Name: Trascrittoma Profiling di In-Vivo Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri il profilo del trascrittoma in embrioni bovini pre-impianto utilizzando una piattaforma microarray a due colori. Questo metodo consente l'analisi dell'espressione genica con quantità minime di RNA totale.

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Ricerca supportata da Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, e Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.

La parte animale di questo studio è stato condotto presso l&#39;Unità di Ricerca metabolica della University of Alberta, Edmonton, Canada, con tutte le procedure sperimentali su animali approvato (protocollo # AUP00000131) per l&#39;Università di Alberta cura degli animali e del Comitato uso, e gli animali curati secondo al Consiglio canadese delle linee guida per la cura degli animali (1993). 1. di produzione di embrioni, Isolamento di RNA totale e trattamento DNasi <ol><li> Per i protocolli sperimentali animali e di raccolta degli embrioni riferimento nelle nostre precedenti pubblicazioni 17, 18. </li><li> Piscina e scatto congelare simili embrioni palco da ogni mucca in azoto liquido e poi continuare a -80 ° C fino a quando l&#39;estrazione di RNA. </li><li> Estrarre RNA totale tramite un kit di estrazione di RNA colonna-based che consente di estrarre l&#39;RNA da campioni pico-scala (informazioni kit è disponibile in Lista dei Materiali). NOTA: consigliato kit contiene: condizionata Buffer, estrazione Buffer, il 70% di etanolo, il tampone di lavaggio 1, il tampone di lavaggio 2, tampone di eluizione, colonne di purificazione RNA con tubi di raccolta e tubi microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 10 ml Extraction Buffer al tubo contenente gli embrioni e incubare per 30 minuti a 42 ° C. provetta da centrifuga a 800 xg per 2 minuti per raccogliere estratto cellulare nella provetta. </li><li> Pipettare 250 microlitri condizionata tampone sulla membrana del filtro colonna di purificazione. Incubare la colonna di purificazione dell&#39;RNA con condizionata tampone per 5 min a temperatura ambiente. Centrifugare la colonna di purificazione nel tubo di raccolta in 16.000 xg per 1 min. </li><li> Pipettare 10 ml di etanolo al 70% nella miscela di RNA Extraction Buffer ed embrioni. Mescolare bene pipettando su e giù. miscela Pipettare nella colonna di purificazione precondizionato. </li><li> Per legare RNA, centrifugare la colonna di purificazione per 2 min a 100 xg e seguire immediatamente da una centrifugazione a 16.000 xg per 30 s per rimuovere flusso attraverso. </li><li> Dispensare 10081; L di tampone di lavaggio 1 nella colonna di purificazione e centrifugare per 1 min a 8000 x g. NOTA: DNase trattamento è consigliato se si esegue la trascrizione inversa o di amplificazione dopo l&#39;isolamento di RNA. </li><li> Digest DNA genomico dopo passo 1.8. NOTA: consigliato kit DNasi è disponibile in Lista dei Materiali. Kit consigliato contiene: soluzione di riserva DNasi I e Buffer. </li><li> Preparare miscela di incubazione DNase mescolando 5 soluzione madre microlitri DNasi I con 35 microlitri di buffer. Mescolare capovolgendo delicatamente. </li><li> Pipettare il microlitri DNasi miscela 40 di incubazione direttamente nella membrana colonna di purificazione. Incubare a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Pipettare 40 microlitri tampone di lavaggio 1 nella membrana colonna di purificazione e quindi si centrifuga a 8000 xg per 15 s. </li><li> Pipettare 100 microlitri tampone di lavaggio 2 nella colonna di purificazione e centrifugare per 1 min a 8000 x g. </li><li> Pipetta altri 100 microlitri tampone di lavaggio 2 nella colonna di purificazione e centrifugareper 2 minuti a 16.000 x g. </li><li> Trasferire la colonna di purificazione di un nuovo 0.5 mL provetta. Pipettare 11 ml di tampone di eluizione direttamente sulla membrana della colonna di purificazione. Per garantire il massimo assorbimento di Elution Buffer nella membrana, toccare delicatamente la punta della pipetta alla superficie della membrana, mentre l&#39;erogazione del tampone di eluizione. </li><li> Incubare la colonna per 1 min a temperatura ambiente. Centrifugare la colonna per 1 min a 1000 xg per distribuire Elution Buffer nella colonna, e poi girare per 1 min a 16.000 xg per eluire RNA. </li><li> Utilizzare strumento bioanalizzatore secondo le istruzioni del produttore per valutare la qualità e la quantità di RNA 19. </li><li> Conservare il campione di RNA a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. RNA di amplificazione e di etichettatura per l&#39;analisi di microarray NOTA: Per l&#39;utente prima volta a lavorare con le procedure di amplificazione di RNA e di etichettatura, utilizzare cinque ng di spike-in RNA along con i campioni reali ARNA per monitorare la misura di controllo della qualità dell&#39;amplificazione RNA e ibridazione. Il picco-in mix RNA contiene dieci in vitro di sintesi, trascrizioni poliadenilato in rapporti prestabiliti. Quando la procedura eseguita correttamente, le trascrizioni etichettati specificamente ibridano solo per sonde di controllo complementari matrici ei dati possono essere acquisiti per monitorare la garanzia di controllo della qualità con sé il minimo o cross-ibridazione. Maggiori dettagli descrizione per quanto riguarda la procedura di spillo-in intensità di controllo e di normalizzazione dopo la scansione l&#39;array e analisi dei dati è fare riferimento a precedenti pubblicazioni 20, 21. La procedura seguente viene data agli utenti di microarray di routine. <ol><li> Preparare alta qualità (valore numerico RNA Integrity (RIN) almeno&gt; 7.0) 100 pg campione di RNA in un volume totale di 10 - 11 microlitri. </li><li> Amplificare i campioni di RNA con un kit di amplificazione in grado dilavorare con i campioni pico-scala (non più di 100 pg). NOTA: Consigliato informazioni kit di amplificazione è disponibile in Lista dei Materiali e segue le istruzioni del produttore, senza alcuna modifica. </li><li> Utilizzare una quantificazione basato sulla fluorescenza per valutare il profilo della gamma di dimensioni del ARNA amplificato. </li><li> Utilizzare lo strumento spettrofotometro (basato sul assorbanza a 260 e 280 nm) per misurare la concentrazione della ARNA amplificato. </li><li> Conservare il ARNA amplificato a -80 ° C fino al momento per l&#39;etichettatura. </li><li> Utilizzare 2 mg di RNA amplificato per l&#39;etichettatura fluorescente secondo le ULS ARNA manuale d&#39;uso Kit di etichettatura. NOTA: Poiché Cyanine 547 e 647 Cyanine colorante sono sensibili a foto-degradazione e Cyanine 647 colorante è facilmente degradato dall&#39;ozono, la procedura di etichettatura avviene in una quantità minima di luce e sotto un ambiente privo di ozono. </li><li> Attiva la casella di ozono (Figura 1A) finché il livello di ozono è 0,001 ppm. </li><li&gt; eseguire la configurazione reazione all&#39;interno della scatola di ozono (Figura 1B) con l&#39;aggiunta di 2 ml di Cyanine 547 o Cyanine 647, 2 ml di tampone di etichettatura, e quindi regolare ad un volume finale di 20 ml con acqua RNase-free sotto la luce di sicurezza. Aggiungi filtro camera oscura alla sorgente luminosa. </li><li> Miscelare delicatamente e incubare le provette in un termociclatore a 85 ° C per 15 min. I campioni in ghiaccio per almeno 1 min. Spin down per raccogliere il contenuto dei tubi prima di procedere con il kit di estrazione di RNA, salvo passaggi relativi al trattamento DNasi (1,9-1,11), per ripulire l&#39;RNA amplificato Cy-dye-etichettati. </li><li> Utilizzare lo strumento spettrofotometro per misurare e determinare la concentrazione di RNA amplificato marcato e mantenere il ARNA etichettati a -80 ° C al massimo per 3 giorni prima dell&#39;uso. </li></ol> 3. microarray ibridazione e di lavaggio NOTA: Le seguenti passi importanti sono adattate in base a due colori per microarray a base di analisi di espressione genica Protocol (versione6.5, maggio 2010). <ol><li> Aggiungere la stessa quantità di 825 ng da ciascuna Cyanine 547- e 647 Cyanine marcati ARNA e mescolare con 25x e 10x frammentazione buffer di blocco. </li><li> Riscaldare il miscuglio a 60 ° C per 15 minuti e raffreddare in ghiaccio per 1 min. </li><li> Aggiungere la stessa quantità di tampone di ibridazione 2x e mescolare bene. </li><li> Centrifugare a 13.000 rpm, quindi la miscela è pronta per l&#39;ibridazione. </li><li> Carica 100 microlitri dalla miscela sul vetrino matrice e sigillare la slitta all&#39;interno della camera di ibridazione. </li><li> Caricare la camera montata nel forno di ibridazione per 17 ore a 65 ° C rotante a 10 rpm in forno. </li><li> Lavare le matrici secondo protocollo con trattamento protettivo di ozono mediante immersione in stabilizzazione ed essiccazione soluzione per 30 s. </li><li> Rimuovere le matrici dalla soluzione e assicurarsi che la superficie array è asciutta, senza particelle di polvere </li></ol> 4. La scansione microarray diapositive <ol><li> Mantenere gli array in luogo buio e accendere scanner finché è pronto per l&#39;uso (15 min tempo di attesa). </li><li> Caricare il codice a barre serie a sinistra, nello scanner e avviare la scansione. Fare l&#39;analisi loco secondo il manuale d&#39;uso del software e salvare i dati come (GPR) formato di file. </li></ol> 5. Analisi statistica <ol><li> Scaricare il software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Clicca su &quot;dati grezzi di importazione&quot; e caricare i file GPR in FlexArray. </li><li> Eseguire la normalizzazione e l&#39;analisi statistica, se necessario, seguendo le istruzioni. Nota: Calcolare la soglia per la selezione positiva posto in questo studio come è stato descritto in precedenza 22. </li><li> Selezionare il menu a tendina dal visualizzatore trama del FlexArray per visualizzare tutti i punti ibridate e segnali di fondo. Nota: Un quadro analogo di spillo nei controlli dopo l&#39;ibridazione di microarray può essere visto in precedente studio 8. </li><li> Seleziona unnormalizzazione Loess all&#39;interno dell&#39;array seguito da un quantile tra processo di normalizzazione array dal FlexArray discesa manuale di conseguenza. </li><li> Esportare tutti i dati normalizzati da FlexArray in un file Excel per un ulteriore utilizzo. </li></ol> 6. Analisi Bioinformatica L&#39;annotazione originale delle sequenze di scansione da trascrizioni specifici embrione bovino (BESTv1) microarray è stato descritto in precedenza 8. Nel presente studio, 20,403 Simboli Gene unici (GS) sono stati ottenuti ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">Supplemento File1</a> ) attraverso il EmbryoGENE Laboratory Information Management System (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Un elenco di 6.765 geni unici ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">Supplemento File2</a> ) è stato selezionato e corrispondeva ai segnali tutti positivi dopo il processo di normalizzazione microarray (punto 5.5) Bovine 7 ° giorno gene embrioni profilo di espressione. Soglia di segnale positivo è stato calcolato sulla base di pubblicazione pervio 16 dalla intensità di un valore di un segnale. <ol><li> Per eseguire l&#39;analisi funzionale con PANTHER (Protein analisi tramite evolutivi Relationships) Sistema di Classificazione 23, 24, aprire il seguente link (http://www.pantherdb.org/about.jsp). </li><li> Carica un elenco di 6.765 GS-specific di embrioni per identificare specifici processi biologici durante lo sviluppo embrionale utilizzando il test sovrarappresentazione statistiche e di utilizzare l&#39;impostazione predefinita di Bos taurus (tutti i geni nel database) come elenco di riferimento 25. NOTA: Questo permette l&#39;identificazione dei processi di sviluppo legati dai termini GO che sono statisticamente sovra o sotto-espressi utilizzando un test binomiale. </li><li> Set soglia P-value &lt;0.05 di default del software. I dati possono essere scaricati e expoari in file di Excel per ulteriore selezione 16. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il primo problema di effettuare analisi di microarray usando Giorno 7 embrioni di bovini non è sempre una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per lo studio dell&#39;espressione genica. estrazione di RNA fenolo Tradizionale / cloroformio e metodo di precipitazione in etanolo non è raccomandato per Giorno 7 embrioni, con conseguente bassa resa e la possibile fenolo avanzi di inibire la reazione di amplificazione di RNA. Invece, un metodo basato su colonne standard è preferibile isolare l&#39;RNA totale e quindi el...

All&#39;inizio perdita embrionale nelle vacche ad alta produzione di latte è una delle principali sfide del settore lattiero-caseario 1, 2. Bovina è diventato un modello interessante per studiare lo sviluppo preimpianto dell&#39;embrione umano a causa del loro processo di sviluppo simile a 3, 4. Tuttavia, più ricerca è necessaria per avere una migliore comprensione di geni coinvolti nello sviluppo embrionale precoce bovina. Dopo venti anni dalla prima tecnologia microarray sviluppato nel 1995 5, lo sviluppo di più sofisticate tecnologie sonda fabbricazione errori di stampa ridotti e variabilità dei chip a matrice all&#39;interno e tra le diverse piattaforme di microarray 6. La tecnologia microarray migliorata determinato un ampiamente l&#39;applicazione di questa tecnologia nel campo della ricerca clinica 7 e, più recentemente, in embrione precoce qvalutazione ualità 8. La grande quantità di materiale necessario per la tecnologia microarray è la ragione principale per cui la tecnologia microarray inizialmente non è riuscito a entrare in un certo numero di campi di ricerca come sviluppo embrionale precoce. Più di recente, i metodi di amplificazione di RNA sono stati migliorati per amplificare linearmente RNA fino al livello microgrammi da sub-nanogrammo materiale di partenza di RNA 9. Ci sono diversi kit RNA amplificazione commerciali disponibili sul mercato; tuttavia, il più popolare kit ben sviluppati sono legati alla Ribo-Single Primer isotermica di amplificazione 10 e T7 promotore guidato 11 metodi. Il più popolare di amplificazione RNA antisenso utilizza nella trascrizione vitro con un oligo dT fondo il collegamento a un promotore T7 a 5 &#39;12. Questa tecnologia consente di mantenere più di trascritti rappresentativi anti-senso dopo amplificazione lineare fo array ibridazione 13. Questo metodo è stato adattato per amplificare il livello picogrammi di RNA totale estratto da embrioni bovini 8. Universale Linkage System (ULS) è il metodo di etichettatura che incorpora direttamente il DNA o RNA amplificato con colorante fluorescente in platino-linked sia Cyanine 547 o 647 Cyanine, formando un legame coordinativo sulla posizione N7 della guanina 14. Questo metodo è stato adattato nella ricerca embrioni per generare più stabile amplificato ARNA senza modifiche rispetto al aminoallyl modificati su ARNA generata dal metodo enzimatico 15. metodi sia singolo colorante ed etichettatura due coloranti sono stati adattati utilizzando universale Linkage System nella microarray. Un ampio studio confronti microarray è che vi è una buona correlazione della qualità dei dati tra le piattaforme di array uno o due colori 6. Recentemente, sia in auto promotore T7Metodi n amplificazione RNA antisenso ed etichettatura ULS sono stati sviluppati per fornire un protocollo più affidabile per generare una quantità sufficiente di alta qualità etichettati materiali ARNA per microarray ibridazione 8, 16. Pertanto, questo studio fornisce un protocollo per dimostrare alcune importanti passi da estrazione di RNA per l&#39;analisi dei dati coinvolti in microarray due colori usando Giorno 7 embrioni bovini come esempio.

<table><tbody><tr><td>Kit di isolamento dell'RNA PicoPure</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Set di DNasi senza RNasi (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Kit Arcturus RiboAmp HS PLUS</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0505</td><td></td></tr><tr><td>2100 Strumenti per bioanalizzatori</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Nastro per schermo a RNA</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>Kit di etichettatura fluorescente ULS</td><td>Kreatech Diagnostics</td><td>EA-021</td><td></td></tr><tr><td>Microarray di espressione genica personalizzati</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio per l'espressione genica Agilent</td> 1 <td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio per espressione genica Agilent 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>Parte #5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>2x Hi-RPM Hybridization Buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Parte #5190-0403</td><td></td></tr><tr><td>25x Fragment Buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5185-5974</td><td></td></tr><tr><td>10x GE Blocking Agent</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5281</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di stabilizzazione ed essiccazione</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Parte #5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per guarnizioni abilitati dalla tecnologia Agilent SureHyb</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2524-60012</td><td>Confezione da 20 vetrini per guarnizione, 4 microarray/vetrino</td></tr><tr><td>Kit Spike-In RNA a due colori</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Cat# 5188-5279</td><td></td></tr><tr><td>Scanner array GenePix 4000B</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>GENEPIX 4000B-U</td><td></td></tr><tr><td>Scatola senza ozono</td><td>BioTray</td><td>OFB_100x200</td><td></td></tr><tr><td>file GAL</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

trascrittoma profiling di in-vivo embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

La perdita embrionale precoce è un grande fattore che contribuisce all'infertilità nei bovini. Inoltre, il bovino diventa un modello interessante per studiare lo sviluppo dell'embrione preimpianto umano grazie al loro processo di sviluppo simile. Sebbene sia noto che i fattori genetici influenzano lo sviluppo embrionale precoce, la scoperta di tali fattori è stata una seria sfida. La tecnologia dei microarray consente la misurazione quantitativa e la profilazione dell'espressione genica dei livelli di trascrizione su base genomica. Una delle principali decisioni che devono essere prese quando si pianifica un esperimento di microarray è se utilizzare un approccio a uno o due colori. Il design a due colori aumenta la replicazione tecnica, riduce al minimo la variabilità, migliora la sensibilità e l'accuratezza, oltre a consentire di avere disegni di loop, definendo i campioni di riferimento comuni. Sebbene il microarray sia un potente strumento biologico, ci sono potenziali insidie che possono attenuarne la potenza. Pertanto, in questo documento tecnico dimostriamo un protocollo ottimizzato per l'estrazione, l'amplificazione, la marcatura, l'ibridazione dell'RNA amplificato marcato nell'array, la scansione dell'array e l'analisi dei dati utilizzando la strategia di analisi a due colori.

Un risultato rappresentativo di RNA totale e amplificato aRNA dal Giorno 7 embrioni di bovini è mostrato in figura 3 e riassunti nella Tabella 1. integrità dell'RNA e profilo possono essere valutate dopo l'estrazione di RNA. Valutazione della qualità di RNA potrebbe essere fatto per strumento Bioanalyzer (figura 3A) e solo i campioni con un valore superiore a 7,0 RIN sono qual...

La tecnologia Microarray consente la misurazione quantitativa e la profilazione dell'espressione genica dei trascritti su base genomica. Pertanto, questo protocollo fornisce una procedura tecnica ottimizzata in un array bovino a due colori su misura utilizzando embrioni bovini del giorno 7 per dimostrare la fattibilità dell'utilizzo di una bassa quantità di RNA totale.

Trascrittoma Profiling di In-Vivo Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

L'obiettivo generale di questo video è quello di fornire una procedura tecnica ottimizzata utilizzando un array bovino personalizzato a due colori utilizzando una bassa quantità di RNA totale proveniente dagli embrioni bovini del settimo giorno. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti la perdita embrionale nelle vacche da latte ad alta produzione e domande sulla qualità embrionale rispetto all'espressione genica nell'embrione in via di sviluppo prima dell'impianto. Il vantaggio di questa tecnica è che possiamo studiare l'espressione genica utilizzando il livello di picogramma dell'RNA totale estratto da singoli embrioni.Questo metodo può fornire informazioni sul fattore che influenza la sopravvivenza degli embrioni bovini preimpianto prodotti in vivo. Questo può anche aiutare a migliorare le tecnologie riproduttive come la produzione di embrioni in vitro. Per iniziare la procedura, preparare gli embrioni bovini congelati in una provetta da microcentrifuga da un kit di estrazione dell'RNA su scala pico a colonna.Aggiungere 10 microlitri di tampone di lisi alla provetta e incubare gli embrioni a 42 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, centrifugare la provetta per due minuti a 800 volte G.Pipette 250 microlitri di tampone di condizionamento nella membrana del filtro della colonna di purificazione e incubare la colonna per cinque minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la provetta di raccolta a 16.000 volte G per un minuto per terminare il precondizionamento della colonna.Aggiungere 10 microlitri di etanolo al 70% alla miscela di tampone di lisi ed embrioni e mescolare bene. Quindi, caricare la miscela sulla colonna di purificazione. Centrifugare la colonna per due minuti a 100 volte G, quindi a 16.000 volte G per 30 secondi.Aggiungere 100 microlitri del primo tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare a 8.000 volte G per un minuto. Utilizzando un kit DNase, mescolare cinque microlitri di soluzione madre con 35 microlitri di tampone e mescolare capovolgendo delicatamente il tubo chiuso. Quindi, caricare la miscela di DNasi sulla membrana della colonna di purificazione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.Aggiungere 40 microlitri del primo tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare a 8.000 volte G per 15 secondi. Quindi, aggiungere 100 microlitri del secondo tampone di lavaggio e centrifugare per un minuto. Aggiungere un'altra porzione del secondo tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare per due minuti a 16.000 volte G.Trasferire la colonna di purificazione in un'altra provetta da microcentrifuga e caricare 11 microlitri di tampone di eluizione sulla membrana della colonna.Incubare la colonna per un minuto a temperatura ambiente. Centrifugare la colonna per un minuto a 1.000 volte G, e poi per un altro minuto a 16.000 volte G.Controllare la qualità e la quantità dell'RNA eluito, quindi conservare il campione a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Utilizzando un kit di amplificazione, amplificare 100 picogrammi di RNA di alta qualità.Valutare l'intervallo di dimensioni dell'aRNA amplificato con quantificazione basata sulla fluorescenza. Quindi, determinare la concentrazione di aRNA mediante spettrofotometria. Preparare due microgrammi di aRNA amplificato per la marcatura fluorescente con un kit standard.Installa una scatola di ozono in una camera oscura e attendi che il livello di ozono scenda a 0,001 parti per milione. Posiziona un filtro per camera oscura sulla luce. Quindi, portare il campione nella scatola dell'ozono e aggiungere due microlitri ciascuno di cianonina cinque colorante e tampone di etichettatura.Con il campione sotto una luce sicura, aggiungere acqua priva di RNasi per ottenere un volume totale di 20 microlitri. Mescolare delicatamente il campione, quindi incubare la provetta in un termociclatore a 85 gradi Celsius per 15 minuti. Raffreddare il campione con ghiaccio per un minuto, quindi centrifugare il campione.Pulisci l'aRNA marcato e amplificato con un kit di estrazione dell'RNA. Utilizzando il tipo appropriato di spettrometro, determinare la concentrazione di aRNA marcato e amplificato. Preparare un secondo campione di aRNA amplificato marcato con il colorante cianina tre.Conservare i campioni di aRNA a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un massimo di tre giorni. Combina 825 nanogrammi ciascuno di Cy3 e aRNA marcato con 5. A questo si aggiungono il buffer di blocco e il buffer di frammentazione.Incubare la miscela a 60 gradi Celsius per 15 minuti, quindi raffreddare con ghiaccio per un minuto. Aggiungere 55 microlitri di tampone di ibridazione e mescolare bene senza introdurre bolle d'aria. Centrifugare la miscela a 11, 300 volte G per un minuto.Caricare 100 microlitri di campione sul vetrino dell'array e sigillare il vetrino nella camera di ibridazione. Ibridare il campione per 17 ore a 65 gradi Celsius ruotando a 10 rotazioni al minuto. Preparare una soluzione stabilizzante ed essiccante per l'ozono.Lavare gli array, prendendo precauzioni per ridurre al minimo l'esposizione all'ozono, quindi immergerli nella soluzione stabilizzante e asciugante per 30 secondi. Assicurarsi che la superficie dell'array sia asciutta e priva di polvere. Conservare gli array in una posizione buia.Accendere lo scanner di microarray e attendere che sia pronto per la scansione. Quindi, carica l'array con il codice a barre a sinistra. Eseguire un'analisi spot e salvare i dati come file GPR.Nel software di analisi statistica, normalizzare e analizzare i dati. Calcola la soglia di selezione del punto positivo e visualizza il grafico dei segnali ibridati e di fondo. Eseguire una normalizzazione Loess all'interno dell'array e quindi una normalizzazione del quantile tra gli array.Esporta i dati normalizzati in un file di foglio di calcolo. Utilizza tutti i segnali positivi in un repository di dati di microarray per creare un elenco ID di geni unici selezionati. Carica l'elenco ID in un database di classificazione e analisi delle proteine, scegliendo bos taurus come organismo, ed esegui un test di sovrarappresentazione statistica predefinito.Dopo l'amplificazione a due giri, i frammenti sono di dimensioni molto simili e di buona qualità. Il successo dell'amplificazione con questo metodo dovrebbe produrre un aumento di almeno mille volte dell'aRNA. Un'immagine microarray di alta qualità ha un'elevata intensità spot e una bassa intensità di sfondo su entrambi i canali.Se l'intensità dello sfondo è troppo alta, la risoluzione del segnale sarà scarsa. Circa il 46% delle macchie si trovava al di sopra del fondo, da cui sono stati isolati 6.765 trascritti unici di RNA espressi nella blastocisti. Un test di sovrarappresentazione statistica ha indicato che i primi 10 termini di ontologia genica rappresentavano processi di divisione cellulare attivi.Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della riproduzione animale di esplorare l'espressione genica embrionale e di valutare come vari fattori influenzano l'embrione in via di sviluppo. Questa tecnica è stata sviluppata anche in altre specie importanti, come il maiale. Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi come la PCR quantitativa per convalidare i risultati dei microarray.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre l'RNA dagli embrioni e di come amplificare ed etichettare l'RNA per eseguire l'analisi dei microarray a due colori.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Tutto il monte In Situ</emIbridazione> di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Riportiamo qui l'espressione robusto ed efficiente di proteine ​​fluorescenti dopo l'iniezione di mRNA in oociti fecondati di Branchiostoma lanceolatum. Lo sviluppo della tecnica microiniezione in questo chordate basale aprirà la strada di una profonda innovazioni tecniche in questo sistema modello emergente, tra cui imaging in vivo e manipolazioni gene-specifici.

L'espressione di proteine ​​fluorescenti in Branchiostoma lanceolatum By mRNA iniezione in ovociti non fecondate

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