Name: 단일 프로브의 응용 프로그램 : 주변 조건에서 질량 분석 이미징 및 단일 세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: 학습하세요 Single-probe를 활용한 주변 조건 질량 분석 이미징 및 단일 세포 분석 기법을 통해 생물학 및 제약 연구에서 고해상도 분자 분포를 탐색하는 방법을 배우세요.

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저자는 전동 무대 제어 소프트웨어와 MSI 시각화 프로그램을 공유해 주신 Dr. Laskin(Pacific Northwest National Laboratory)에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 마우스 장기 샘플을 제공해 주신 Mao 박사(오클라호마 대학교)와 기계 가공 및 전자 작업에 도움을 주신 Chad E. Cunningham(오클라호마 대학교)에게도 감사드립니다. 이 연구는 오클라호마 대학교 노먼 캠퍼스 연구 위원회, 미국 질량 분석 학회 연구상(Waters Corporation 후원), 오클라호마 과학 기술 진흥 센터(보조금 HR 14-152) 및 미국 국립보건원(R01GM116116)의 보조금으로 지원되었습니다.

동물 사용과 복지는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 검토 및 승인 프로토콜 다음과 같은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드를 준수해야합니다. 마우스 조직 샘플은 협력자 박사 Chuanbin 마오에 의해 제공되었다. 1. 마우스 조직 섹션 준비 <ol><li> 물론 작은 플라스틱의 중심으로 관심 (뇌, 신장, 간 등)의 전체 마우스 기관 (예를 들면, 12 웰 세포 배양 플레이트)을 놓고 약 10mm 높이로 화합물을 포함 티슈 잠수함. 조직 포함 화합물과 기관이 원하는 방향 (즉, 시상면, 관상 등)에 배치되어 형성에는 거품이없는 것을 확인합니다. </li><li> 즉시 플래시 냉동 액체 질소에 조직을 배치합니다. 장기간 저장을 위해, -80 ° C에 냉동 동결 샘플을 저장한다. </li><li> 냉동 마우스 기관을하고 temperatu에 C ° -15에 해동제어 cryomicrotome을 다시. </li><li> 조직 포함 화합물의 약 500 μL와 함께 강 기재 상에 보안 조직이 원하는 단면 처리 방향이 칼에 제공되도록 장착 절편 cryomicrotome에 배치합니다. </li><li> 제 12 μm의 두께로 조직. 폴리 카보네이트 현미경 슬라이드 상에 단면 조직 조각을 놓고, 실온에서 30 분 동안 건조 떠난다. 장기간 저장을 위해, -80 ° C에 냉동 냉장고 슬라이드를 저장한다. </li></ol> 2. 세포 배양 참고 : 세포 배양은 무균 조건에서 생물 안전 캐비닛 (바이오 안전성 레벨 II)에서 수행 하였다. 된 HeLa 세포주 모델 시스템으로 사용하여, 세포를 다음과 같은 통상의 프로토콜 완전 배지에서 배양 하였다 : <ol><li> 따뜻한 시약 (즉, 트립신, 인산염 완충 식염수 (PBS), 및 세포 배양 배지), 37 ℃이다. 주 : 세포 배양 배지는 무기 SA를 포함LTS, 아미노산, 비타민 등을들 수있다. 구성 요소의 전체 목록은 제조업체의 제제를 참조하십시오. </li><li> 세포 샘플 (예를 들어, 1 ml의 헬라 세포 현탁액)을 수득하고, 10 cm의 표준 세포 배양 접시에 완전한 세포 배지 9 ㎖ 중에 추가. 초기 세포 수는 약 0.5 × 106 세포 / ml이다. 성장면이 세포 배양 접시에 70~80%에 피복 될 때까지 2-3 일 동안은 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양 세포를 유지한다. 각각의 연속 라운드 녹음 세포 통로 번호. </li><li> 세포 배양 접시에 세포 계대 (즉, 세포 분열)을 수행한다. <ol><li> 대기음 성장 배지와 세포를 씻어 1X PBS 5 mL를 사용한다. 멸균 흡인 팁을 사용하여 PBS를 제거하고 배양 접시에서 세포를 분리하기 위해 37 ℃에서 ~ 5 분 동안 트립신 (0.25 %) 2.5 ㎖로 세포를 배양한다. 참고 : 실제 트립신 처리 시간이 특정 트립신의 produ에 따라 최적화 될 필요CT는 제조 업체에서 구입. 과도한 처리 세포 사멸에 이르게 부적절한 반면, 처리 시간은, 상기 플레이트에 부착 된 세포를 남긴다. </li><li> 7.5 ml의 전체 세포 배양 배지를 첨가함으로써 트립신 활성을 중지하고 균일 한 셀 (총 부피 10 ml)에 재현 탁. SCMS 샘플 (단계 2.4)의 문화 (단계 2.2) 또는 제조를위한 세포 현탁액을 사용합니다. </li></ol></li><li> SCMS 실험에 대한 세포 샘플을 준비합니다. <ol><li> 12 웰 플레이트의 개별 마이크로 커버 슬라이드를 위치시키고 1.8 ml의 세포 배양 배지를 추가 웰에 세포 현탁액 0.2 ml를. </li><li> 부드럽게 판의 온화한 교반 세포를 혼합하고, 24 시간 ~ 37 ° C에서 5 % CO 2 환경에서 배양한다. 배양 된 세포를 약물 치료를 수행하기 위해, 12 웰 세포 배양 플레이트에 (DMSO에서 예 (디메틸 술폭 시드)) 약제 화합물 용액을 추가한다. 주 : 최종 약물 농도 (예를 들면, 10 nM 내지 100 nM 내지 1 μM, 10 μM) 및 treatment 시간 (예를 들어, 4 시간)이 연구의 구체적인 목적에 따라 변화된다. 세포는 마이크로 커버 슬라이드에 부착하고 CSMS 실험 (6 단계)에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li></ol> 3. 단일 프로브 제조 <ol><li> 레이저 마이크로 피펫 풀러에 듀얼 보어 석영 관 (내경 (ID) 127 μm의, 외경 (OD) 500 μm의)를 놓고 듀얼 보어 석영 바늘을 빼냅니다. (모든 단위는 제조 업체의 단위) 열 = 400, 필 = 3, VEL = 80, 델 = 150, 및 PUL = 250 : 시작 지점으로 다음과 같은 매개 변수를 사용합니다. 인출 된 듀얼 보어 석영 바늘을 확인하여 최적의 프로브 속성에 대한 테이퍼 팁이있다. ~ 다른 쪽 끝에서 왼쪽으로 한 unpulled 듀얼 보어 수정 모세관 5 mm 길이가되도록 뽑아 끝을 잘라. 주 : 레이저 풀러의 실제 파라미터는 장비의 특정 조건에 따라 최적화되어야한다. </li><li> 용융 실리카 모세관의 ~ 80mm 부분을 잘라 (ID 40 μm의, OD. 용매로 105 μm의)는 모세관을 제공하고 듀얼 보어 석영 바늘의 평평한 끝 부분에 하나의 구멍에 삽입합니다. </li><li> 용융 실리카 모세관 (ID 40 μm의, OD 105 μm의)의 ~ 40mm 부분을 잘라 중간 지점에서 폴리이 미드 코팅 ~ 5mm 면도 면도칼을 사용합니다. 빨리 가열 벌금 테이퍼와 나노 전기 분무 이온화 (ESI) 터에 융합 모세관을 끌어 프로판 불꽃을 사용합니다. 나노 ESI 이미 터 (~ 7-10mm 길이)를 잘라하고, 듀얼 보어 석영 바늘의 평평한 끝에서 다른 구멍에 삽입합니다. 다르게는, 미세 테이퍼를 생성하기 위해 레이저 풀러를 사용한다. </li><li> 듀얼 보어 석영 바늘의 평평한 단부에 (~ 1-2 μL) UV 경화성 수지의 최소량을 적용하고 모세관 나노을 용매 확보 ~ 20 초 발광 다이오드 UV 램프를 이용하여 제공하여 수지를 응고 ESI 터. 단일 프로브에 개별 부품을 조립하는 과정은도 1a에 도시된다. </li><li> 표준 현미경 GL 컷엉덩이 슬라이드 길게 반으로 (1 &quot;× 3&quot;). 나노 ESI 터 외측으로 지적 될 수 있도록 유리 슬라이드의 일단에 단일 프로브를 배치했다. 는 유리 슬라이드 (도 1b)에 고정되도록 하나의 프로브 본체에 정규 에폭시를 적용한다. 강화를 위해 하룻밤 둡니다. 몇도 1D에 도시 된 바와 같이 질량 분광계에 부착되어 일체형의 단일 프로브 설정 (도 1C)와 조립 단일 프로브. </li></ol> 4. 통합 된 단일 프로브 MS 설치 프로그램을 빌드 <ol><li> 질량 분석 장치의 이온 소스 인터페이스 플랜지 수정 디지털 입체경의 (조정 위치 및 높이)와 스탠드 제조 (도 1E 및 1F). <ol><li> 알루미늄 광학 판의 부착을 허용 개의 구멍 이온 소스 인터페이스 플랜지 드릴. 슬라이드 레일 장치와 높이 조절로드를 확인 (붙어디지털 입체경 시스템 알루미늄 광 기판 (도 1E에 부착 될 수 있도록, 미세한 위치 조정을위한 XY 스테이지)). </li></ol></li><li> 수정 된 디지털 스테레오 현미경하는 USB 디지털 현미경, 플렉시블 클램프 홀더 소형 수동 XYZ 변환 단계 질량 분석의 정의 이온 소스 인터페이스 플랜지에 장착 된 알루미늄 광 보드에 동력 XYZ 변환 스테이지 시스템을 첨부 (도 1C 및 1 층). 단일 프로브에 부착 된 유리 슬라이드를 해결하기 위해 유연한 클램프 홀더를 사용합니다. </li><li> 질량 분석기 (그림 1 층)에 단일 프로브 설정을 연결합니다. 질량 분석 장치의 유입구 앞의 단일 프로브의 에미 터를 배치하는가요 클램프 홀더 소형 XYZ 스테이지를 조절. 단일 페이지의 확대 된 이미지를 제공하기 위해 단일 ​​프로브 측 (조절 시야각)가 USB 디지털 현미경을 사용하여단일 프로브 위의 가운 팁 또는 나노 ESI 이미 터 및 (높이 조절)와 디지털 입체경은 세포와 프로브 팁을 볼 수 있습니다. 주 : 해당 이온 소스 플랜지를 사용하여,이 통합 단일 프로브 시스템은 주변 이온화 소스를 갖춘 질량 분석기의 다른 유형에 결합 할 수있다. </li></ol> 5. 주위 MSI <ol><li> 상온에서 샘플 섹션을 해동과 단일 프로브 아래에있는 모터 XYZ 번역 단계 시스템에 배치합니다. 제어 소프트웨어의 좌표를 변경하여 시료 위치를 조정한다. </li><li> 주사기를 사용하여 적당한 레이트 (예를 들면, 0.2 μL / 분)로 샘플링 용매 펌프 및 이온화 전압 (예를 들어, 5 kV의)를 적용한다. 샘플링 용매의 선택은가요 성이고, 일반적인 것는 메탄올을 포함한다 : 물 (9 : 1), 아세토 니트릴. 나노 ESI 터의 불감 부피 3 NL 및 프로브 표면 처 사이의 시간 ~ 것으로 추정가전 ​​접촉 및 이온 신호 관찰은 보통보다 1 초 15이다. 주 : 맞춤 이온 소스 인터페이스 플랜지 이온화 전압 악어 클립을 통해 도전성 조합하여 질량 분석기로 전달 될 수있다. 이온화 전압은 모세관과 단일 프로브 채널 내부의 용매에 도전성 조합을 통해 전송하고, 샘플 분석 물을 이온화 나노 ESI 에미 터에인가된다. 도전 조합과 악어 클립을 연결할 때 이온화 전압의 전원이 꺼져 있는지 확인합니다. </li><li> 단지 샘플의 표면 위에서 쉬고 대사면 추출을 수행 할 수 있도록 하나의 프로브의 높이를 조정한다. 조심 Z 스테이지를 해제 한 후, 단일 프로브 팁과 조직 표면 사이의 거리 변화를 모니터링 (단일 프로브의 측면) USB 디지털 현미경을 사용한다. 이 높이 조정시 질량 스펙트럼의 변화를 모니터링하고 리프트를 중지조직 대사에 용매 배경의 이온 신호의 변화가 관찰 될 때 Z 스테이지를 보내고. </li><li> 반복 단계 5.3 세번 자동 표면 평탄화 조정 스테이지 제어 프로그램 내에 세 가지 점을 설정한다. 서로 떨어져 약 10 mm의 거리에서 시료 표면에 세 지점에서, 단일 프로브 팁을 놓는다. 위쪽을 눌러 및 아이콘 아래로 높이 조절을 수행하고, &quot;계획 방법&quot;의 위치로 승점 3 점을 잠급니다. </li><li> 이 프로그램을 사용하여 샘​​플 내에서 관심있는 부분을 가로 질러 래스터에 대한 다른 매개 변수를 설정합니다. 여기에 제시된 마우스 신장 섹션를 들어, 10.0 μm의 / 초 래스터 화 속도와 라인 사이에 20 μm의 거리를 사용합니다. 전동 스테이지 시스템은 0.1 μm의 최소 증분의 움직임을 갖는다. 단일 프로브 팁 및 조직 사이의 간격은 단계 5.3에서 얻어진다. </li><li> 질량 분석의 MS 스펙트럼의 자동 취득하는 방법을 설정한다. FO마우스 신장 샘플에 대한 연구 높은 질량 분해능 MSI는 다음 매개 변수를 사용하여 질량 분해능 60,000 (m / ΔM을) ~ 5 kV의 긍정적 인 모드, 1 Microscan은 150 밀리 초 최대 주입 시간, AGC합니다. MS는 이미지의 개별 라인을 나타내는 모든 취득한 MS 스펙트럼은 생성 된 이미지의 픽셀 크기가 균일하게 분포되어 있음을 나타내는 각 주사 사이에 일정한 시간 간격을두고 스캔 동일한 수 있었다. </li><li> 의 MSI 데이터 수집을 시작합니다. 질량 분석에 대한 MS 획득 시퀀스를 시작하고 XYZ 제어 프로그램의 래스터 화 시퀀스를 시작합니다. <ol><li> 예를 들어, 여기에 사용되는 MS 데이터 수집 프로그램에서, &quot;새 순서&quot;를 선택, &quot;순서 설정&quot;으로 이동 X가 사용되는 라인의 수는 X, 01의 숫자가 새로운 시퀀스 파일 세트를 생성 원하는 MS의 이미지를 촬영 한 다음 &quot;실행 순서&quot;를 누르면된다. </li><li> 소프트웨어가 접점을 생성 할 수 있도록하는 제 전자 장치를 사용하여질량 분석 용 CT 고정 신호는, 데이터를 수집한다. 회로도를 참고로 보충도 (도 S1)에 도시된다. </li></ol></li><li> 적절한 MSI 시각화 소프트웨어를 사용하여 원시 MS 파일에서 MS의 이미지를 구축합니다. PNNL 17 Laskin의 그룹에 의해 개발 된 소프트웨어 패키지를 사용하는 경우 예를 들어, 다음 단계를 수행한다. <ol><li> &quot;눈 썹 파일 &#39;을 클릭합니다. MSI는 실험에서 얻은 첫 번째 파일을 선택합니다. 지정 위치에서 파일이 시작되고 완료 &quot;라인의 수입니다.&quot; &quot;입력 MZ 범위&quot;에서 MS의 이미지 범위 m / z 값의 범위를 선택합니다. </li><li> 이미지 생성 프로세스를 시작하려면 &quot;시작&quot;버튼을 누릅니다. MS는 이미지가 이루어지면, 컴퓨터에 이미지를 저장하기 위해 &quot;도구 모음&quot;에서 &quot;이미지 저장&quot;을 클릭합니다. </li></ol></li></ol> 에서 현장 6. 라이브 SCMS <ol><li> 설치 지시한다 따라 단일 프로브 시스템MSI에 대한 이온. 유속 용매 (예, 메탄올 / H 2 O 또는 아세토 니트릴)를 조정 (예를 들어, ~ 25 NL / 분). </li><li> 문화 미디어 외 약제 성분을 제거하기 위해 PBS에 마이크로 커버 유리 슬라이드에 부착 된 배양 세포를 세척 하였다. 실험을위한 동력 XYZ 번역 단계 시스템에 유리 슬라이드를 포함하는 세포를 놓습니다. 대안 적으로, 배양 된 세포를 씻어 (소 태아 혈청을 함유하지 않고) 새로운 세포 배양 배지를 사용하여 참고. 적은 이온 억제가 관찰되었다. 또한, 셀은 주위 온도 (~ 20 ° C)의 배양 온도 (37 ℃)보다 현저히 낮은 실험 기간 동안 긴 시간 동안 생존 할 수있다. 약물의 종류, 용액의 농도 및 처리 시간은 다른 연구에서 변화한다. </li><li> 분석하는 동안 세포 침투를 모니터링하는 단일 프로브의 팁 상 (시료 위) 디지털 스테레오 현미경 초점. 의 S에 USB 디지털 현미경 (사용단일 프로브 IDE)은 단일 프로브 나노 ESI 방출기의 작동 상태를 모니터링한다. </li><li> 관심 셀을 찾기 위해 전동 XYZ 스테이지 제어 프로그램 (전술 한 세포) 디지털 스테레오 현미경을 사용하여 정밀 샘플 상기 단일 프로브 팁의 위치. 단일 프로브 팁은 ​​세포 내로 삽입하기 전에 MS 데이터 수집을 시작한다. <ol><li> 질량 분해능 100,000 (m / ΔM) ~ 3 kV의 양 및 음의 모드 1 Microscan은 150 밀리 최대 분사 시간에 AGC 모드 : MS 분석을위한 참조 고분해능 질량 분석기를 사용하는 것과 다음 매개 변수를 사용한다. MS 스펙트럼의 자동 취득은 MS 데이터 수집 프로그램에서 &quot;시작&quot;을 클릭하면됩니다. </li><li> 세포막을 통과하여 세포에서 생성 된 MS 신호를 기록 유지하는 아이콘을 클릭하여 전동식 Z 스테이지 리프트. 1-2 초의 시간 지연은 일반적으로 프로브를 삽입하고, MS 신호 검출부 사이에 관찰된다. 다른 확인으로세포 침투의 MS 신호의 급격한 변화는 세포막의 침투에 관찰 될 수있다. 세포 내 화합물의 MS 신호는 일반적으로 이전에 15 ~ 20 초 크게 감소 ~ 지속될 수 있습니다. </li><li> 셀에서 단일 프로브 팁을 끌어 플레이트를 포함하는 셀 아래로 내립니다. 이는 일반적으로 노이즈 레벨에 접근하는 셀룰러 화합물의 이온 신호를 &lt;15 초 걸린다. ~ 3 분 완전히 단일 프로브를 세척하는 용매 흐름을 보자. 한편, 분석 될 다음 셀을 찾을 전동 XYZ 스테이지 시스템의 위치. 각 셀의 실험은 2 ~ 3 분 달성 될해야합니다. </li></ol></li></ol>

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<li>Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Ambient+MS+Imaging+of+Negative+Ions+in+Positive+Ion+Mode%3A+Using+Dicationic+Reagents+with+the+Single-Probe%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 27 (1), 124-134 (2016).</li>
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</ol>

우리는 여기에 제시된 작업과 선언할 이해 상충이 없습니다.

단일 프로브 모두 MSI 및 SCMS 실험에 사용할 수있는 다기능 장치이다. (변환 스테이지 시스템, 현미경, 이온 소스 인터페이스 플랜지 등)를 단일 프로브 설정 유연 기존 질량 분석계에 적용 할 수있는 부가 구성 요소로 설계된다. 단일 프로브 설정 종래 ESI 이온 소스 사이의 신속한 교환이 1 분 이내에 달성 될 수있다. 원칙적으로, 적절한 이온 소스 인터페이스 플랜지를 사용하여 단일 프로브 설정은 다른 질량 분광기에 적용 할 수있다. 또한, 다양한 시약을 포함하는 샘플 용매 크게 생체의 넓은 범위의 검출을 향상 반응성 MSI 및 SCMS 실험 단일 프로브 설정으로 사용될 수있다. 동물 조직 및 세포주뿐만 아니라, 단일 프로브는 또한 식물과 같은 다른 생물학적 시스템을 분석 할 수있다. 따라서 동일한 실험 장치와유사한 사용자 교육은 다양한 연구가 하나의 기기를 사용하여 수행 될 수 있고, 동일한 사용자가 최소 트레이닝 시간 및 장비 비용이 달성 될 효과적인 다목적 실험 수. 단일 프로브 MS 기술의 핵심 요소는 프로브 자체이다. 단일 프로브의 품질은 크게 두 MSI 및 SCMS 실험의 품질을 결정 성능에 상당한 영향을 미친다. 단일 프로브를 제조 할 때, 듀얼 보어 튜브의 내부의 모세 혈관이 안전하게 실험 중 용매 누출의 가능성을 제거하기 위해 접착되어 있는지 확인합니다. 오리피스가 모세관 프로브 제조 동안에 폐색되지 않도록 UV 경화성 에폭시 최소량을 사용하는 것이 중요하다. 단일 프로브를 생물학적 시료 (15) 상에 높은 공간 분해능 및 질량 주위 MSI를 수행하는 데 사용되었다. 주변 MSI의 가장 큰 장점 이상비 주변 방법 시료 제제 샘플 가까운 고유 상태 (8)에서 분석 될 수있는 진공 샘플링 환경에 대한 필요성과 함께 최소로 유지된다는 것이다. 대부분의 다른 주변 MSI 기술의 주요 장애물 중 하나는 공간 해상도 1의 부족이었다. 기초 탈착과 비교 MSI, 단일 프로브의 작은 팁 크기는 더욱 강력하고 효율적인 표면 액체 미세 추출의 높은 공간 해상도로 이어지는 작은 영역에 걸쳐 수행 될 수 있도록 (예 DESI 및 LAESI 등) 기법 주변 MSI 기술 (15)를 사용하여 달성 가장 높은 사람 사이에 8.5 μm의. 또한, 샘플링 용매의 성분을 조정하는 실험을 실시 추가적인 유연성을 제공한다. 예를 들어, 시약 (예 dicationic 화합물)을 함유하는 용매를 샘플링 대사 식별 PE의 개수의 상당한 증가를 허용 MSI 반응성 실험을 수행하는데 사용되어왔다연구 실험 20. 단일 프로브의 다른 장점은 전체 데이터 수집 프로세스 동안 동작의 용이성을 제공하는 통합 설계된다. 팁과 조직 표면 사이의 거리가 이온 신호 강도 및 안정성 평면 조직 절편을 구하고 상기 거리의 분산을 최소화하도록 조정 평탄화 표면 전도에 매우 민감하기 때문에 고품질 MSI 실험하기위한 키이다. 단일 프로브 MSI 기술 요철 표면의 높은 공간 MS 이미지를 획득하기에 적합하지 것을 따른다. 고품질의 프로브를 제조하는 것 외에도, 조심기구를 조정하는 것은 성공적인 MSI 실험을 위해 필수적이다. 모든 동조 단계 중에서, 조직 절편 표면 위의 단일 프로브 팁의 높이를 조정하는 것이 가장 중요한 일이다. 프로브의 높이를 조정할 때는, 샘플링 펌프 및 용매만을 용매 배경 이온 신호 observ 될 수 있도록 이온화 전압 켜에디션. 신중 조직 절편에서 강하고 안정된 이온 신호를 관찰 할 수있을 때까지 전동식 Z 단계 올려서 프로브 표면 거리를 감소시키면서 질량 스펙트럼의 변화를 모니터링; 이 프로브의 높이가 실험 기간 동안 MSI 데이터 수집을 위해 사용될 것이다. 또한, 최적화 된 용매 유량은 MSI 실험을 위해 필수적이다. 최적의 탐침 높이의 유량을 조정한다. 조직 표면에 용제 확산이 없도록 (즉, 유속이 너무 높은 경우) 또는 나노 ESI 터 (즉, 속도가 너무 낮은 흐름) 내부에 기포 형성. 단일 프로브는 bioanalysis을위한 다기능 장치입니다. MSI는 실험을 또한, SCMS 다른 진공에 비해 큰 장점이다 라이브 진핵 세포 (16)으로부터 상세한 화학적 정보를 밝히기 원위치 거의 실시간으로 수행 할 수있는 이러한 MALDI 10 SIMS 등 기초 SCMS 기술 ( (21) </SUP&gt;). 프로브 팁의 작은 크기는 능력 라이브 진핵 세포에 삽입하고 추출 즉각적인 MS 분석을위한 세포를 이온화하는 화합물을 제공한다. 유사하게, 시약 (예 dicationic 화합물)를 포함하는 샘플링 용매는 SCMS 실험에 사용될 수 있으며, 세포 성분의 넓은 범위가 전보다 라이브 단일 셀에서 검출 될 수있다 (진행중인 연구의 데이터는 도시되지 않음). 실시간 분석에 의한 세포막 및 세포 내용물의 추출의 세포 침투 라이브 단일 세포 화학적 정보를 제공하지만, 조사중인 셀은 단일 프로브 SCMS 기술은 여전히​​ 암시 실험 후에 사망한다 파괴적인 방법. 또한, 단일 프로브 탐침 나노 ESI 에미 쉽게 경험이없는 사용자 막히게 할 수있다. 장치의 막힘의 가능성을 줄이기 위해, CEL에 단일 프로브 팁을 삽입 할 때 핵에 손이 닿지 않도록 보장엘. 막힘이 발생하면, 장치가 막힌 프로브 팁 및 자작 또는 가열 코일 (16)을 사용하여 방출기 나노 ESI를 가열함으로써 재생 될 수있다. 단일 프로브 SCMS 기술의 다른 제한 사항은 접착 세포 (즉, 세포 표면에 부착 된) 현재 설정을 사용하여 분석 할 수 있다는 것이다. 그러나, 단일 프로브 MS 장치로 세포 조작 시스템을 도입함으로써, 전지의 광범위한 종류 향후 연구 될 수있다. 고품질 프로브 최적화 용매 유량을 얻는다 MSI 실험 마찬가지로 SCMS 연구에 중요하다. 용매 유량을 조정하는 경우, 단일 프로브 팁은 (즉, 세포 또는 배양 배지와 접촉없이) 샘플 위에 배치하고, 나노 ESI 내부 프로브 팁 또는 기포 형성로부터 용매 떨어지는이 없도록한다 이미 터.

질량 분석 이미징(MSI)은 표면에서 관심 화합물의 공간 분포를 제공하는 비교적 새로운 분자 이미징 기술입니다. MSI 분석 중에 질량 분석법(MS) 측정은 관심 종 1의 2D 이미지를 생성하기 위해 개별 픽셀 기준으로 표면 전체에 기록됩니다. MSI 기술은 광범위한 대사 산물에 대해 공간적으로 분해된 특징 분포를 제공할 수 있는 능력을 가지고 있어 기존의 분자 이미징 기술을 사용하는 것보다 샘플에서 훨씬 더 많은 양의 정보를 얻을 수 있으며, 생물학 및 약리학 연구를 위한 생물학적 샘플 분석을 크게 개선할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다 2. MSI는 비앰비언트 접근 방식과 앰비언트 접근 방식으로 크게 구분할 수 있습니다. MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) MS 3 및 ToF SIMS(Time of Flight Secondary Ion MS) 4와 같은 비상온 MSI 분석 기술은 높은 공간 해상도(각각 약 5μm 및 100nm)와 높은 감도를 제공할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 매트릭스 분자를 샘플 표면에 적용하는 것과 같은 광범위한 샘플 준비와 진공 샘플링 환경이 필요하며, 이로 인해 얻은 데이터에 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 탈착 전기 분무 이온화(DESI) MS 5, 레이저 절제 전기 분무 이온화(LAESI) MS 6 및 나노 DESI MS 7과 같은 주변 기술은 주변 환경에서 사전 준비가 거의 또는 전혀 없이 샘플의 MSI를 생성할 수 있으며, 이는 잠재적으로 샘플을 가장 기본 상태로 반영할 수 있는 MS 이미지를 생성할 수 있습니다. 그러나 이러한 기술의 대부분은 일반적으로 비주변 기술에 비해 높은 공간 해상도와 감지 감도가 부족하며, 실험은 일반적으로 픽셀당 약 150μm에서 수행됩니다8.
단일 세포 분석(SCA)은 세포 수준에서 생물학적 샘플의 화학적 조성을 특성화할 수 있는 능력을 갖춘 성장 분야입니다. SCA는 세포 집단의 평균 결과를 생성하는 기존 세포 분석 기술보다 더 근본적인 수준에서 생물학적 시스템을 분석할 수 있도록 하여 이전에는 다루기 어려웠던 통찰력을 잠재적으로 제공할 수 있습니다 9. MS 기술은 최근 분석 전에 세포를 전처리하는 MALDI MS 10 및 ToF SIMS 11과 같은 비상온 기술과 LAESI MS 12와 같은 상온 기술 및 라이브 단일 세포 비디오-MS 13, 14와 같은 직접 추출 방법을 사용하여 SCA(단일 세포 질량 분석 또는 SCMS라고 함)에 적용되었습니다, 난자, 식물 및 암과 같은 다양한 세포 유형을 분석합니다. 주변 기술은 살아있는 세포에 적용할 수 있는 장점이 있으며, 이는 다시 인공물을 최소화하여 살아있는 세포의 대사 산물을 더 잘 표현할 수 있습니다. 그러나 위에서 설명한 직접 추출 기반 방법은 두 가지 다른 단계에서 샘플 추출 및 분석 프로세스를 수행하며, 이로 인해 분석 중에 샘플 내에 존재하는 대사 산물을 잠재적으로 변경할 수 있는 시간 간격이 발생합니다. 
단일 프로브는 생체 조직 절편 15에서 높은 공간 해상도의 주변 MSI를 수행하고 살아있는 단일 세포 16에서 거의 실시간 현장 SCMS를 수행할 수 있는 소형 다기능 장치입니다. 단일 프로브는 융합 실리카 모세관으로 만든 나노 ESI 이미터 및 주입구를 제공하는 용매와 결합된 인발형 이중 보어 석영 모세관으로 구성된 통합 구조를 가지고 있어 단일 장치에서 용매 전달 및 분석물 추출을 수행할 수 있습니다. 앰비언트 MSI 모드에서는 단일 프로브가 샘플 조직 위에 배치되고 표면 미세 추출이 발생하여 높은 공간 해상도로 래스터된 MS 이미지를 만들 수 있습니다. 특히, 단일 프로브의 테이퍼 팁은 현장 SCMS 분석을 위해 살아있는 진핵 세포에 삽입할 수 있을 만큼 충분히 작으며, 프로브 삽입과 MS 검출 사이에 대사 산물 검출이 2초 미만이 소요되어 화학 정보를 거의 실시간으로 수집할 수 있습니다. 다음은 단일 프로브 장치를 제작하고 단일 프로브 MS 기술을 사용하여 주변 MSI 및 SCMS 모드를 모두 수행하는 프로토콜입니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">단일 프로브 제작</td></tr><tr><td>이중 보어 석영 튜브, 1.120' &rsquo; &시간; 0.005인치 &시간; 12인치</td><td>프리드리히 & Dimmock, Inc, 뉴저지주 밀빌&nbsp;</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 레이저 풀러&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co., Novato, CA&nbsp;</td><td>모델 P-2000</td><td></td></tr><tr><td>용융 실리카 모세관, ID: 40&nbsp; &마이크로; m, OD: 110&nbsp; &마이크로; m</td><td>Molex, Lisle, IL</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>UV 경화 수지&nbsp;</td><td>Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA</td><td>품목 번호 006.030</td><td></td></tr><tr><td>LED UV 램프</td><td>Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China</td><td>LY-C240</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 수지</td><td>Devcon, Danvers, MA&nbsp;</td><td>부품 번호 20945</td><td></td></tr><tr><td>인라인 마이크로 필터&nbsp;</td><td>IDEX 건강 및 Science LLC, 레이크 포레스트, 일리노이</td><td>M-520</td><td></td></tr><tr><td>Microunion&nbsp;</td><td>IDEX 건강 및 Science LLC, Lake Forest, IL</td><td>M-539</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드(유리)</td><td>C & 과학 - 프리미어, 매너서스, 버지니아&nbsp;</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>주사기&nbsp;</td><td>Hamilton, Reno, NV</td><td>1725LTN 250UL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mass spectrometer</td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap 질량 sprectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&nbsp;</td><td>LTQ Orbitrap XL</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 2.1 소프트웨어</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&nbsp;</td><td></td><td></td>XCALIBUR21</tr><tr><td>Fance Stage Control</td><td>Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSI QuickView</td><td>Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Contact closure device</td></tr><tr><td>USB-6009 다기능 DAQ</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>779026-01</td><td></td></tr><tr><td>DR-5V SDS 릴레이</td><td>파나소닉, 일본 카도마&nbsp;</td><td>DR-SDS-5</td><td></td></tr><tr><td>로직 게이트 50 옴 라인 드라이버</td><td>텍사스 인스트루먼트, 달라스, 텍사스&nbsp;</td><td>SN74128N</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Single-probe setup</td></tr><tr><td>Motorized linear stage and controller (3 sets)</td><td>Newport, Irvine, CA</td><td>Conex-MFACC</td><td></td></tr><tr><td>미니어처 XYZ 스테이지</td><td>Newport, Irvine, CA</td><td>MT-XYZ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>번역 XY 스테이지</td><td>ThorLab, Newton, NJ</td><td>PT1 및 PT102</td><td></td></tr><tr><td>Thermo LTQ XL 이온 소스 인터페이스 플랜지</td><td>New Objective, Woburn, MA&nbsp;</td><td>PV5500</td><td></td></tr><tr><td>디지털 스테레오 현미경, 250X - 2,000X</td><td>심천 D& F Co., 중국 선전, Supereyes</td><td>T004</td><td></td></tr><tr><td>USB 디지털 사진 현미경&nbsp;</td><td>DX.com, 홍콩, 중국</td><td>S02 25~500X&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Chemyx Inc., 텍사스주 스태포드&nbsp;</td><td>Nexus 3000</td><td></td></tr><tr><td>고체 알루미늄 광학 브레드보드, 8" x 8" x 1/2"</td><td>Thorlabs, Newton, NJ</td><td>MB810</td><td></td></tr><tr><td>유연한 클램프 홀더</td><td>Siskiyou, Grants Pass, OR&nbsp; &nbsp;</td><td>MXB-3h</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solvents</td></tr><tr><td>Methol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>34860 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>34967 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">세포 배양</td></tr><tr><td>Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 미디엄 (DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gibco/Life Technologies, Long Island, NY</td><td>10100-139</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES (pH 7.4)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE 익스프레스&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, 매사추세츠주 월섬&nbsp;</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트&nbsp;</td><td>Corning Inc., 뉴욕주 코닝&nbsp;</td><td>Falcon 351143</td><td></td></tr><tr><td>T25 플라스크</td><td>Corning Inc., 코닝, NY&nbsp;</td><td>Falcon 3055</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 커버 안경, 라운드, No. 1</td><td>VWR International, Radnor, PA&nbsp;</td><td>48380-046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (디메틸 설폭사이드)</td><td>VWR International, Radnor, PA&nbsp;</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tissue imaging</td></tr><tr><td>Cyro-Cut Microtome</td><td>American Optical Coporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek, 최적 절단 온도 (OCT)&nbsp;</td><td>Sakura Finetek Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드(폴리카보네이트)</td><td>과학 공급 솔루션, 엘크 그로브 빌리지, 일리노이</td><td>주 P11011P</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 프로브의 응용 프로그램 : 주변 조건에서 질량 분석 이미징 및 단일 세포 분석

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

주변 조건에서의 질량 분석 이미징(MSI) 및 현장 단일 세포 질량 분석(SCMS) 분석은 생물학적 샘플에서 생체 분자의 상세한 질량 분석법(MS) 분석에 큰 잠재력을 가진 두 가지 새로운 분야입니다. 샘플링 및 이온화 기능이 통합된 소형 장치인 단일 프로브는 주변 MSI 및 현장 SCMS 분석을 모두 수행할 수 있습니다. 주변 MSI의 경우, 단일 프로브는 표면 미세 추출을 사용하여 샘플의 MS 분석을 지속적으로 수행하며, 이 기술을 통해 마우스의 뇌 및 신장 절편과 같은 생물학적 샘플에서 높은 공간 해상도(8.5μm)의 MS 이미지를 생성할 수 있습니다. Ambient MSI는 분석 전에 시료 준비가 거의 또는 전혀 필요하지 않다는 장점이 있어 데이터 수집에 존재하는 잠재적 아티팩트의 양을 줄이고 시료를 보다 대표성 있게 분석할 수 있습니다. 현장 SCMS의 경우, 샘플링 팁 크기(< 10μm)가 작기 때문에 단일 프로브 팁을 HeLa 세포와 같은 살아있는 진핵 세포에 직접 삽입할 수 있으며, 이 기술은 개별 세포 내부의 광범위한 대사 산물을 거의 실시간으로 검출할 수 있습니다. SCMS를 사용하면 단일 세포 수준에서 화학 정보를 더 민감하고 정확하게 얻을 수 있으며, 이를 통해 이전보다 더 근본적인 수준에서 생물학적 과정에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다. 단일 프로브 장치는 광범위한 MSI 및 SCMS 연구를 위해 다양한 질량 분석기와 잠재적으로 결합될 수 있습니다.

단일 프로브가 성공적으로 단면 한 마우스의 신장 조직 (15)의 주위 MSI 분석에 사용 하였다. 장치는 MSI 결과 풍부한 이온 신호 강도로 이어지는 작은 영역에서 고효율 분석 추출을 제공하는 액체 표면의 미세 추출 (도 1a)의 메카니즘을 이용한다. 예를 들어, 10 개 이상 (7)의 신호 세기가 어떤 풍부한 대사 (도 2a)에 대해 달성되고있다. + (725.5575 m / z), PC (32 : 대사 다수는 스 핑고 미엘린 수 (SM) 및 포스파티딜콜린 (PC)와 같은 종 [+ 나 SM (1 34)]를 포함하여, 이러한 방법으로 검출 하였다 : 0) + H] + (734.5700 m / z), [PC (34 : 1) + 나] + (782.5696 m / z) 및 [PC (38 : 5 + 나)] + (814.5726 m / z). t을 결합 할 때 이들 화합물은 높은 질량 분해능과 질량 정확도로 확인되었다OA 고해상도 질량 분석기. 예를 들면, 식별 (즉, 관찰과 이론 값의 차이)의 각 대사 결과에 대한 (도 2B)은 여기에 제시된 4 개 이하의 PPM m / z 질량 정확도를 달성 하였다. 또한, 탠덤 MS (즉, MS / MS)도 관심의 종의 자신감 식별을 위해 실시 하였다 분석한다. (15) 인해 작은 면적에 효율적으로 액체 미세 추출을 수행하는 능력을, 단일 프로브 장치는 주위 조건 하에서 15 높은 공간 해상도 MSI 실험을 수행 할 수있다. 예를 들어, 마우스 신장 부분의 상세한 MS 이미지 선택된 대사 (도 2C)의 공간 분포를 나타내는 얻어졌다. MS는 이미지의 공간 해상도는 transiti을 갖는 널리 사용되는 메트릭에 따라 8.5 μm의 것으로 측정되었다. 상기 MS 신호의 20 % ~ 80 % 강도의 변화에서 결정된 날카로운 피쳐의 18 지점 인지질의 경우에 [PC (38 : 5 + NA)] + 마우스 신장 부 내측 수질의 기능 전환에 과 외부 수질은 강도 변화에게보다 20 % ~ 80 % 범위를 보여주는 chronogram 한 스캔주기에 걸쳐 발생한다. 샘플 이동 속도 (10.0 μm의 / 초) 및 MS 데이터 획득 레이트 (0.85 초 / 스펙트럼) 샘플 하나의 MS의 거리 사이클 (8.5 μm의), 즉, MSI 공간 해상도를 스캔 이동 계산 될 수있다 (도에 근거 2D). 이 공간 해상도는 아직 생물학적 시료에서 수행 주위 MSI 기술을 달성 가장 높은 사이입니다. SCMS 들어 단일 프로브 개별 라이브 HeLa 세포 (16)의 분석을 달성 할 수 있었다. 단일 프로브의 선단 사이즈 (전형적으로도 10㎛ 미만이고충분히 작은 URE 3a는) 직접되는 직경은 추출 및 MS 분석을 위해 ~ 10㎛, 진핵 세포의 많은 유형에 삽입한다. 셀에 단일 프로브 팁의 삽입 과정을 시각적 디지털 스테레오 현미경을 이용하여 모니터 할 수있다 (도 3b), 및 세포막을 침투 PBS (또는 새로운 세포 배양에서 질량 스펙트럼의 급격한 상당한 변화를 통해 확인할 수있다 세포 내 화합물 (도 3C 및 3D) 중간). 실험은 분자 종의 광범위한 종류를 검출하는 양성 및 음성 이온 모드 모두에서 수행 될 수있다. 아데노신 포스페이트는 (AMP가 ADP와 ATP)은 음이온 모드 (도 3C 및 d)에서 검출 된 반면, 예를 들어 18 가지 지질 종 sphingomyelins (SM) 및 포스파티딜콜린 (PC)를 포함하여, 포지티브 모드로 확인되었다. 단일 프로브 삽입 I 사이의 시간 지연세포 및 신호 검출 NTO 세포 대사의 거의 실시간 검색을 허용하는 일반적으로 2 초 미만이었다. SCMS는 세포 항암제 (예 OSW-1, 파클리탁셀, 독소루비신) 19]로 처리 된 실험에 적용 하였다. 상응하는 약물 농도 (즉, 10 nM 내지 100 nM 내지 1 μM, 10 μM) DMSO에 (디메틸 술폭 시드), 비 처리 된 세포를 사용하여 (DMSO만을 추가의 시리즈에서 4 시간 처리 후 HeLa 세포 내에서 검출 될 수있다 ) 컨트롤로. 약물의 MS 신호는 세포 PBS 또는 대조군 (도 3E) 내에 존재하지하지만 단일 프로브 MS 기법 (100 nM의 처리 결과,도 3f에 도시되어있다)를 사용하여 단일 세포 내에서 검출 하였다. 세포를 PBS (또는 새로운 세포 배양 배지)로 세정 하였다 때문에 내인성 대사 산물 (예, 세포 지질의 검출이 세포 화합물 및 오염물을 제거아데노신 디 포스페이트) 및 외인성 화합물 (예를 들어, 항암제) 단일 프로브 MS 기술은 세포 내 화합물을 분석 할 수 있음을 나타낸다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig1.jpg" /> 도 1 제조 및 주변 MSI 및 SCMS 분석 단일 프로브의 설치. a) 단일 프로브의 제작 방법. b) 유리 슬라이드. c) 상기 단일의 사진에 부착 제작 단일 프로브의 사진 질량 분광계. D에 부착 된 프로브 설정)을 질량 분석기와 결합 된 단일 프로브 설정의 다이어그램. 실험 동안, 샘플링 용매 연속적 주사기로부터 제공되고, 이온화​​ 전압이 질량 분광계에서 도전성 조합에 적용하고, 두 개의 디지털 현미경의 샘플 위치를 모니터링하는 데 사용되며, 전동 XYZ 스테이지) 사용자 정의 디지털 입체경 시스템. F) 사진 광 보드를 통해 이온 소스 인터페이스 플랜지에 부착 된 디지털 입체경을 보여주는 사진을 시스템은 샘플의 움직임을 제어하는 데 사용되며, 질량 분석기는 분석. 전자에 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig1large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig2.jpg" /> 도 높은 공간 분해능 및 질량 마우스 신장 부의 주위 MSI 연구 2. 결과. a) 단일 프로브 MSI의 대표적인 질량 스펙트럼. 3.39 × 10 7 (임의 단위)에 도달 할 수있는 검출 된 대사 산물의 최대 강도. b) 검출 된 대사 물질의 선택) 그들의 질량 정확도. C되게의 MS 이미지 [PC (32 : 0) + H] +와 [PC (34 : 1) + 나 + 8.5 μm의 공간 해상도로 마우스 신장 섹션에서 촬영. PC : 포스파티딜콜린. 스케일 바 : 2mm; 0.20 mm (삽입) 라) 공간에 대한 MS의 이미지의 해상도 결정. [PC (38 : 5) + 나] + (참조 (15)로부터 허가를 적용). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig3.jpg" /> 도 높은 질량 분해능으로 약물 치료를 HeLa 세포의 주위 SCMS 분석 3. 결과. a) 확대 된 직경이 &lt;10 ㎛의 전형적인 크기를 나타내는 단일 프로브 팁의 사진. b) 사진의 시점에서 촬영 헬라 세포 내로 단일 프로브 삽입. 스케일 바 : 50 μm의.c) PC (포스파티딜콜린) 종. d) HeLa 세포 양 및 음 이온 모드 인치 EF 모두 포함)의 질량 스펙트럼의 SCMS 분석으로부터 검출 된 대사 물질의 대표적인리스트의 수의 식별을 가진 전형적인 양이온 모드의 질량 스펙트럼 제어 및 치료 (100 nM의 OSW-1) 세포 (참조 (16)로부터 허가를 적용). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 S1. 질량 분석 데이터를 수집하기위한 접점 신호를 생성하기 위해 사용 된 전자 장치의 회로도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911figS1.jpg" target="_blank">보거나이 도면 다운로드 여기를 클릭하세요.</a>

여기에서는 MS 분석을 위한 소형 다기능 장치인 단일 프로브를 사용하여 조직의 주변 질량 분석 이미징(MSI)과 현장 라이브 단일 세포 MS(SCMS) 분석을 모두 수행하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

본 방법의 전반적인 목표는 상온 조건에서 질량 분석법을 이용하여 살아있는 단일 세포를 분석할 수 있는 마이크로 규모의 샘플링 장치인 Single-probe를 제작하는 것입니다. 또한, 높은 공간 해상도로 생체 조직의 상온 질량 분석 이미징을 수행하는 것입니다. 이 방법은 생물학 및 제약 연구의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.살아있는 단일 세포에 어떤 분자들이 존재하는지, 그리고 조직 내에서 어떻게 분포되어 있는지를 확인하는 것과 같은 분석이 가능합니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 프로브가 살아있는 단일 세포 분석과 고해상도 주변부 질량 분석 이미징 실험 모두에 사용될 수 있는 다기능 장치라는 점입니다. 이 방법은 단일 세포와 조직을 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 화학 물질의 희소 분석, 살아있는 미세 군집 및 바이오필름과 같이 마이크로 규모의 샘플링이 필요한 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.제 실험실의 박사후 연구원인 Wei Rao가 저와 함께 절차를 시연하겠습니다. 관심 있는 마우스의 전체 장기를 작은 플라스틱 웰 중앙에 놓으십시오. 조직 매립 화합물에 장기를 약 10mm 높이까지 잠기도록 담그십시오.조직을 즉시 액체 질소에 넣어 급속 냉동합니다. 마우스 조직 절편을 준비하려면, 냉동된 마우스 장기를 꺼내 온도 조절 기능이 있는 크라이오-마이크로톰(cryo-microtome)에서 15°C까지 해동합니다. 약 500 µL의 조직 매몰 화합물을 사용하여 조직을 스틸 베이스에 고정하고, 원하는 절단 방향이 칼날을 향하도록 크라이오-마이크로톰 절단 마운트에 배치합니다.조직을 12-micron 두께로 절편합니다. 그런 다음, 절편된 조직 슬라이스를 폴리카보네이트 현미경 슬라이드 위에 올리고 상온에서 30분 동안 건조시킵니다. 1 milliliter의 HeLa Cell Suspension과 같은 세포 샘플을 준비하여 표준 10cm 세포 배양 플레이트에 담긴 9mL의 완전 세포 배양 배지에 첨가합니다.세포 배양 플레이트의 성장 표면이 70-80%로 덮일 때까지 37°C, 5% CO2 조건에서 2~3일 동안 세포를 배양합니다. 세포 배양 플레이트에서 세포 계대를 수행합니다. 이를 위해 성장 배지를 흡입하여 제거하고 5mL의 1x phosphate buffered saline으로 세포를 세척합니다.멸균 흡입 팁을 사용하여 PBS를 제거하고, 세포를 배양 플레이트에서 분리하기 위해 2.5mL의 trypsin을 넣고 37°C에서 약 5분 동안 배양합니다. 7.5mL의 완전 세포 배양 배지를 첨가하여 trypsin 활성을 중단시킨 후, 세포를 균일하게 재현탁합니다. 단일 세포 질량 분석법(single-cell mass spectrometry, SCMS) 실험을 위한 세포 샘플을 준비하려면, 먼저 개별 마이크로 커버 슬라이드를 12-웰 플레이트의 웰에 배치합니다.그 다음, 1.8mL의 세포 배양 배지와 0.2mL의 세포 현탁액을 웰에 첨가합니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 세포를 부드럽게 혼합한 후, 37°C, 5% CO2 환경에서 약 24시간 동안 배양합니다. 배양된 세포에 약물을 처리하려면, 12-웰 세포 배양 플레이트에 약물 화합물 용액을 첨가합니다.이중 루멘 석영 튜브를 레이저 마이크로 피펫 풀러에 넣고, 이중 루멘 석영 니들을 뽑아냅니다. 초기 설정값으로 가열 온도는 400, 필라멘트는 3, 속도는 80, 지연 시간은 150, 풀링 값은 250으로 설정하십시오. 다른 쪽 끝에 뽑히지 않은 이중 루멘 석영 모세관이 약 5mm 정도 남도록 풀링 팁을 절단합니다.용매 공급용 모세관으로 사용할 80mm 길이의 용융 실리카 모세관(fused silica capillary) 섹션을 자릅니다. 그다음, 이 모세관을 이중 구멍 쿼츠 니들의 평평한 끝단에 있는 한쪽 구멍에 삽입합니다. 화염을 이용하여 nanoESI 이미터를 위한 용융 실리카 모세관을 뽑아낸 후, 7-10mm 길이로 잘라 이중 구멍 쿼츠 니들의 평평한 끝단에 있는 다른 쪽 구멍에 삽입합니다.이중 루멘 쿼츠 니들의 평평한 끝단에 UV 경화 수지를 최소량 도포합니다. LED UV 램프를 사용하여 수지를 약 20초 동안 경화시켜 용매 공급 모세관과 nanoESI 이미터를 고정합니다. 다음으로, 표준 현미경 유리 슬라이드를 길이 방향으로 절반을 자릅니다.그 다음, nanoESI 에미터가 바깥쪽을 향하도록 단일 프로브를 유리 슬라이드의 한쪽 끝에 배치합니다. 단일 프로브 본체에 일반 에폭시를 도포하여 유리 슬라이드에 고정시킨 후, 하룻밤 동안 그대로 두어 경화시킵니다. 이 시스템은 질량 분석기의 맞춤형 이온원 인터페이스 플랜지와 USB 디지털 현미경, 소형 수동 XYZ 이동 스테이지 및 전동 XYZ 이동 스테이지 시스템이 부착된 알루미늄 광학 보드를 포함합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 질량 분석기의 이온원 인터페이스 플랜지를 수정하고 디지털 실체 현미경의 스탠드를 제작하십시오. 수정된 디지털 실체 현미경, USB 디지털 현미경, 유연한 클램프 홀더가 포함된 소형 수동 XYZ 이동 스테이지 및 전동 XYZ 이동 스테이지 시스템을 알루미늄 광학 보드에 부착하십시오. 유연한 클램프 홀더를 사용하여 단일 프로브가 부착된 유리 슬라이드를 고정하십시오.그 다음, 단일 프로브 설정을 질량 분석기에 부착합니다. 유연한 클램프 홀더와 소형 XYZ 스테이지를 조절하여 단일 프로브의 이미터를 질량 분석기의 입구 앞에 위치시킵니다. 시료 절편을 실온에서 해동한 후, 단일 프로브 아래의 전동 XYZ 이동 스테이지 시스템 위에 놓습니다.제어 소프트웨어에서 좌표를 변경하여 시료의 위치를 조정하십시오. 시린지를 사용하여 샘플링 용매를 적절한 속도로 펌핑하십시오. 그런 다음, 이온화 전압을 인가하십시오.싱글 프로브의 높이를 조절하여 샘플 표면 바로 위에 위치하게 함으로써 대사물질의 표면 추출이 가능하도록 합니다. Z 스테이지를 조심스럽게 들어 올린 후, USB 디지털 현미경을 사용하여 싱글 프로브 팁과 조직 표면 사이의 거리 변화를 모니터링합니다. 샘플 내 관심 영역의 단면을 래스터 스캔하기 위한 파라미터를 설정합니다.여기에 제시된 생쥐 신장 절편의 경우, 10 µm/s의 래스터링 속도와 라인 간 간격 20 µm를 사용하십시오. 샘플 내 관심 절편 영역을 래스터링하도록 파라미터를 설정하십시오. 여기에 제시된 생쥐 신장 절편의 경우, 10.0 µm/s의 래스터링 속도와 라인 간 간격 20 µm를 사용하십시오.질량 분석기로부터 MS 스펙트럼을 자동 획득하기 위한 방법을 설정합니다. 생쥐 신장 샘플에 대해 고해상도 MSI를 수행할 경우, 질량 분해능 60,000, 5kV 양이온 모드, 1 microscan, 최대 주입 시간 150 milliseconds, 그리고 자동 이득 제어(automatic gain control) 켜짐 설정을 사용하십시오. MSI 데이터 획득을 시작한 다음, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 raw MS 파일로부터 MS 이미지를 구축합니다.MSI 지침에 따라 단일 프로브 시스템을 설정하고 용매 유량을 조정합니다. 배양액과 세포 외 약물 성분을 제거하기 위해 마이크로 커버 글라스 슬라이드에 부착된 배양 세포를 PBS로 세척합니다. 그런 다음, 세포가 포함된 글라스 슬라이드를 실험을 위해 전동 XYZ 이동 스테이지 시스템 위에 배치합니다.분석 중 세포 침투를 모니터링하기 위해 디지털 실체현미경의 초점을 샘플 위의 싱글 프로브 팁에 맞춥니다. 싱글 프로브 측면에 위치한 USB 디지털 현미경을 사용하여 싱글 프로브에 장착된 nanoESI 이미터의 작동 상태를 모니터링합니다. 전동 XYZ 스테이지 제어 프로그램과 디지털 실체현미경을 사용하여 분석 대상 세포를 찾고, 싱글 프로브 팁을 샘플 위의 정확한 위치에 배치합니다.단일 프로브 팁을 셀에 삽입하기 전에 MS 데이터 수집을 시작하십시오. 셀이 담긴 플레이트를 아래로 내려 단일 프로브 팁을 셀에서 뽑아냅니다. 마지막으로, 단일 프로브를 완전히 세척하기 위해 약 3분 동안 용매를 흘려보냅니다.마우스 신장 절편의 주변 질량 분석 이미징을 수행하였으며, 조직 표면에 존재하는 수많은 분자를 검출할 수 있었습니다. 조직 표면에서 여러 분자의 공간적 분포와 상대적 함량을 도식화하였습니다. 질량 분석 데이터 내에 존재하는 특징들의 급격한 전이를 관찰함으로써 8.5 microns의 공간 해상도를 달성하였습니다.날카로운 팁과 개방형 채널을 갖춘 단일 프로브를 제작하는 것은 단일 세포 분석에 있어 매우 중요합니다. 표적 세포의 위치를 찾고 세포 침투 과정을 모니터링하기 위해 현미경이 필요합니다. 질량 분석 스펙트럼의 신호 변화 또한 세포 침투를 확인하기 위한 추가 정보를 제공합니다.살아있는 단일 세포로부터 수많은 분자가 검출되어 왔습니다. 항암제 연구에 사용할 때는 대조군 세포 실험을 통해 항암제 처리의 차이를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 단일 프로브가 어떻게 제작되는지, 그리고 이 장치가 단일 세포의 질량 분석 및 생물학적 조직의 주변 질량 분석 이미징에 어떻게 사용되는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 단일 프로브 장치를 제작하고, 전체 시스템을 설정하며, 기기를 조작하는 데 상세한 지침이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 일단 숙달되면 많은 세포에 대해 단일 세포 분석을 지속적으로 수행할 수 있으며, 각 분석에는 3분 미만이 소요됩니다.상온 MS 이미징 실험을 완료하는 데는 샘플 크기, 공간 해상도 및 사용된 질량 분석기에 따라 몇 시간이 소요될 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 고품질의 단일 프로브를 제작하는 것이 핵심 단계임을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 실험을 성공적으로 수행하기 위해서는 기기의 튜닝과 작동이 매우 중요합니다.여기에 제시된 것과 유사한 절차를 따라 다른 방법들을 개발할 수 있습니다. 예를 들어, 시료 용매에 시약을 첨가하고 반응성 단일 세포 분석 및 상온 MSI를 수행하여 시료 내 분자의 검출 능력을 향상시킬 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 단일 세포 분석과 상온 조건의 질량 분석 이미징 연구 분야의 연구자들에게 새로운 길을 열어주었습니다.이 기술은 세포 생물학 연구, 약리학 연구 및 임상 시험에 잠재적으로 활용될 수 있습니다. 날카로운 석영 모세관과 UV 경화 에폭시를 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 UV 보호 안경을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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연구

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생물학

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