Name: Combinant Double Fluorescence In Situ Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de lexpression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Apprenez la double hybridation in situ en fluorescence combinée à l'immunomarquage pour détecter trois gènes simultanément dans des sections cérébrales de souris. Cette méthode permet de localiser l'expression génique sans anticorps spécifiques.

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Les travaux dans les laboratoires des auteurs ont été soutenus par le UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 et BB/L003236/1), le Wellcome Trust (WT100269MA) et le Conseil européen de la recherche (ERC, « Ideas » Programme 293544). SJ a été soutenu par une bourse à long terme de l’EMBO. Les auteurs remercient Stephen Grant pour son assistance technique.

Déclaration d&#39;éthique: l&#39;élevage et la manipulation de la souris sont conformes à la réglementation UK Home Office et les lignes directrices du comité d&#39;éthique de l&#39;UCL, se conformer à la Loi de 1986 du son Règlement Amendement 2012 Royaume-Uni et les animaux (Scientific Procedures). NOTE: Toutes les solutions doivent être faites avec le pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) - l&#39;eau traitée pour détruire toute RNase résiduelle. Pour le traitement DEPC, ajouter DEPC (1 ml par litre), agiter vigoureusement jusqu&#39;à ce que tous les globules DEPC ont disparu alors autoclave pour dégrader le DEPC. 1. ARN Probe Synthesis <ol><li> ATTENTION: Lors de la manipulation formamide, porter un équipement de protection individuelle (EPI) et utiliser une enceinte de sécurité. Préparer un tampon d&#39;hybridation: traitée au DEPC l&#39; eau déminéralisée avec 50% (v / v) de formamide désionisé, NaCl 200 mM, EDTA 5 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, 5 mM de NaH 2 PO 4, 5 mM de Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml d&#39;ARNt de levure, 1 x Denhardt solutisur, et 10% p / v de sulfate de dextran. </li><li> Choisir un clone d&#39;ADN qui contient la séquence d&#39;ADNc du gène d&#39;intérêt dans un plasmide avec des promoteurs d&#39;ARN polymerase. Pour cet exemple, utiliser un clone pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), avec T7 et SP6 promoteurs d&#39;ARN polymérase pour Aspa (Figure 1 supplémentaire). </li><li> Préparer l&#39;ADN de plasmide linéarisé comme matrice. <ol><li> Cultiver le clone d&#39;ADN, extraire le plasmide avec un kit de purification de plasmide à petite échelle selon le protocole et la séquence du fabricant avec le T7 et des amorces universelles SP6. </li><li> Digest 1 020 pg d&#39;ADN de plasmide avec une enzyme de restriction qui coupe à l&#39;extrémité 5 &#39;du brin sens de l&#39;ADNc. Pour cet exemple, utiliser 100 unités Sal I pour digérer le plasmide pCMV-SPORT6- Aspa. Incuber pendant 1,5 h à 37 o C. </li><li> Exécuter une petite aliquote sur un gel d&#39;agarose pour vérifier que le plasmide est entièrement linéarisé. </li></ol></li><li> Purifier leplasmide linéarisées en utilisant du phénol-chloroforme. <ol><li> Ajouter 1/10 volume de 3 M d&#39;acétate de sodium, d&#39;un volume de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) - phénol équilibré et un volume de chloroforme / alcool isoamylique (IAA) (24: 1). </li><li> Centrifuger à 16 000 x g pendant 1 min à température ambiante (20-25 ° C, RT) et extraire la phase aqueuse supérieure. </li><li> Ajouter un volume de chloroforme / IAA, centrifugeuse à 16.000 xg pendant 1 min et extraire la phase aqueuse supérieure. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.4.3. </li><li> Ajouter 2 volumes d&#39;éthanol et de laisser à -20 ° C pendant 1 h ou O / N. </li><li> Centrifuger à 16 000 xg à 4 ° C pendant 10 min. Jeter le surnageant. </li><li> Laver le culot avec de l&#39;éthanol à 70% froid et remettre en suspension dans approximativement 1 pg d&#39;ADNc par 2,5 ul de TE (10 mM de Tris-HCl, 1 mM d&#39;EDTA, pH 7,5). </li></ol></li><li> Synthétiser les deux sondes, l&#39;une marquée avec de la digoxigénine (DIG) et l&#39;autre à l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC). <ol><li> Sélectionnez l&#39;ARN polymerase appropriée pour rendre l&#39;anti-soisonde nse (complémentaire de l&#39;ARNm cible). Pour cet exemple, utiliser l&#39; ARN polymerase T7 pour faire sonde Aspa. </li><li> Préparer la réaction de transcription in vitro: ajouter 1 pg de l&#39;ADN linéarisé, 4,0 ul de 5 tampon de transcription x, 6,0 ul de 100 mM de DTT, 2,0 ul de 10 x DIG ou FITC ARN marquage mélange contenant des dNTPs, 1 inhibiteur de RNase ul, et 20 - 40 unités de l&#39;ARN polymérase; rendre le volume final à 20 pi avec de l&#39;eau traitée par DEPC. </li><li> Incuber à 37 o C pendant 1,5 heure. </li></ol></li><li> ul FONCT1 de la réaction de transcription sur un gel d&#39;agarose à 1,0% pour vérifier que la réaction a fonctionné. Le gel doit montrer le modèle linéaire et une bande brillante de la sonde. </li><li> Compléter le volume à 100 pi avec un tampon d&#39;hybridation et de stocker 10 aliquotes à -80 ° C. </li></ol> 2. Perfusion, Fixation et collecte de tissus <ol><li> ATTENTION: Lors de la manipulation paraformaldéhyde (PFA), à la fois solide etaqueuse, porter PPE et utiliser une enceinte de sécurité. Préparer une solution de formaldéhyde par dissolution de 4% (p / v) de PFA dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) en utilisant la chaleur (55 ° C). Filtrer la solution de formaldéhyde avec du papier filtre. </li><li> Préparer une solution de saccharose par dissolution de 20% (p / v) de saccharose dans de l&#39;eau distillée et on ajoute 0,1% (v / v) DEPC. Laissez O / N à température ambiante avec un couvercle lâche puis autoclave. </li><li> Terminally anesthésier une souris par injection intra-péritonéale de pentobarbital (50 mg / kg). Évaluer la profondeur de l&#39;anesthésie par pincement de l&#39;orteil et l&#39;absence de réflexe de retrait indique une anesthésie profonde. </li><li> Une fois que la souris est sous anesthésie profonde, faire une incision sous la cage thoracique et couper à travers la cage thoracique des deux côtés, soulevez-le pour exposer le cœur. </li><li> Insérer une aiguille de 25 G dans le ventricule gauche du cœur. Faire une petite incision dans l&#39;oreillette droite du cœur. </li><li> Perfuser l&#39;animal avec 20 ml de PBS, puis 40 ml de solution de formaldéhyde. Pour P30 et plussouris, utiliser un taux de 12 ml / min de perfusion, mais pour les animaux plus jeunes utilisent un taux inférieur (7-10 ml / min). </li><li> Disséquer le cerveau. <ol><li> Sever la tête de la souris avec des ciseaux chirurgicaux en faisant un postérieur de coupe des oreilles. Faire une incision médiane caudale dans la peau et travailler rostrale pour enlever la peau du crâne. </li><li> A partir de la partie caudale, couper à travers le sommet du crâne le long et la ligne médiane entre les yeux avec des ciseaux Iris. Retirer le pariétal et les plaques d&#39;os frontal en inclinant un côté d&#39;une plaque d&#39;ostéosynthèse à chaque fois et enclenchant hors avec des pincettes. </li><li> Inclinez doucement le cerveau vers le haut de la partie antérieure avec des pincettes et couper les nerfs optiques et d&#39;autres nerfs crâniens. Soulevez doucement le cerveau sur le crâne. </li></ol></li><li> Placer le cerveau dans une matrice de cerveau coronale de la souris. Trancher le cerveau en 3 environ 4 mm pièces avec une lame de rasoir plume. </li><li> Transférer les tranches dans une solution PFA 4% et incuber O / N à 4 ° C. </li><li> Transfert cerveautranches d&#39;traitée au DEPC solution à 20% de saccharose et incubent O / N à 4 ° C </li><li> Placez chaque tranche de cerveau dans un cryomould sec, entourer de la température de coupe optimale (OCT) à moyen et à geler sur la glace sèche. Conserver à -80 ° C. </li></ol> 3. Cryosectioning <ol><li> Couper 15 um sections de tissu congelé dans un cryostat et de recueillir les sections sur des lames de microscope. Si nécessaire, mouiller les sections avec DEPC traitées PBS et les aplatir avec un pinceau fin. </li><li> Laisser les lames sécher pendant environ 1 heure pour faire en sorte que le tissu adhère à la lame. </li></ol> 4. hybridation <ol><li> Préparer 65 ° C Tampon de lavage: 150 mM de NaCl, 15 mM de Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1 x citrate de sodium salin), 50% (v / v) de formamide et 0,1% (v / v) de Tween 20. </li><li> Préparer un tampon MABT: acide maléique 100 mM, NaCl 150 mM, 0,1% (v / v) de Tween-20, pH 7,5. </li><li> Diluer les deux sondes (DIG marqué et FITC-labelled) 1/1000 dans un tampon d&#39;hybridation préchauffé à 65 ° C et bien mélanger. </li><li> Appliquer environ 300 pi de mélange d&#39;hybridation sur chaque diapositive, coverslipwith (200 o C) des lamelles cuites au four et incuber O / N à 65 ° C dans une chambre humidifiée. </li><li> Transférer les lames dans une jarre Coplin contenant un tampon de lavage préchauffé. Laver les lames pendant 30 minutes deux fois à 65 ° C avec un tampon de lavage. </li><li> Laver les lames pendant 10 minutes trois fois avec MABT à la température ambiante. </li></ol> 5. Visualisation de la FITC Probe <ol><li> Préparer un tampon de blocage ISH: MABT avec 2% de réactif de blocage et du sérum inactivé à la chaleur 10% de brebis. </li><li> En option: utiliser un stylo hydrophobe pour dessiner des cercles autour de coupes de tissu sur la lame pour réduire le volume des solutions d&#39;anticorps nécessaires. </li><li> Incuber les lames pendant 1 heure à température ambiante avec un tampon de blocage ISH dans une chambre humidifiée. </li><li> Incuber les lames O / N à 4 ° C avec une peroxydase de raifort (POD) - conjuguéd anticorps anti-FITC dilué au 1/500 (v / v) dans un tampon de blocage ISH. </li><li> Placer les lames dans une jarre de Coplin contenant du PBS avec 0,1% (v / v) de Tween-20 (PBST). Lavez 3 fois pendant 10 minutes dans PBST et le remplacer par du PBST frais à chaque fois. </li><li> Immédiatement avant utilisation, préparer le tyramide fluorescent en diluant 100 fois dans le diluant Amplification. Pour cet exemple, utilisez FITC-tyramide. </li><li> Ajoutez à cela les diapositives et laisser reposer pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Placer les lames dans une jarre Coplin et laver 3 fois en PBST pendant 10 min. </li></ol> 6. Visualisation de la DIG Probe <ol><li> Préparer 0,1 M Tris-HCl pH 8,2. </li><li> Incuber les lames avec un tampon de blocage ISH pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Incuber les lames O / N à 4 ° C avec une phosphatase alcaline (AP) conjugué à un anticorps anti-DIG dilué à 1/1 500 (v / v) dans un tampon de blocage ISH. </li><li> Laver avec MABT pendant 10 minutes trois fois. </li><li> Laver deux fois avec 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,2 pendant 5 min à température ambiante. </li><li>Immédiatement avant utilisation, préparer la solution Fast Red en dissolvant les comprimés dans Tris 0,1 M pH 8,2. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 pm. </li><li> Incuber les lames à 37 ° C avec une solution de Fast Red dans une chambre humidifiée. Comme le temps pour un développement optimal varie, vérifiez les diapositives régulièrement avec un microscope à fluorescence pour surveiller la formation de précipité. Pour cet exemple, arrêter la réaction après 2 - 3 heures. </li><li> Laver avec PBST pendant 10 minutes trois fois. </li></ol> 7. immunohistochimie <ol><li> Préparer un tampon de blocage IHC: 10% (v / v) de sérum (d&#39;une espèce différente à l&#39;hôte d&#39;anticorps primaire) en PBST. </li><li> Incuber les lames avec IHC tampon de blocage pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humidifiée. </li><li> Préparation de l&#39;anticorps primaire: diluer l&#39;anticorps primaire à une dilution appropriée dans PBST avec 5% de sérum (d&#39;une espèce différente à l&#39;hôte d&#39;anticorps primaire). Pour cet exemple, utiliser un anticorps de lapin anti-Olig2 à 1/400 (v / v) dilution. </li><li>Incuber dans la solution d&#39;anticorps primaire à 4 ° CO / N. </li><li> Laver avec PBST pendant 10 minutes trois fois. </li><li> Préparation de l&#39;anticorps secondaire: diluer un anticorps secondaire fluorophore conjugué à une dilution appropriée dans PBST avec 5% (v / v) de sérum (d&#39;une espèce différente à l&#39;hôte d&#39;anticorps primaire) et 0,1% (v / v) Hoechst 33258. Pour cet exemple , utiliser un âne anti-lapin Alexa647 anticorps secondaire à 1/1000 (v / v) dilution. </li><li> Incuber dans la solution d&#39;anticorps secondaires à température ambiante pendant 1 h. </li><li> Laver avec PBST pendant 10 minutes trois fois. </li></ol> 8. Montage <ol><li> Partiellement sécher les lames à la température ambiante, et monter avec un support de montage de fluorescence. Laissez les diapositives à sécher, puis l&#39;image dans un microscope confocal à 10X, 20X et 63X objectifs en utilisant 4 canaux différents avec les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation suivantes: 570 nm pour Fast Red, 488 nm pour FITC, 647 nm pour Olig2 immunomarquage et 350 nm pour Hoechst . </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce protocole prévoit une procédure étape par étape pour un ARN double hybridation in situ suivie par immunocoloration. Nous avons utilisé ce protocole pour confirmer que Aspa est exprimé dans les oligodendrocytes matures dans plusieurs régions du cerveau. Cette procédure en plusieurs étapes a de nombreux pièges potentiels qui peuvent affecter la sensibilité et doivent être évités. Tout d&#39;abord, toutes les solutions et tampons de stockage pour la réaction de transcriptio...

Les cellules gliales, qui sont les cellules les plus abondantes dans le système nerveux central (SNC), comprennent oligodendrocytes (les cellules myélinisantes du SNC), les oligodendrocytes précurseurs (PO, aussi connu comme «cellules NG2»), les astrocytes et la microglie. Il y a un intérêt croissant dans les fonctions des cellules gliales et leur rôle potentiel dans les maladies neurologiques 1. Par exemple, la maladie de Canavan (CD) est une maladie neurodégénérative héréditaire commençant tôt dans l&#39; enfance avec leucodystrophie spongiforme et une perte progressive des neurones, menant à la mort habituellement avant 10 ans de 2,3 ans. Des mutations du gène Aspartoacyclase (ASPA) qui conduisent à réduire considérablement l&#39; activité ASPA 4 CD ont été identifiés. ASPA est une enzyme catalysant la désacétylation du N-acétylaspartate (NAA), une molécule fortement concentrée dans le cerveau, l&#39; acétate de génération et d&#39; aspartate 5-7. Beaucoup de patients CD présentent des niveaux plus élevés de NAA en raison du manque de ASPA activité. Certaines études avancent que l&#39; acétate NAA dérivé pourrait être une source importante d&#39;acides gras / lipides dans le cerveau au cours du développement et CD peut résulter d&#39; une diminution de la synthèse de la myéline au cours du développement causés par l&#39;échec de NAA être ventilés 3,5,6. ASPA se retrouve principalement dans les reins, le foie et la substance blanche du cerveau, et étant donné le rôle important de la ZSPA dans le CD, l&#39;expression cellulaire de cette enzyme dans le cerveau a été étudié par plusieurs laboratoires. En regardant l&#39; activité enzymatique ASPA dans le cerveau, des études antérieures ont constaté que l&#39;augmentation de l&#39;activité ASPA au cours du développement du cerveau est parallèle au cours du temps de myélinisation 8-10. Au niveau cellulaire, les tests pour l&#39; activité enzymatique ainsi que l&#39; hybridation in situ (ISH) et immunohistochimie (IHC) dans les analyses suggèrent que l&#39; ASPA est principalement exprimé dans les oligodendrocytes dans le cerveau , mais pas dans les neurones ou des astrocytes 11-16. Quelques études ont montré que ASPA pourrait aussiêtre exprimé dans la microglie dans le SNC 12,14. Jusqu&#39;à présent, les données sur l&#39;expression ASPA dans les PO sont limitées. Selon une étude récente où transcriptomes de différents types de cellules dans le cortex cérébral de souris , y compris les neurones, les astrocytes, ops, oligodendrocytes nouvellement formés, oligodendrocytes myélinisantes, les microglies, les cellules endothéliales et péricytes ont été analysés par séquençage de l&#39; ARN 17, ASPA est exclusivement exprimé dans les oligodendrocytes , en particulier dans myélinisantes oligodendrocytes (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). En dépit de ces études sur modèle d&#39;expression ASPA dans le cerveau, un certain nombre d&#39;incertitudes demeurent. Différentes techniques peuvent être utilisées pour étudier les profils d&#39;expression des gènes. IHC est une méthode couramment utilisée pour la détection du produit fonctionnel ( par exemple, une protéine) d&#39;une expression génique dans des coupes de tissus. En dépit de sa grande utilité, cette technique a des limites que son application et la spécificité sont sujets to la disponibilité et la spécificité de l&#39;anticorps est nécessaire. Par comparaison, ISH a l&#39;avantage d&#39;être capable de révéler l&#39;expression d&#39;un gène au niveau de l&#39;ARNm. Cependant, il peut être techniquement difficile d&#39;utiliser plusieurs sondes en même temps afin de localiser une expression de gènes à des types cellulaires spécifiques. Dans cet article, nous décrivons un protocole combinant ARN double fluorescence hybridation in situ avec fluorescence immunomarquage d&#39;une protéine. Nous avons utilisé cet ensemble de techniques pour examiner le profil d&#39;expression de Aspa dans le cerveau de souris. Cette méthode permet l&#39;étude précise de l&#39;expression génique en utilisant la microscopie confocale.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Formamide désionisé</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>pour tampon bloquant l’ISH</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique anhydre</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique dihydraté</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>ARNt de levure</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x La solution de Denhardt</td><td></td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de dextran</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Clone d’ADNc</td><td>Aspa Source Bioscience</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>Acétate</td><td>de sodium Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Phénol équilibré</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isoamylique</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>ARN T7 polymérase</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de transcription</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Fisher </td><td>scientifique 005479470</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 25</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Cole-Parmer Instrument Co. Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>n° 2 pince à épiler</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Coronal Brain Matrix</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT moyen</td><td>Tissu tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/microtome</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus</td> lames <td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>pour 65 &deg ; C Tampon de lavage</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles VWR</td><td>International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de blocage</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de mouton inactivé par la chaleur</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Stylo hydrophobe</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&alpha ;-FITC Anticorps conjugué au POD</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&trade ; Plus Système de fluorescéine</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1 500</td></tr><tr><td>&alpha ;-DIG AP-conjugué</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés rouges rapides</td><td>Roche</td><td>11496549001.22</td><td></td></tr> <tr><td>&micro ; M filter</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-Olig2 Rabbit antbody</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg ; 647-conjugué &alpha ;-rabbit</td><td>anticorps Life technologies</td><td>A-31573</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 confocal microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinant double fluorescence<em&gt; in situ</em&gt; hybridation avec immunomarquage pour la détection de l&#39;expression de trois gènes chez la souris sections du cerveau

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

La détection de l&#39; expression du gène dans différents types de cellules du cerveau , par exemple, les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes, les précurseurs d&#39;oligodendrocytes et la microglie, peut être entravée par l&#39;absence d&#39;anticorps primaires ou secondaires spécifiques pour immunocoloration. Nous décrivons ici un protocole pour détecter l&#39;expression de trois gènes différents dans la même section du cerveau en utilisant le double fluorescence par hybridation in situ avec deux sondes spécifiques de gènes , suivie par immunocoloration avec un anticorps de haute spécificité dirigée contre la protéine codée par un troisième gène. Le gène Aspartoacyclase (ASPA), les mutations de ce qui peut conduire à une maladie rare de la substance blanche humaine - la maladie de Canavan - est pensé pour être exprimé dans les oligodendrocytes et la microglie , mais pas dans les astrocytes et les neurones. Cependant, le modèle d&#39;expression précise de ASPA dans le cerveau n&#39;a pas encore été établie. Ce protocole nous a permis de déterminer que l&#39;ASPA est exprimé dans un sous-ensemble des oligodendrocytes matures unee peut être généralement appliqué à une large gamme d&#39;études de motif d&#39;expression génique.

Cet article décrit une méthode pour un ISH double fluorescence suivie par immunomarquage dans des coupes de cerveau de souris. Une brève description de ce protocole est représenté sur la figure 1. La première étape a consisté à synthétiser des sondes spécifiques à Aspa et Mbp (myéline protéine de base). Pour vérifier que les sondes ont été synthétisées, une petite aliquote de chaque réaction a été effectuée sur un gel d&#39;agarose. Le modèle l...

La localisation de l’expression génique sur des types de cellules spécifiques peut être difficile en raison de l’absence d’anticorps spécifiques. Nous décrivons ici un protocole de triple détection simultanée de l’expression génique en combinant l’hybridation in situ d’ARN à double fluorescence avec l’immunomarquage.

Combinant Double Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de l&#39;expression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

L'objectif général de cette expérience est de détecter simultanément l'expression de trois gènes différents dans des sections cérébrales, en utilisant une hybridation in situ en double fluorescence suivie d'une immunomarquage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, comme par exemple : quel type cellulaire exprime mon gène d'intérêt ? Le principal avantage de cette technique est qu'elle ne nécessite pas d'avoir un bon anticorps dirigé contre le gène d'intérêt pour pouvoir localiser son expression dans un type cellulaire spécifique.Pour résumer cette procédure, le premier jour, des sections de tissu fixé sont découpées et hybridées toute la nuit avec deux sondes ARN marquées différemment. Le deuxième jour, les sections sont incubées toute la nuit avec un anticorps ciblant la sonde marquée par la FITC. Cet anticorps est conjugué à la peroxydase de raifort, qui catalyse l'ajout d'une tyramide fluorescente le troisième jour.Ensuite, un anticorps conjugué à une phosphatase alcaline est utilisé pour cibler la sonde marquée au DIG. Au quatrième jour, cet enzyme catalyse la formation d'un précipité fluorescent lorsqu'il est incubé avec la solution de Fast Red. Puis, les sections sont incubées toute la nuit avec un anticorps primaire ciblant une protéine d'intérêt.Enfin, le cinquième jour, cette protéine est visualisée à l’aide d’un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore. Pour commencer cette procédure, sélectionnez un clone d’ADN contenant la séquence d’ADN complémentaire du gène d’intérêt insérée dans un plasmide portant des promoteurs de polymérase ARN. Ensuite, faites croître le clone d’ADN, extrayez le plasmide à l’aide d’un kit de purification de plasmide à petite échelle, puis séquençez-le à l’aide des amorces universelles T7 et SP6.Digérez 10 à 20 microgrammes d'ADN plasmidique à l'aide d'une enzyme de restriction qui coupe à l'extrémité cinq prime du brin sens du cDNA. Incubez pendant 1,5 heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, faites migrer une petite aliquote sur un gel d'agarose pour vérifier que le plasmide est complètement linéarisé.Pour purifier le plasmide linéarisé, ajouter un dixième du volume d'acétate de sodium à trois molaire, un volume de phénol équilibré au tampon Tris-HCl 10 millimolaire et un volume de chloroforme alcool isoamylique. Centrifuger à 16 000 Gs pendant une minute à température ambiante, puis extraire la phase aqueuse supérieure. Ajouter ensuite un volume de chloroforme IAA.Centrifuger à 16 000 G pendant une minute et extraire la phase aqueuse supérieure. Répéter cette étape une fois de plus. Ensuite, ajouter deux volumes d'éthanol et conserver à moins 20 degrés Celsius pendant une heure ou toute la nuit.Ensuite, centrifuger à 16 000 G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Éliminer le surnageant et laver le culot avec de l'éthanol froid à 70 %. Puis, resuspendre dans du tampon TE à une concentration d'un microgramme d'ADNc par 2,5 microlitres.Pour synthétiser les deux sondes, sélectionnez d'abord l'ARN polymérase appropriée. Préparez ensuite la réaction de transcription in vitro et ajustez le volume final à 20 microlitres avec de l'eau traitée au DEPC. Incubez à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure.Ensuite, faire migrer un microlitre de la réaction de transcription sur un gel d'agarose à 1 % afin de vérifier si la réaction a fonctionné. Le gel doit montrer l'ADN matrice linéaire et une bande intense de la sonde. Dans cette procédure, couper des sections de tissu congelé de 15 micromètres d'épaisseur dans un cryostat.Prélevez les sections sur les lames de microscope et laissez les lames sécher pendant une heure afin de garantir l'adhérence des tissus aux lames. Le facteur le plus important pour que cette procédure fonctionne correctement est la qualité des sections. Cela dépend en partie de la qualité de la perfusion et de la fixation du tissu, et en partie de la technique de sectionnement permettant d'obtenir des sections planes et exemptes de contamination par les RNases.Ensuite, diluez les deux sondes dans du tampon d'hybridation préalablement réchauffé à 65 degrés Celsius, et mélangez soigneusement. Appliquez 300 microlitres du mélange d'hybridation sur chaque lame, puis recouvrez avec un coverslip préalablement chauffé au four. Incubez ensuite les lames toute la nuit à 65 degrés Celsius dans une chambre humide.Le lendemain, transférez les lames dans un bocal Coplin contenant du tampon de lavage préalablement réchauffé, et lavez les lames pendant 30 minutes, deux fois, à 65 degrés Celsius. Ensuite, lavez les lames trois fois pendant 10 minutes avec la solution de lavage MABT à température ambiante. À cette étape, utilisez un stylo hydrophobe pour tracer des cercles autour des sections tissulaires.Ensuite, incuber les lames pendant une heure à température ambiante avec le tampon de blocage ISH dans une chambre humidifiée. Puis, incuber les lames toute la nuit à 4 degrés Celsius avec un anticorps anti-FITC conjugué à la peroxydase de raifort. Ensuite, placer les lames dans un bocal de Coplin contenant du PBST.Les laver trois fois dans le PBST pendant 10 minutes à chaque fois, en remplaçant par du PBST frais à chaque changement. Ensuite, ajouter le tiromide fluorescent sur les lames et les laisser pendant 10 minutes à température ambiante. Placer les lames dans un bocal de Coplin et les laver dans le PBST pendant 10 minutes, répété trois fois.Incuber ensuite les lames avec le tampon de blocage d'ISH pendant une heure à température ambiante. Puis, incuber les lames toute la nuit à quatre degrés Celsius avec un anticorps anti-dig conjugué à la phosphatase alcaline. Ensuite, les laver trois fois avec du MABT pendant 10 minutes à chaque fois.Ensuite, lavez les lames deux fois avec une solution de Tris-HCl 0,1 M à pH 8,2 pendant cinq minutes à température ambiante. Filtrez la solution de rouge rapide, puis incubez les lames à 37 degrés Celsius avec la solution de rouge rapide dans une chambre humidifiée. Comme le temps de développement optimal varie, examinez régulièrement les lames au microscope fluorescent pour surveiller la formation du précipité.Ensuite, les laver trois fois avec du PBST pendant 10 minutes à chaque fois. Pour réaliser l'immunohistochimie, incuber les lames avec le tampon de blocage IHC pendant une heure à température ambiante dans une chambre humidifiée. Puis, incuber les lames dans la solution d'anticorps primaire à quatre degrés Celsius toute la nuit.Le lendemain, laver les lames avec du PBST pendant 10 minutes, trois fois. Incuber les lames dans la solution d'anticorps secondaire à température ambiante pendant une heure. Ensuite, laver les lames avec du PBST trois fois, pendant 10 minutes à chaque fois.Ensuite, laissez sécher partiellement les lames à température ambiante et montez-les avec un milieu de montage fluorescent. Laissez les lames sécher avant de les observer au microscope confocal. Les images représentatives présentées ici proviennent de l'ISH pour Aspa et Mbp, suivie d'une immunomarquage pour OLIG2 combiné à un marquage par hybridation.Aspa était exprimé dans certaines cellules positives pour MBP et positives pour OLIG2 dans le cortex ainsi que dans le corps calleux. Certaines cellules positives pour Mbp et positives pour OLIG2 n'expriment pas Aspa. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à maintenir les tranches et toutes les solutions exemptes de contamination par les RNases.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier les profils d'expression génique par inhibition de N-citrine et immunohistochimie. Cette technique peut être adaptée à divers tissus d'origines et de stades de développement différents.

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Double fluorescence In situ</emHybridation> dans des coupes de cerveau frais

Une combinaison de différentes techniques pour optimiser la collecte des données à partir de tissus de la souris est présentée.

Combinant colorant lipophile, In situ</emHybridation>, immunohistochimie et l&#39;histologie

Source : Jolly, S., et.al. Combinaison de l’hybridation in situ à double fluorescence  avec immunomarquage pour la détection de l’expression de trois gènes dans des sections de cerveau de souris. J. Vis. Exp. (2016). Cette vidéo démontre l’utilisation de l’hybridation in situ à double fluorescence pour visualiser l’expression de deux cibles d’ARN dans des coupes de cerveau de souris. Le protocole implique une détection séquentielle de l’ARN à l’aide de sondes marquées à la fluorescéine, à...

 Réalisation d’une hybridation in situ à double fluorescence pour détecter l’expression génique dans des sections de cerveau de souris

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Immunomarquage de neurones dans des tranches de cerveau de souris suite à une hybridation in situ par fluorescence

Ce protocole de niveau introductif décrit les réactifs, l’équipement et les techniques nécessaires pour réaliser la coloration immunohistochimique du cerveau des rongeurs, en utilisant des marqueurs pour la microglie et les éléments neuronaux à titre d’exemple.

Primaire pour Immunohistochimie sur tissus Cryosectioned cerveau de rat: Exemple coloration pour microglies et les neurones

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Multi-cible chromogénique totalité montage<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation pour la comparaison des gènes domaines d&#39;expression dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Ce protocole décrit un workflow étape par étape pour la costaining immunofluorescente d'IBA1 et de TMEM119, en plus de l'analyse de la densité, de la distribution et de la morphologie microgliales, aussi bien que l'infiltration périphérique de cellules myéloïdes dans le tissu de cerveau de souris.

Cellule d'immunofluorescence utilisant IBA1 et TMEM119 pour la densité microgliale, la morphologie et l'analyse périphérique d'infiltration de cellules myéloïdes dans le cerveau de souris

Ce protocole décrit une méthode permettant de combiner l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et l’immunohistochimie par fluorescence (IHC) dans des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées et fixes, dans le but d’obtenir un signal FISH et IHC de fluorescence multimarqueur. L’IHC a ciblé les protéines cytoplasmiques et membranaires.

Combinaison de l’hybridation in situ par fluorescence multiplex avec l’immunohistochimie fluorescente sur des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées ou fixes

La capacité de marquer de façon permanente les cellules souches et leur descendance avec un fluorophore à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et / ou de la différenciation in vivo. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipotence.

Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

L’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (EASI-FISH) est une technique robuste qui combine la microscopie à expansion avec l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour détecter l’expression de plusieurs gènes dans les tissus épais. Ce protocole décrit les progrès récents de la méthode et son adaptation pour le marquage du système nerveux central intact de la drosophile.

Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Apprenez la double hybridation in situ en fluorescence combinée à l'immunomarquage pour détecter trois gènes simultanément dans des sections cérébrales de souris. Cette méthode permet de localiser l'expression génique sans anticorps spécifiques.

Combinant Double Fluorescence In Situ Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de lexpression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau (Vidéo) | JoVE Journal

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