van epicardiale cellen door een epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) 2, binnenvallen subepicardiale ruimte en onderliggende myocardium en differentiëren grotendeels in hart- mural cellen en fibroblasten, en een mindere mate, endotheelcellen en cardiomyocyten 3-9. De mechanismen reguleren epicardiale EMT en EPDC invasie werden toegeschreven aan de gecoördineerde actie van verschillende moleculen, waaronder uitgescheiden liganden 10-13, celoppervlak receptoren en adhesiemoleculen 14,15, reguLators van apicale-basale polariteit 16,17, kleine GTPases 18,19 en transcriptiefactoren 2,20,21. Hoewel veel van de moleculaire effectoren van EPDC migratie zijn gedefinieerd, een beter begrip van de fysiologische signalen die EPDC mobilisatie stimuleren het embryo kan de ontwikkeling van strategieën versnellen dit proces te manipuleren in de volwassen verbeterde cardiale regeneratie. Studies gericht op het identificeren van nieuwe regulatoren van EPDC mobilisatie een beroep doen op de zuivering van deze cel populatie of het opsporen van de migratie van individuele epicardiale cellen. Een of meer markergenen, waaronder WT1, Tcf21, Tbx18 en / of Aldh1a2, wordt vaak gebruikt om de foetale epicard 1 te identificeren. Het gebruik van deze merkers te sporen migratie EPDC niet optimaal expressie van epicardiale merkers afneemt in de loop van de ontwikkeling van het hart en wordt vaak verloren als epicardiale cellen transdif ondergaanferentiatie in mesenchymale cellen. De toepassing van de Cre / loxP-systeem, in combinatie met-lineage tracing verslaggevers, is nuttig geweest in permanent het labelen van de epicard en de nakomelingen tijdens de ontwikkeling van het hart en de volgende ischemische schade in de volwassen 7,22,23. Verschillende-epicardiale beperkt Cre lijnen zijn gegenereerd en worden op grote schaal gebruikt om EPDC labelen en voor conditionele gen deletie strategieën 1. Deze studies hebben geleid tot de identificatie van verschillende epicardiale lijnen en de identificatie van kritische mediatoren van EPDC motiliteit en differentiatie. Echter, de opslag bewijs suggereert ook het epicard is een heterogene populatie van voorlopercellen 4,24,25. Derhalve zal slechts een deel van epicardiale cellen worden gericht met een bepaalde Cre driver. Om de gehele epicard ongeacht Cre specificiteit label, hebben een aantal laboratoria uitgroei cul benuttuur systemen of ex vivo orgaan kweekmethoden trouw isoleren of het etiket epicardiale cellen zonder afhankelijk van de expressie van een genetische markers lijn 26-28. Voor ex vivo migratie studies, zijn embryonale harten die voorafgaand aan epicardiale EMT en gekweekt in medium, aangevuld met een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen adenovirus (Ad / GFP) 9,18. Deze benadering maakt een efficiënte labeling van de gehele epicard plaats van een subset van cellen door Cre gemedieerde recombinatie. Hart culturen worden vervolgens blootgesteld aan bekende inductoren van EMT om de mobilisatie van EPDC 28,29 stimuleren. Ex vivo en in vivo analyses worden aangevuld door in vitro epicardiale explantatie culturen, die een bijzonder nuttige benadering voor het verkennen van gedetailleerde mechanismen achter EPDC migratie. We beschrijven werkwijzen voor het isoleren primaire epicardiale cellen in vitro studies epicardial EMT, alsmede een orgaan kweeksysteem voor ex vivo analyses van EPDC motiliteit. We hebben onlangs aangetoond dat het nut en de robuustheid van deze methode door genetisch moduleren van de myocardin-gerelateerde transcriptiefactor (MRTF) / serum response factor (SRF) signalering as-actine gebaseerde migratie van EPDC 9 manipuleren. Terwijl onze bevindingen benadrukken een signaalroute die nodig zijn voor het regelen EPDC migratie, deze werkwijzen zijn geschikt voor het ontrafelen van de mechanismen die gezamenlijk orkestreren EPDC migratie en differentiatie. Bovendien zou het explantaat en ex vivo kweeksystemen in functionele screens worden uitgevoerd om nieuwe regulatoren van EPDC mobilisatie te identificeren voor therapeutische toepassingen in cardiale regeneratie.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Hyclone&nbsp;</td><td>SH3002201</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution</td><td>Hyclone</td><td>SH3003102</td><td>HBSS</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Hyclone</td><td>SH3025301</td><td>M199</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate-Buffered Saline&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH3002802</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp;</td><td>Gemini&nbsp;</td><td>100-106</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Solution</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides</td><td>Corning</td><td>354557</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24-well plates</td><td>Falcon</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>Uitgerust met Leica KL300 LED-bron</td></tr><tr><td>Confocal miscroscope</td><td>Olympus</td><td>1X81</td><td>Uitgerust met multi-argonlaser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser en kwiklamp</td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode&nbsp;</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Transforming growth factor beta 1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>100-B-001</td><td>TGF-&beta;1</td></tr><tr><td>Platelet-derived growth factor BB</td><td>R&amp;D Systems</td><td>220-BB-010</td><td>PDGF-BB</td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Applied Biosystems</td><td>15596-026</td><td>Let op, gevaarlijk materiaal</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>DNaseI</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Glycogen</td><td>Life Technologies</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>BioRad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibtor cocktail tablets</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Goat-anti-rabbit 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Secundaire antilichaam</td></tr><tr><td>Alexa Goat anti-rabbit 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td>Secundaire antilichaam</td></tr><tr><td>Alexa Goat anti-mouse 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11005</td><td>Secundaire antilichaam</td></tr><tr><td>Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td>monocloonaal antilichaam, clone 1A4</td></tr><tr><td>Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1)</td><td>Life Technologies</td><td>MA1-46028</td><td>monocloonaal antilichaam, clone 6F-H2</td></tr><tr><td>Rabbit anti-ZO1</td><td>Life Technologies</td><td>40-2200</td><td>polycloonaal antilichaam</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Collagen Type 4</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>polycloonaal antilichaam</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Fluorescent mounting medium&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA verdund tot 4% in DPBS. Let op, gevaarlijk materiaal</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Freezing Medium</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-B</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td>DAKO</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Disposable mictrotome blades&nbsp;</td><td>Sakura Finetek</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td>positief geladen, 25 mm x 75 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Cryostat&nbsp;</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Disposable base molds</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

epicardiale uitgroei cultuur en assay<em&gt; ex vivo</em&gt; evaluatie van epicardial-afgeleide cell migratie

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Een enkele laag van epicardiale cellijnen het hart, waardoor paracriene factoren die cardiomyocyt proliferatie stimuleren en rechtstreeks bij cardiovasculaire progenitoren tijdens ontwikkeling en ziekte. Hoewel een aantal factoren zijn betrokken bij cel-epicard afgeleide (EPDC) mobiliseren, zijn de mechanismen die de latere migratie en differentiatie slecht begrepen. Hier presenteren we in vitro en ex vivo strategieën EPDC motiliteit en differentiatie te bestuderen. Ten eerste beschrijven we een methode voor het verkrijgen primaire epicardiale cellen door uitgroei Cultuur van de embryonale muis hart. We introduceren ook een gedetailleerd protocol om driedimensionale migratie van gelabelde EPDC beoordelen in een orgaan kweeksysteem. Wij leveren het bewijs met behulp van deze technieken die genetische deletie van-myocardin gerelateerde transcriptiefactoren in het epicard verzwakt EPDC migratie. Deze aanpak dient als een platform om de kandidaat-modifiers van EPDC evaluerenbiologie en kunnen worden gebruikt om genetische of chemische screens voor nieuwe regulatoren van EPDC mobilisatie die nuttig zijn voor cardiale regeneratie kan zijn kaart te brengen.

De epicard kan efficiënt worden geïsoleerd met behulp van een uitloper cultuur assay door gebruik te maken van het exterieur locatie en het benutten van de ontwikkelingsplasticiteit en intrinsieke migratiegedrag van EPDC. Muriene embryonale harten zijn geïsoleerd aan E11.5 voorafgaand aan epicardiale EMT en beschaafde dorsale zijde naar beneden op de collageen-gecoate kamer dia&#39;s 26 (figuur 1 A, B). Geëxplanteerde harten zal blijven krimpen; Toch zal de ep...

Hier beschrijven we methoden voor het isoleren van primaire muis epicardiale cellen door middel van een uitgroei-kweektest en het beoordelen van de functionele migratie van epicardiale-afgeleide cellen (EPDC) met behulp van een ex vivo hartkweeksysteem. Deze protocollen zijn geschikt voor het identificeren van genetische en chemische modulatoren van epicardiale epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) en mobiliteit.

Epicardiale uitgroei Cultuur en Assay<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Evaluatie van Epicardial-afgeleide Cell Migratie

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

De algemene doelen van de uitgroeicultuurmethode en de ex vivo migratietest zijn respectievelijk het isoleren van primaire culturen van epicardiale cellen voor het bestuderen van overgangen van epitheel naar mesenchym en het beoordelen van de functionele migratie van epicardiale afgeleide cellen. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze het isoleren van primaire culturen uit het epicardium vergemakkelijken en het testen van de intrinsieke gedragingen van epicardiale afgeleide stamcellen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de ontwikkeling van strategieën voor het manipuleren van epicardiale afgeleide celbiologie in de cardiale regeneratieve geneeskunde.In voorbereiding op epicardiale celisolatie, warm voorgecoate collageen gecoate kamerslides op tot kamertemperatuur en voeg 100 microliters medium A per putje toe. Verwijder het medium na het coaten van de kamers en zorg ervoor dat er geen gepoold medium achterblijft. Om primaire epicardiale cellen te isoleren, oogst eerst muizenembryo's op 11,5 dagen post coitum.Gebruik pincetten om de borstwand van embryo's te knijpen en het weefsel open te scheuren in het midden, waardoor de borstholte wordt blo

epicardial-outgrowth-culture-assay-ex-vivo-assessment-epicardial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven het gebruik van een muis ES-cel-gebaseerde test kritische tijdvensters voor de Wnt / β-catenine en BMP signaal activering tijdens cardiogene inductie te identificeren. De methode biedt een gestandaardiseerd platform dat betrouwbaar kwantificeert cardiogene efficiëntie, en het is van toepassing op de studie van andere cellijnen.

Gewijzigd muis embryonale stamcellen gebaseerde test voor het kwantificeren van Cardiogene Inductie Efficiency

De craniale mesenchym ondergaat dramatische morfogenische bewegingen die waarschijnlijk zorgt voor een drijvende kracht voor verhoging van de neurale...

Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

Ontwikkelingsstudies in de muis worden gehinderd door de ontoegankelijkheid van het embryo tijdens de dracht. Om de lange termijn cultuur van het embryonale hart te bevorderen in de late stadia van de zwangerschap, hebben we een protocol waarin het uitgesneden hart wordt gekweekt in een semi-vaste, verdunde Matrigel ontwikkeld.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Methode voor de embryonale Mouse Hart

Hier beschrijven we de ontwikkeling en toepassing van een gelcontractie-assay voor het evalueren van contractiele functie in mesenchymale cellen die een epitheel-mesenchymale overgang hebben ondergaan.

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay om contractiele functie van mesenchymale Cellen die Onderging-mesenchymale transitie Evalueer

Het epicardium is een essentiële bron van multipotente cardiovasculaire stamcellen en paracriene factoren die nodig zijn voor cardiovasculaire ontwikkeling en regeneratie. We beschrijven hier een methode om muis embryonale epicardiale cellen te kweken.

In Vitro Cultuur van epicardiale cellen uit muis embryonale Heart

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

De Epicard speelt een cruciale rol in de ontwikkeling en het herstel van het hart door het verstrekken van cellen en de groei factoren op de myocardiale wand. Hier beschrijven we een methode om cultuur menselijke primaire epicardial cellen, die het mogelijk de studie en vergelijking van de kenmerken van hun ontwikkelings- en volwassen maakt.

De isolatie en de cultuur van de primaire Epicardial cellen, afgeleid van menselijke volwassen en foetale hart Specimens

We presenteren drie eenvoudige in vitro testen-de lange afstand migratie test, de co-cultuur migratie test, en chemo-attractie test-dat gezamenlijk evalueren van de functies van de menselijke stamcel afgeleid periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen.

Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

In vitro modellen van coronaire angiogenese kan worden gebruikt voor de ontdekking van de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese. In vitro explantculturen van sinusvenosus- en endocardiumweefsels laten een robuuste groei zien in reactie op VEGF-A en vertonen een vergelijkbaar patroon van COUP-TFII-expressie als in vivo.

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Klassiek is het endocardium van de embryonale klep primordium van de muis geanalyseerd met behulp van transversale, coronale of sagittale secties. Onze nieuwe benadering voor en face, tweedimensionale beeldvorming van het endocardium in valvulogene gebieden maakt planaire polariteit en celherschikkingsanalyse van het endocardium mogelijk tijdens de ontwikkeling van de klep.

En Gezicht Endocardiale kussenvoorbereiding voor planaire morfogeneseanalyse bij muizenembryo's

Dit protocol presenteert een gedetailleerd methodologisch kader voor op elektroporatie gebaseerde transgenese van hartcellen in zich ontwikkelende muizenharten. De video-items die hier worden aangeboden, vergemakkelijken het leren van deze veelzijdige techniek.

Een efficiënte transgenesebenadering voor genafgifte in het embryonale hart van muizen

Leer de uitgroei-cultuurmethode voor het isoleren van primaire epicardiale cellen uit muizenembryo's. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar epitheel-mesenchymale transitie en cardiale regeneratieve geneeskunde.

Epicardiale uitgroei Cultuur en Assay Ex Vivo Evaluatie van Epicardial-afgeleide Cell Migratie (Video) | JoVE Journal

/search?query=myocardine-gerelateerde%20transcriptiefactor

Epicardiale uitgroei Cultuur en Assay

Meer video's verkennen