Name: のトランスクリプトームプロファイリング生体内で産ウシ着床前の胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶ産ウシ着床前胚のトランスクリプトームプロファイリング法。微量RNAから遺伝子発現を解析し、胚の品質と生存に影響する要因を明らかにする。乳牛の繁殖技術向上に貢献する。

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研究は、アルバータ州畜産食肉局、アルバータ州イノベーション - BioSolutions、アルバータ州牛乳、およびアルバータ州農林業省の家畜研究支部によって支援されています。

この研究の動物の一部は、アルバータ州の動物実験委員会の大学によって承認され、すべての動物実験手順（プロトコル＃AUP00000131）と代謝研究アルバータ大学の単位、エドモントン、カナダ、で行われ、そして動物は応じての世話をしました。アニマルケアのガイドライン（1993年）のカナダ人評議会へ。 1.胚の生産、全RNAおよびDNアーゼ治療の単離<ol><li>動物実験プロトコルおよび胚の収集のために私たちの以前の出版物17、18に参照してください。 </li><li>プールし、液体窒素中で各乳牛から同様の段階の胚を凍結した後、RNA抽出まで-80℃に保つスナップ。 </li><li> （キットの情報は材質一覧で利用可能です）ピコ規模なサンプルからRNAを抽出することが可能になり、カラムベースのRNA抽出キットを経由して全RNAを抽出します。 注：推奨キットが含まれています：コンディショニング・バッファ、抽出BUFをFER、70％エタノール、洗浄バッファー1、洗浄バッファー2、溶出バッファー、収集管とマイクロ遠心チューブを有するRNA精製カラム。 </li><li> 10μLのExtraction Bufferは、胚を含むチューブに追加し、42℃で30分間インキュベートします。 2分間800×gで遠心分離管をマイクロ遠心チューブに細胞抽出物を収集します。 </li><li>精製カラムのフィルター膜上に250μLコンディショニング・バッファをピペット。室温で5分間コンディショニングバッファを有するRNA精製カラムをインキュベートします。 1分間16,000×gでコレクションチューブに精製カラムを遠心します。 </li><li>ピペットRNA抽出緩衝液および胚の混合物中に70％のエタノールの10μL。ピペッティングによりよく混ぜます。プレコンディショニング精製カラムにピペット混合物。 </li><li> 100×gで2分間、RNA、遠心分離精製カラムを結合して、すぐに通る流れを除去するために30秒間16,000×gで遠心分離することによって従ってください。 </li><li>ピペット10081; 8000×gで1分間の精製カラムと遠心への洗浄緩衝液1のL。 注：DNアーゼ処理は、RNA単離の後、逆転写又は増幅を行う場合にお勧めします。 </li><li>右のステップ1.8の後、ゲノムDNAを消化。 注：推奨のDNaseキットは素材リストで利用可能です。推奨されるキットが含まれています：DNアーゼIストック溶液およびバッファを。 </li><li> 35μLバッファーで5μLのDNase Iストック溶液を混合することにより、DNアーゼインキュベーション混合物を準備します。静かに転倒混和。 </li><li>精製カラムの膜に直接40μLのDNaseインキュベーション混合物をピペット。室温で15分間インキュベートします。 </li><li>精製カラム膜へのピペット40μL洗浄緩衝液1、次いで15秒間8000×gで遠心します。 </li><li> 8,000×gで1分間の精製カラムと遠心にピペットで100μLの洗浄緩衝液2。 </li><li>精製カラムと遠心機の中に別の100μLの洗浄緩衝液2をピペット16,000×gで2分間。 </li><li>新しい0.5 mlのマイクロ遠心チューブに精製カラムを転送します。直接精製カラムのメンブレン上に溶出バッファーのピペット11μL。溶出緩衝液を分配しながら、膜への溶出バッファーの最大吸収を確実にするために、穏やかに膜の表面にピペットの先端をタッチします。 </li><li>室温で1分間カラムをインキュベートします。カラムに溶出バッファーを配布するために千×gで1分間カラムを遠心してから、RNAを溶出するために16,000×gで1分間スピン。 </li><li> RNAの質と量19を評価するための製造元の指示に従ってバイオアナライザー機器を使用してください。 </li><li>使用するまで-80℃でRNAサンプルを保管してください。 </li></ol> 2.マイクロアレイ解析のためのRNA増幅とラベリング注：RNA増幅とラベリング手順で作業初めてのユーザーのために、RNA ALOにスパイクの5 ngのを使用RNA増幅およびハイブリダイゼーションの品質管理測定を監視するために、実際のaRNAサンプルを用いてngの。スパイク中のRNAミックスが所定の割合で10 in vitroで合成し、ポリアデニル化転写物を含んでいます。手順が適切に実行すると、標識された転写物は、具体的にのみ配列中の相補的なコントロールプローブにハイブリダイズしたデータは、最小限の自己または交差ハイブリダイゼーションと品質管理保証を追跡するためにスキャンすることができます。アレイおよびデータ分析をスキャンした後スパイクインコントロール強度と正規化手順についての詳細の説明は、以前の出版物20、21を参照してくださいです。以下の手順は、通常のマイクロアレイユーザに与えられます。 <ol><li> 11μL - 10の全体積で100 pgの高品質なRNAサンプル（RNA完全性番号（RIN）の値は、少なくとも&gt; 7.0）を準備します。 </li><li>増幅キットはにできることでRNAサンプルを増幅（100頁わずかとして）ピコスケールのサンプルで動作します。 注：推奨増幅キット情報は、マテリアルリストで利用可能で、任意の変更を加えることなく、製造元の指示に従います。 </li><li>増幅されたaRNAのサイズ範囲のプロファイルを評価するために、蛍光ベースの定量を使用してください。 </li><li>増幅されたaRNAの濃度を測定する（260および280 nmの吸光度に基づいて）分光光度計の測定器を使用してください。 </li><li>標識のための準備ができるまで-80℃で増幅されたaRNAを保管してください。 </li><li> ULS aRNAのラベリングキットのユーザーガイドに記載の蛍光標識のために増幅されたRNA2μgのを使用してください。 注：シアニン547及びシアニン647色素は光劣化及びシアニン647色素に敏感であるので、容易にオゾンによって分解され、標識操作は、光の最小量のオゾンのない環境下で行われます。 </li><li>オゾンのレベルは0.001 ppm以下になるまで、オゾンボックス（ 図1A）をオンにします。 </li><li&gt;はシアニン547またはシアニン647、ラベリングバッファーの2μLの2μLを追加することによって、オゾンボックス（ 図1B）内の反応セットアップを行い、その後、セーフライトの下でRNaseフリー水で20μLの最終容量に調整します。光源に暗室フィルタを追加します。 </li><li>穏やかに混合し、15分間85℃でサーモサイクラーにチューブをインキュベートします。少なくとも1分間、氷の上に置いてサンプル。 CY-色素標識増幅されたRNAをクリーンアップするために、（1.9から1.11へ）DNase処理に関連する手順を除いて、RNA抽出キットを進める前に、チューブの内容を収集するためにスピンダウン。 </li><li>測定および標識された増幅されたRNAの濃度を測定し、使用前に3日間、-80℃の最大で標識したaRNAを維持するために、分光光度計の測定器を使用してください。 </li></ol> 3.マイクロアレイハイブリダイゼーションおよび洗浄注：次の重要なステップは、二色マイクロアレイベースの遺伝子発現解析プロトコル（バージョンに応じて適応されます6.5、2010年5月）。 <ol><li>各シアニン547-から825 ngの同量のを追加し、シアニン647標識したaRNA及び25Xフラグメンテーションと10倍のブロッキングバッファーと混合します。 </li><li> 15分間60℃で混合物を加熱し、1分間氷上で冷却します。 </li><li> 2×ハイブリダイゼーション緩衝液の同量を加え、よく混ぜます。 </li><li> 13,000 rpmで遠心分離し、次いで混合物は、ハイブリダイゼーションのための準備ができています。 </li><li>アレイスライド上に混合物から100μLをロードし、ハイブリダイゼーションチャンバ内のスライドをシール。 </li><li>オーブンで10 rpmで回転させ、65℃で17時間ハイブリダイゼーションオーブンに組み立て室をロードします。 </li><li>安定化に浸漬し、30秒のための溶液を乾燥することによりオゾン保護処理とプロトコルに従って配列を洗ってください。 </li><li>無塵粒子を溶液からアレイを削除し、アレイ表面が乾燥していることを確認してください</li></ol> 4.スキャンマイクロアレイスライド<ol><li>暗い場所で配列を維持し、scannをオンにしますえー（15分の待ち時間）を使用する準備ができるまで。 </li><li>スキャナーに、左側の列のバーコードをロードし、スキャンを開始します。ソフトウェアのユーザーガイドに従ってスポット分析を行うと（GPR）ファイル形式としてデータを保存します。 </li></ol> 5.統計解析<ol><li> FlexArrayソフトウェアをダウンロードhttp://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php「輸入生データ」をクリックし、FlexArrayにGPRファイルをロードします。 </li><li>必要に応じて指示に従うことによって正規化および統計分析を実行します。注：それは以前に22に記載されたように、本研究ではポジティブスポット選択のためのしきい値を計算します。 </li><li>すべてのハイブリダイズしたスポットやバックグラウンド信号を表示するFlexArrayのプロットビューアから手動ドロップダウンを選択します。注：マイクロアレイへのハイブリダイゼーション後のコントロールにスパイクの同様の絵は、以前の研究8で見ることができます。 </li><li>選択しますFlexArrayからのアレイの正規化プロセスの間に変位することにより、以下の配列内の黄土正規化は、それに応じてマニュアルをドロップダウン。 </li><li>エクスポート、他の用途のためのExcelファイルにFlexArrayからすべての正規化されたデータ。 </li></ol> 6.バイオインフォマティクス解析ウシ胚特異的転写産物からのプローブ配列の元の注釈は（BESTv1）マイクロアレイは8以前に記載されています。本研究では、20403ユニークな遺伝子シンボル（GS）は、（得られた<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">File1のサプリメント</a> EmbryoGENEラボラトリー情報管理システム（LIMS）ELMA（http://elma.embryo-gene.ca）を介して）。 6765ユニークな遺伝子（のリストは<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">File2の補足</a> ）（マイクロアレイ正規化処理後に選択し、すべての正の信号に対応したステップ50.5）ウシの7日目の胚の遺伝子発現プロファイルから。陽性シグナル閾値はA値の信号強度から透過刊行16に基づいて計算しました。 <ol><li>分類システム23、24 PANTHER（進化的関係を通じてタンパク質解析）との機能解析を実行するには、以下のリンク（http://www.pantherdb.org/about.jsp）を開きます。 </li><li>統計的な過剰発現試験を用いて、胚発生の間に特定の生物学的プロセスを特定し、参照リスト25のようにボスの牡牛座 （データベース内のすべての遺伝子）のデフォルト設定を使用するように6765胚特異的GSのリストをアップロードします。 注：これは統計的に過剰または過少発現二項検定を使用しているGOタームから進化の関連プロセスの識別を可能にします。 </li><li>ソフトウェアのデフォルトとして&lt;0.05でP値のしきい値を設定します。データがダウンロードされ、博覧会することができますさらなる選択16用のExcelファイルにRTED。 </li></ol>

<ol><li>Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertility+in+dairy+cows%3A+bridging+the+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Fertility in dairy cows: bridging the gaps.</a> Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).</li>
<li>Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+survival+in+dairy+cows+managed+under+pastoral+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions.</a> Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).</li>
<li>Wrenzycki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+culture+system+and+protein+supplementation+on+mRNA+expression+in+pre-implantation+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos.</a> Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).</li>
<li>Menezo, Y. J., Herubel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+bovine+models+for+human+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse and bovine models for human IVF.</a> Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+%28MAQC%29+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li>
<li>Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+the+cancer+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of the cancer transcriptome.</a> Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).</li>
<li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+resources+to+obtain+a+comprehensive+survey+of+the+bovine+embryo+transcriptome+through+deep+sequencing+and+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays.</a> Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).</li>
<li>Nygaard, V., Hovig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Options+available+for+profiling+small+samples%3A+a+review+of+sample+amplification+technology+when+combined+with+microarray+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling.</a> Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).</li>
<li>Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+isothermal%2C+linear+nucleic+acid+amplification+systems+for+highly+multiplexed+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications.</a> Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).</li>
<li>Phillips, J., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+RNA+Amplification%3A+A+linear+amplification+method+for+analyzing+the+mRNA+population+from+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells.</a> Methods. 10 (3), 283-288 (1996).</li>
<li>Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+aRNA+production+during+T7+amplification+to+prevent+the+loss+of+sample+representation+during+microarray+hybridization+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation.</a> Nucleic Acids Res. 37 (8), 65(2009).</li>
<li>Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+Linkage+System%3A+versatile+nucleic+acid+labeling+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Re.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique.</a> Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).</li>
<li>Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Providing+a+stable+methodological+basis+for+comparing+transcript+abundance+of+developing+embryos+using+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays.</a> Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).</li>
<li>Tsoi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+porcine+%28Sus+scofa%29+embryo-specific+microarray%3A+array+annotation+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation.</a> BMC Genomics. 13, 370(2012).</li>
<li>Salehi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/rd/rdv26n1ab208">Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid.</a> Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).</li>
<li>Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diets+enriched+in+unsaturated+fatty+acids+enhance+early+embryonic+development+in+lactating+Holstein+cows%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows.</a> Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).</li>
<li>Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf</a> (2016).</li>
<li>Kerr, K. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17915030">Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray.</a> BMC Bioinformatics. 8, 371(2007).</li>
<li>Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wholly+defined+Agilent+microarray+spike-in+dataset%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset.</a> Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).</li>
<li>Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+and+known+oocyte-specific+genes+using+complementary+DNA+subtraction+and+microarray+analysis+in+three+different+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species.</a> Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).</li>
<li>Thomas, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER%3A+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li>
<li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PANTHER+database+of+protein+families%2C+subfamilies%2C+functions+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways.</a> Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).</li>
<li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).</li>
<li>Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+gene+transcript+abundance+in+bovine+fertilized+and+cloned+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos.</a> Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).</li>
<li>Gilbert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+gene+products+fluctuation+during+bovine+pre-hatching+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).</li>
<li>Vallee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+bovine+embryo+transcript+profiles+during+early+in+vivo+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development.</a> Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).</li>
<li>Dafforn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+mRNA+amplification+from+as+little+as+5+ng+total+RNA+for+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis.</a> Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).</li>
<li>Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaujean%2C+N+%22Studying+Bovine+Early+Embryo+Transcriptome+by+Microarray%22">Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray</a>. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).</li>
<li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+%28MAQC%29+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

7日目のウシの胚を用いてマイクロアレイ解析を行うための第一の問題は、遺伝子発現を研究するため、高品質のRNAの十分な量を取得していません。伝統的なフェノール/クロロホルムRNA抽出およびエタノール沈殿法は、低収量およびRNA増幅反応を阻害する可能性の残りのフェノールが得られ、7日目の胚にはお勧めできません。代わりに、標準的な列ベースの方法は、全RNAを単離し、その後、濃度を増加させるために、最小溶出緩衝液を用いてRNAを溶出する方がよいです。胚当たりの全RNAの780頁の平均値は、同一の方法論26、現在使用されるのと同じRNA抽出キット27、28を用いて他のレポートに匹敵する現在の研究で得られました。 RNA抽出のためには、徹底的に混合して使用する前に、沈殿物を溶解または再溶解抽出バッファーの前に抽出緩衝液バイアルを暖めることをお勧めします使用しています。また、インキュベーション時間は、抽出工程中のRNA収量のためにも重要です。 42℃で完全な30分未満のインキュベーショ...

高生産乳牛における初期胚損失は、酪農業1、2における主な課題の一つです。牛は、それらの同様の発達過程3、4に対するヒト着床前胚発生を研究するための興味深いモデルとなっています。しかしながら、多くの研究は、ウシ初期胚発生に関与する遺伝子についてのより良い理解が必要です。 1995年5に開発された最初のマイクロアレイ技術から二十年後に、より洗練されたプローブの製造技術の開発は、異なるマイクロアレイプラットフォーム6内との間に印刷エラーとアレイチップのばらつきが減少しました。改善されたマイクロアレイ技術は、初期胚Qに、臨床研究7で、より最近では、この技術の普及応用をもたらしましたualityアセスメント8。 マイクロアレイ技術のために必要な大量の材料は、マイクロアレイ技術は、最初に、このような初期胚発生などの研究分野の番号を入力することができなかった主な理由です。より最近では、RNA増幅法は、直線的にサブナノグラム出発RNA材料9からマイクログラムレベルまでRNAを増幅するために改良されてきました。市場で入手可能ないくつかの市販のRNA増幅キットがあります。しかし、より人気のよく発達したキットが11の方法を駆動リボ単一プライマー等温増幅10およびT7プロモーターに関連しています。最も人気のあるアンチセンスRNA増幅は、5 &#39;末端12にT7プロモーターに連結するオリゴdTプライマーを用いてインビトロ転写を使用します。この技術は、線形増幅F後代表アンチセンス転写物の大部分を維持することができまたはアレイハイブリダイゼーション13。この方法は、ウシの胚8から抽出した全RNAのピコグラムレベルを増幅するように適合されています。 ユニバーサルリンケージシステム（ULS）は、DNAを直接組み込むか、グアニン14のN7位の配位結合を形成することにより、白金リンク蛍光色素シアニン547またはシアニン647のいずれかでRNAを増幅した標識法です。この方法は、アミノアリルに比べて変更することなく、より安定した増幅されたaRNAを生成するために、胚の研究に適合させた酵素法15によって生成されたaRNAを変更しました。単一の色素と2つの色素の両方の標識方法は、マイクロアレイにユニバーサルリンケージシステムを使用して適応されています。大規模なマイクロアレイの比較研究は、6 1次元と2色配列のプラットフォーム間でのデータ品質の良好な相関があるということでした。 最近では、両方のT7プロモータードライブnは、アンチセンスRNA増幅およびULS標識方法は、マイクロアレイハイブリダイゼーション8、16のためのaRNA材料標識高品質の十分な量を生成するために、より信頼性の高いプロトコルを提供するために開発されてきました。そこで、本研究では、一例として、7日目ウシ胚を用いた2色マイクロアレイに関わるデータ解析にRNA抽出からの重要なステップのいくつかを実証するためのプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0505</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instruments</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>RNAスクリーンテープ</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>ULS蛍光ラベリングキット</td><td>Kreatech Diagnostics</td><td>EA-021</td><td></td></tr><tr><td>カスタム遺伝子発現マイクロアレイ</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression 洗浄バッファー 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gene Expression 洗浄バッファー2</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>2x Hi-RPMハイブリダイゼーションバッファ</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;Part #5190-0403</td><td></td></tr><tr><td>25x Fragment buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5185-5974</td><td></td></tr><tr><td>10x GE ブロッキング剤</td><td>Agilent Technologies</td><td>Part #5188-5281</td><td></td></tr><tr><td>安定化および乾燥ソリューション</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;Part #5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Agilent SureHyb techonolgy</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2524-60012</td><td>ガスケットスライド20枚入りパック、4マイクロアレイ/スライド</td></tr><tr><td>2色RNAスパイクインキット</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;Cat# 5188-5279</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000Bアレイスキャナー</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX 4000B-U</td><td></td></tr><tr><td>オゾンフリーボックス</td><td>BioTray</td><td>OFB_100x200</td><td></td></tr><tr><td>GALファイル</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

のトランスクリプトームプロファイリング生体内で産ウシ着床前の胚

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

初期の胚喪失は、牛の不妊症の大きな原因です。さらに、ウシは、それらの類似した発生過程のために、ヒトの着床前胚発生を研究するための興味深いモデルになります。遺伝的要因が初期胚発生に影響を与えることは知られていますが、そのような要因の発見は深刻な課題でした。マイクロアレイ技術により、ゲノム全体にわたる転写産物レベルの定量的測定と遺伝子発現プロファイリングが可能になります。マイクロアレイ実験を計画する際に下さなければならない主な決定事項の1つは、1色アプローチと2色アプローチのどちらを使用するかです。2色設計により、技術的な複製が増加し、ばらつきが最小限に抑えられ、感度と精度が向上するだけでなく、ループ設計が可能になり、共通の参照サンプルが定義されます。マイクロアレイは強力な生物学的ツールですが、その力を弱める可能性のある落とし穴があります。したがって、この技術論文では、RNA抽出、増幅、標識、標識された増幅RNAのアレイへのハイブリダイゼーション、アレイスキャン、および2色分析戦略を使用したデータ解析のための最適化されたプロトコルを示します。

7日目のウシ胚からの総RNAを、増幅のaRNAの代表的な結果を図3に示し、 表1に要約します。 RNAの完全性およびプロファイルは、RNA抽出後に評価することができます。 RNAの品質評価は、バイオアナライザー装置（ 図3A）によって行うことができ、7.0より高いRIN値を有するサンプルのみを増幅した（ 表1）に使用する修飾されています。 増幅されたRNAの質と量は、増幅後に評価されるべきです。増幅されたRNAプロファイルと適切なサイズ範囲の類似性は、品質管理（ 図3B）のための主要な要因です。 2ラウンドの増幅後、増幅されたR...

マイクロアレイ技術は、ゲノム全体に基づいて転写産物の定量的測定と遺伝子発現プロファイリングを可能にします。したがって、このプロトコルでは、7日目のウシ胚を使用した2色のカスタムメイドウシアレイで最適化された技術的手順を提供し、少量の全RNAを使用することの実現可能性を実証します。

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

このビデオの全体的な目標は、7日目のウシ胚から採取した総RNAを少量使用した2色のカスタムメイドウシアレイを使用して、最適化された技術手順を提供することです。この方法は、高生産性乳牛の胚喪失に関する重要な疑問や、着床前の発生中の胚の遺伝子発現に対する胚の品質に関する疑問に答えるのに役立ちます。この手法の利点は、単一胚から抽出した全RNAのピコグラムレベルを用いて遺伝子発現を研究できることです。この方法は、in vivoで作製したウシの着床前胚の生存に影響を与える要因についての洞察を得ることができます。これは、in vitro胚産生などの生殖技術の向上にも役立ちます。手順を開始するには、カラムベースのピコスケールRNA抽出キットから、マイクロ遠心チューブでスナップ凍結ウシ胚を調製します。10マイクロリットルの溶解緩衝液をチューブに加え、胚を摂氏42度で30分間インキュベートします。次に、G.Pipette 250マイクロリットルのコンディショニングバッファーを精製カラムフィルターメンブレンに800倍でチューブを2分間遠心分離し、室温で5分間カラムをインキュベートします。コレクションチューブを 16 、 000 倍の G で 1 分間遠心分離し、カラムのプレコンディショニングを終了します。溶解緩衝液と胚の混合物に10マイクロリットルの70%エタノールを加え、よく混合します。次に、混合物を精製カラムにロードします。カラムをGの100倍で2分間遠心分離し、次にGの16,000倍で30秒間遠心分離します。最初の洗浄バッファー100マイクロリットルをカラムに加え、Gの8,000倍で1分間遠心分離します。DNaseキットを使用して、5マイクロリットルのストック溶液と35マイクロリットルのバッファーを混合し、閉じたチューブを静かに反転させて混合します。次に、DNase混合物を精製カラムメンブレンにロードし、室温で15分間インキュベートします。最初の洗浄バッファーの40マイクロリットルをカラムに加え、Gの8, 000倍で15秒間遠心分離します。次に、100マイクロリットルの2番目の洗浄バッファーを追加し、1分間遠心分離します。第2の洗浄緩衝液の別の部分をカラムに加え、16, 000倍G.Transferで2分間遠心分離し、精製カラムを別の微量遠心チューブに移し、11マイクロリットルの溶出緩衝液をカラムメンブレンにロードします。カラムを室温で1分間インキュベートします。1, 000倍Gで1分間、次に16, 000倍Gでさらに1分間カラムを遠心分離し、溶出したRNAの品質と量を確認し、サンプルをマイナス80°Cで保存します。増幅キットを使用して、100ピコグラムの高品質RNAを増幅します。増幅された aRNA のサイズ範囲を蛍光ベースの定量で評価します。次に、分光光度法によりaRNAの濃度を決定します。標準キットで蛍光標識するために、増幅されたaRNAを2マイクログラム調製します。暗室にオゾンボックスを設置し、オゾンレベルが0.001ppmに減少するまで待ちます。光の上に暗室フィルターを置きます。次に、サンプルをオゾンボックスに持ち込み、シアニン5色素と標識緩衝液をそれぞれ2マイクロリットル加えます。サンプルを安全な光の下で、RNaseフリーの水を加えて、総容量を20マイクロリットルにします。サンプルを穏やかに混合し、その後、チューブをサーモサイクラーで摂氏85度で15分間インキュベートします。サンプルを氷上で1分間冷却した後、サンプルをスピンダウンします。標識および増幅されたaRNAをRNA抽出キットでクリーンアップします。適切なタイプの分光計を使用して、標識および増幅されたaRNAの濃度を決定します。シアニン3色素で標識した増幅されたaRNAの2番目のサンプルを調製します。aRNAサンプルは、マイナス80°Cで最大3日間保存します。Cy3および5標識aRNAをそれぞれ825ナノグラム組み合わせます。これにブロッキングバッファとフラグメンテーションバッファを追加します。混合物を摂氏60度で15分間インキュベートし、次に氷上で1分間冷却します。55マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを加え、気泡を導入せずによく混合します。混合物をGの11,300倍で1分間遠心分離します。100マイクロリットルのサンプルをアレイスライドにロードし、スライドをハイブリダイゼーションチャンバーに密封します。サンプルを摂氏65度で17時間ハイブリダイズし、毎分10回転で回転させます。オゾン捕捉安定化および乾燥溶液を準備します。オゾンへの曝露を最小限に抑えるための予防策を講じてアレイを洗浄し、安定化および乾燥溶液に30秒間浸します。アレイの表面が乾燥していて、ほこりがないことを確認してください。アレイは暗い場所に保管します。マイクロアレイスキャナーの電源を入れ、スキャンする準備ができるまで待ちます。次に、左側にバーコードをロードします。スポット分析を実行し、データをGPRファイルとして保存します。統計解析ソフトウェアで、データを正規化して分析します。正のスポット選択閾値を計算し、ハイブリダイズ信号とバックグラウンド信号のプロットを表示します。配列内で黄土の正規化を実行し、次に配列間の分位数正規化を実行します。正規化されたデータをスプレッドシート ファイルにエクスポートします。マイクロアレイデータリポジトリ内のすべての正のシグナルを使用して、選択した一意の遺伝子のIDリストを作成します。ID リストをタンパク質分類および分析データベースにアップロードし、生物として bos taurus を選択し、デフォルトの統計的過剰表現テストを実行します。2ラウンド増幅後、フラグメントのサイズは非常に類似しており、品質も良好です。この方法による増幅が成功すると、aRNAは少なくとも1000倍増加するはずです。高品質のマイクロアレイ画像は、両方のチャンネルで高いスポット強度と低いバックグラウンド強度を備えています。バックグラウンドの強度が高すぎると、信号の解像度が低下します。スポットの約46%はバックグラウンドの上にあり、そこから胚盤胞で発現する6, 765のユニークなRNA転写産物が単離されました。統計的な過剰表現テストにより、上位10の遺伝子オントロジー用語が活発な細胞分裂プロセスを表していることが示されました。この技術の開発により、動物生殖の分野の研究者は、胚の遺伝子発現を調査し、さまざまな要因が発生中の胚にどのように影響するかを評価することができました。この技術は、ブタなどの他の重要な種でも開発されています。この手順に続いて、定量PCRなどの他の方法を使用してマイクロアレイの結果を検証することができます。このビデオを見れば、胚からRNAを抽出する方法や、RNAを増幅して標識し、2色マイクロアレイ解析を行う方法についてよく理解できるはずです。

transcriptome-profiling-vivo-produced-bovine-pre-implantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

私たちは、Branchiostomaのlanceolatumの未受精卵母細胞へのmRNA注入後、ここで蛍光タンパク質の堅牢かつ効率的な発現を報告している。この基底脊索動物におけるマイクロインジェクション技術の開発は、in vivoイメージングと遺伝子特異的な操作に含めて、この新たなモデル系で遠大な技術革新のための道を開く。...

蛍光タンパク質の発現において Branchiostoma lanceolatum未受精卵へのmRNA注入による

このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。...

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

明確な遺伝的背景における個々のWT網膜前駆細胞のライブトラッキングは、神経発生時の細胞非自律的なシグナル伝達の寄与を評価することができます。ここでは、胚移植を介して、およびin vivoタイムラプス共焦点イメージングにおける遺伝子ノックダウン、キメラ世代の組み合わせは、この目的のために利用しました。...

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

光シートベースの蛍光顕微鏡による昆虫の胚の形態形成を撮像する技術の状態となっています。このプロトコルは、輪郭とモドキTribolium castaneumの胚に適した3つの取り付け技術を比較し、ライブイメージングに適して2つの新規のカスタムメイドのトランスジェニック系統を導入し、本質的な品質管理を説明し、現在の実験の限界を示しています。...

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

ウズラ胚モデル系における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現を可能にする方法として、メッセンジャーRNA(mRNA)エレクトロポレーションを報告する。この方法は、蛍光的に細胞を標識し、エレクトロポレーション直後のタイムラプス顕微鏡検査によって生体内の動きを記録するために使用することができる。...

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

ここでは、マウス胚組織における遺伝子発現をプロファイルする多重化単一細胞mRNAシーケンシング法を提示した。多重化戦略と組み合わせた液滴ベースの単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)法は、複数のサンプルから単一細胞を同時にプロファイルできるため、試薬コストを大幅に削減し、実験的なバッチ効果を最小限に抑えることができます。...

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。...

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

このプロトコルは、 インビトロ...

単一の卵母細胞レポーターアッセイを用いたインビトロ成熟時の母体母体翻訳プログラムの定義

この論文は、原腸陥入マウス胚の単一細胞および核のシーケンシングのための高品質の単一細胞および核懸濁液のパイプラインを確立します。...

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

学ぶ産ウシ着床前胚のトランスクリプトームプロファイリング法。微量RNAから遺伝子発現を解析し、胚の品質と生存に影響する要因を明らかにする。乳牛の繁殖技術向上に貢献する。

のトランスクリプトームプロファイリング生体内で産ウシ着床前の胚

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