Name: Scanning Electron Microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Impara la microscopia elettronica a scansione di tessuto cardiaco decellularizzato per visualizzare la matrice extracellulare. Questa tecnica fornisce informazioni qualitative sulla struttura della matrice nelle cardiomiopatie fibrotiche.

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Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH), Heart, Lung, and Blood Institute (NIHLB): K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398. 
L'imaging e l'elaborazione dei tessuti (dopo la macerazione NaOH) sono stati eseguiti attraverso l'uso della Cell Imaging Shared Resource (CISR) del Vanderbilt University Medical Center (VUMC) (supportata dalle sovvenzioni NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 e EY08126). Siamo particolarmente grati ai direttori principali del VUMC CISR (Dr. Sam Wells e Dr. W. Gray (Jay) Jerome) per i preziosi consigli tecnici e anche per aver fornito lo spazio e le risorse di base ai fini delle riprese della tecnica evidenziata in questo documento. 
Vorremmo estendere il nostro più profondo apprezzamento al Dr. Yan Ru Su e alla signora Kelsey Tomasek del Cardiology Core Lab for Translational and Clinical Research presso la Vanderbilt University per aver fornito competenze tecniche e per aver raccolto campioni di tessuto umano utilizzati in questo studio.

Etica Dichiarazione: I protocolli per la gestione degli animali sono stati approvati dalla Vanderbilt Institutional Animal Care e del Comitato Usa (IACUC, protocolli numero M / 10/117 (suini) e M / 10/219 (topi) e condotto secondo le norme AAALAC-internazionali. l&#39;utilizzo di tessuti cardiaci umani sopraelevate è stato approvato dalla Vanderbilt University Medical center IRB (numero di protocollo 100887). 1. Raccolta e conservazione <ol><li> Rendere fresca 4% glutaraldeide in soluzione 0,1 M tampone fosfato (PB). ATTENZIONE: glutaraldeide è tossico, indossare guanti e lavorare in una cappa aspirante. <ol><li> Fare una soluzione di 0,2 m stock di PB, pH 7,4 utilizzando 21,8 g di Na 2 HPO 4 e 6,4 g di NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) a 1.000 ml dH 2 O. </li><li> Aggiungere 400 ml di 50% glutaraldeide al 2,5 ml di soluzione PB e 2,1 ml di dH 2 O. </li></ol></li><li> Immergere un pezzo (non più grande di 2 cm 2) di tessuto nella soluzione di glutaraldeide 4%. Nota: pezzi di piccole dimensioni possono anche essere utilizzati, ma dovrebbero essere di dimensioni sufficienti (non inferiore a 5 mm 2) per essere facilmente visualizzati da occhio per agevolare successive fasi del protocollo. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 1 ora, poi conservare indefinitamente a 4 ° C. </li></ol> 2. Decellularization del tessuto cardiaco <ol><li> Fai la soluzione al 10% di NaOH acquosa fresca con 10 g di NaOH pellet / 100 ml dH 2 O. ATTENZIONE: Le soluzioni NaOH sono corrosivi e possono causare ustioni alcali, indossano i guanti. </li><li> Risciacquare il tessuto in DH 2 O. </li><li> Incubare in soluzione al 10% di NaOH a temperatura ambiente per 6 - 10 giorni (fino a cambiamenti del tessuto da bruno-rossastro a biancastro o bianco). </li><li> Risciacquare in DH 2 O fino a quando il tessuto diventa trasparente. </li><li> Immergere il tessuto in acido tannico 1% per 4 ore a temperatura ambiente. Usare 1 ml 5% soluzione di riserva per 4 ml dH 2 O. ATTENZIONE: L&#39;acido tannicoè un forte irritante, indossare guanti. </li><li> Risciacquare in DH 2 O durante la notte. </li></ol> 3. Osmication e disidratazione del tessuto cardiaco (in Cappa aspirante per la sicurezza) <ol><li> Fare una soluzione di 0,2 m stock di tampone cacodilato di sodio con 21,4 g cacodilato di sodio, cloruro di calcio e 10,0 g 450 ml dH 2 O. Mix, quindi aggiungere acido cloridrico come necessario per aggiustare il pH a 7,4. Qs a 500 ml con dH 2 O. ATTENZIONE: cacodilato di sodio e acido cloridrico sono tossici, indossare guanti e lavorare in una cappa aspirante. </li><li> Fai la soluzione di riserva 2% acquosa di tetrossido di osmio in cappa per la sicurezza sciogliendo 1 g di cristallo tetrossido di osmio in 50 ml di dH 2 O. ATTENZIONE: tetrossido di osmio è un pericolo di inalazione grave; la fissazione di vapore di mucose o bulbi oculari è possibile, quindi, gestire solo nella cappa con i guanti. Si raccomanda un paraspruzzi. </li><li> Risciacquare il tessuto in 0.1 M tampone cacodilato di sodio (mescolare soluzione madre 1: 1 con DH <sub&gt; 2 O) per 5 minuti su dei rotatori (o agitazione). </li><li> Ripetere il passaggio precedente per due volte, per un totale di tre risciacqui tampone. </li><li> Immergere il tessuto in 1% tetrossido di osmio in 0.1 M tampone cacodilato di sodio (mescolare cacodilato magazzino di sodio e magazzino tetrossido di osmio 1: 1) il rotatore per 1 ora. </li><li> Risciacquare tessuto in 0.1 M tampone cacodilato di sodio 3 volte per 5 minuti ciascuno su rotatore. </li><li> Risciacquare tessuto con concentrazioni crescenti di etanolo (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, e infine 100%) per 15 minuti ciascuno in rotatore. </li></ol> 4. Sezione trasversale Preparazione della superficie per SEM <ol><li> Trasferire il tessuto in 100% di etanolo ad un piatto piano Petri contenente anche il 100% di etanolo. </li><li> Tenere due lamette molto taglienti tale che gli appartamenti di lati sono in contatto tra loro e taglienti croce per formare due lati di un triangolo equilatero sopra il campione. Per eseguire ciò, utilizzare la mano sinistra per posizionare una lama sul lato destro del campione etaglio verso sinistra. Al tempo stesso, utilizzare la mano destra per posizionare la seconda lama all&#39;estrema sinistra del campione e fetta verso destra. Così, le lame vengono fatti scorrere uno contro l&#39;altro da direzioni opposte per fare un solo taglio liscio. </li><li> Infilare lati lama piatta contro l&#39;altro per effettuare un taglio molto pulito del campione con una distorsione minima o forza strappo, preferibilmente esponendo il maggior superficie possibile senza danneggiare il campione. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per ogni campione per esporre le più pulite possibili superfici di sezione per l&#39;esame nel SEM. </li></ol> 5. punti critici di essiccazione (CPD) di tessuto cardiaco <ol><li> Utilizzare una spatola o pinzette per trasferire tessuto portacampioni dell&#39;essiccatore punto critico (CPD), assicurando che il tessuto rimanga in 100% di etanolo in ogni momento. Assicurarsi che il supporto è immerso in etanolo e che il trasferimento è realizzato con tessuto esposto all&#39;aria per non più di pochi secondi. </li><li> Operare CPD per noiil manuale di ER per completare 3 spurgo-e-fill cicli di sostituire l&#39;etanolo con anidride carbonica liquida. </li><li> Operare CPD per il manuale utente per raggiungere il punto di essiccazione critica dei campioni e restituirli alla pressione atmosferica con ventilazione controllata di CO 2. </li></ol> 6. Montaggio dei campioni Cuore tessuto per SEM <ol><li> Preparare un campione stub SEM per ciascun campione, aderendo una linguetta adesiva carbonio alla superficie superiore dello stub alluminio. </li><li> Con l&#39;ausilio di uno stereomicroscopio, aderire accuratamente il campione nella scheda adesiva con la superficie sezione di interesse rivolto verso l&#39;alto (lontano dalla scheda, visibile), e il più vicino possibile parallelo al piano della superficie del campione stub. Non sonda o toccare la superficie di interesse. </li><li> Break a bastoncino di legno per ottenere una spazzola conica, ideale per l&#39;applicazione della vernice. Applicare argento o vernice carbonio alla base e ai lati del campione, per migliorare l&#39;aderenza allo stub. </li><li> Estendere una linea molto sottile di argento o carbonio vernice fino ad un bordo della superficie di interesse, per fornire un percorso di carica dalla superficie di interesse per terra. </li><li> Applicare 2 o 3 piccoli tocchi di argento o vernice carbonio intorno al perimetro della scheda di carbonio, per fornire un percorso conduttivo dalla superficie scheda carbonio allo stub in metallo e quindi a massa. </li><li> Lasciare vernice conduttiva asciugare per due ore. </li><li> Operare polverizzazione dispositivo a induzione per il manuale dell&#39;utente ad applicare un rivestimento relativamente pesante (target range del 30 - 40 nm) di lega di oro-palladio o oro. Camera della pompa campione di circa 0,1 mbar; impostare timer per 40 sec. la valvola insieme aperto a 8:00 posizione (moderato flusso di gas Argon). Premere Start per avviare rivestimento sputtering a 30 mA. Viola scarica luminescente dovrebbe essere visibile nella camera campione. </li></ol> 7. SEM L&#39;esame dei campioni di tessuto di cuore <ol><li> Eseguire microscopia elettronica a scansione relativamente bassa tensione di accelerazione per minimizzare l&#39;imaging pROBLEMI connessi ad una cattiva dissipazione carica nel campione (in carica). Suggerita condizione di imaging iniziali sono: 5 kV tensione di accelerazione, distanza di lavoro di 10 mm. </li><li> Con l&#39;assistenza di un operatore esperto, impiego aumentato distanza di lavoro di estendere la profondità di campo in condizioni di imaging che richiedono attenzione di fibre in più piani focali, o fibre si estendono per lunghezza considerevole nella dimensione z. <ol><li> Per il microscopio usato qui (vedi Tabella dei Materiali), in l&#39;accesso all&#39;interfaccia utente della scheda di navigazione in alto a destra. </li><li> Accedere alla scheda Coordinate dal menu stage. Per aumentare la distanza di lavoro, immettere un valore più grande in millimetri per coordinata Z poi clicca sul vai alla scheda di passare alla fase di esempio per la distanza di lavoro inserito. </li></ol></li><li> Con l&#39;assistenza di un operatore esperto, impiegare campione inclinazione e rotazione per posizionare la superficie di interesse ortogonale al fascio di elettroni. Ulteriori inclinazione di 10 a 30 degrSEO da questa posizione può migliorare l&#39;osservazione e la documentazione della struttura a matrice. <ol><li> Per il microscopio usato qui (vedi Tabella dei Materiali), nell&#39;interfaccia utente, cliccare e tenere premuto il tasto destro del mouse, quindi far scorrere a sinistra oa destra per mettere a fuoco il campione vicino alla periferia del piano superficie preparata di interesse, notando la distanza di lavoro focalizzato . </li><li> Navigare con il Manuale joystick interfaccia utente per spostare vicino al bordo opposto della superficie e ripetere messa a fuoco. Se la distanza di lavoro non è approssimativamente uguale alla prima posizione, il campione di inclinazione per raggiungere un accordo approssimativo in entrambe le posizioni utilizzando la scheda Coordinate del menu stage (vedi 7.2) e immettere un valore di inclinazione del T di coordinate. </li><li> Ruota esemplare novanta gradi (inserire il valore in R campo coordinate) e ripetere il processo fino a quando tutte le posizioni sono focalizzate approssimativamente alla stessa distanza di lavoro. Nota: la pressione variabile SEM può essere impiegato per migliorare la dissipazione di caricase disponibile. Alto vuoto è la modalità di funzionamento standard per la microscopia elettronica a scansione. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Preparazione della superficie trasversale sezione è la fase più critica durante il protocollo. Per preservare struttura fine, i campioni devono rimanere disidratati in etanolo al 100% in ogni momento fino introdotto al processo di essiccazione punto critico. Pertanto, il taglio dei provini per ottenere superfici per l&#39;esame EM deve essere fatto, mentre i campioni sono immerso in etanolo in un piatto piano. E &#39;anche fondamentale che la superficie esposta non viene toccato o sondato durante la successiva manipolaz...

La fibrosi interrompe la normale rete di collagene miocardico, che è fondamentale per le normali funzioni meccanicistiche dei cardiomiociti 1,2, nonché per la comunicazione intercellulare, la segnalazione intracellulare e la sopravvivenza cellulare 3. Lo sviluppo della fibrosi è un fattore determinante della funzione cardiaca e il rimodellamento fibrotico dell'interstizio cardiaco derivante da una varietà di eziologie porta ad un aumento della rigidità ventricolare sinistra e della disfunzione diastolica 4. La fibrosi miocardica può anche portare ad aritmie e, indipendentemente dal fatto che la progressione del rimodellamento fibrotico sia un fenomeno generale o locale, è altamente associata a una prognosi infausta nei pazienti con cardiomiopatia ischemica e non ischemica 5. Allo stesso modo, l'assenza di fibrosi miocardica è un forte predittore del recupero funzionale ventricolare e della sopravvivenza a lungo termine 6. 
Il segno distintivo della fibrosi è la deposizione di collagene in eccesso, che ha la resistenza alla trazione dell'acciaio 7 e può influenzare negativamente la funzione dei cardiomiociti su più livelli. Le forze meccaniche derivanti da una matrice eccessivamente collagenica possono portare all'atrofia dei cardiomiociti 8,9, alla rigidità passiva dei tessuti 10, alla rigidità miocardica indotta dalla contrazione tonica 11-13 e alla riduzione dell'apporto di ossigeno alla restante popolazione di cardiomiociti. L'accoppiamento gap junction di cardiomiociti e myoFbs può anche compromettere le caratteristiche elettriche del cuore, creando un rischio maggiore per lo sviluppo di aritmie 14-16. La fibrosi perivascolare altera la reattività vasomotoria delle arterie coronarie intramurali e delle arteriole 17 e contribuisce al restringimento luminale che riduce l'apporto di ossigeno e quindi la sopravvivenza dei cardiomiociti 17-22. Il rimodellamento fibrotico ed elettrico patogeno, derivante da un sito iniziale di lesione ischemica o di squilibrio energetico, progredisce inevitabilmente verso l'insufficienza cardiaca. 
La necrosi dei cardiomiociti avvia la risposta fibrotica e il successivo rimodellamento fibrotico avverso può verificarsi indipendentemente dall'eziologia. Trovare un modo per controllare la fibrosi cardiaca sarebbe clinicamente utile per il trattamento delle cardiomiopatie ischemiche e idiopatiche, della cardiopatia ipertensiva, della cardiomiopatia ipertrofica, della cardiopatia valvolare e delle distrofinopatie 23-42. Indipendentemente da come inizia il processo della malattia fibrotica, i fattori profibrotici solubili possono attraversare lo spazio interstiziale e provocare l'attivazione di fibroblasti interstiziali e avventiziali in siti lontani dalla cicatrice fibrotica iniziale, creando un effetto a cascata che alla fine porta all'insufficienza cardiaca. Lo scenario ottimale sarebbe quello di sfruttare il processo fibrillogenico utilizzando una terapia mirata che può essere applicata durante la fase ipertrofica compensativa della cardiomiopatia prima che progredisca verso l'insufficienza della pompa sistolica, l'insufficienza cardiaca diastolica o altri esiti allo stadio terminale. L'obiettivo finale sarebbe quello di invertire la fibrosi in modo che i cardiomiociti morti possano essere sostituiti e la funzione cardiaca ripristinata completamente. 
L'importanza della matrice è ampiamente compresa, ma i metodi per studiare la matrice sono limitati principalmente a misurazioni quantitative dei principali componenti strutturali, in particolare il collagene, e i livelli relativi di diverse proteine della matrice e della matricellulare. Questo protocollo evidenzia una tecnica raramente utilizzata che è utile per valutare le differenze qualitative nella matrice cardiaca. Questa tecnica è stata recentemente utilizzata per confrontare e contrastare le differenze fondamentali nelle matrici cardiache di diverse eziologie di malattie cardiache (negli espianti umani), per esaminare i cuori di suini post-infartuati trattati con l'isoforma del fattore di crescita gliale (GGF) della neuregulina-1β, rispetto agli animali non trattati 43, e per sondare le differenze nelle matrici dei tessuti cardiaci da mdx topi (un modello animale comunemente usato di distrofia muscolare di Duchenne) di età diverse e confrontati con i controlli wild-type. Questa tecnica è stata introdotta per la prima volta dai dottori Caulfield e Borg nel 1979 44, ma da allora pochi studi hanno impiegato questa potente tecnica 45-47, reintrodotta qui con solo lievi modifiche. Questa metodologia è un prezioso strumento di ricerca, perché fornisce informazioni qualitative sull'ultrastruttura della matrice extracellulare che altrimenti potrebbero essere trascurate quando si misura semplicemente il contenuto dei componenti della matrice e/o il livello di fibrosi.

<table><tbody><tr><td>Scienze della microscopia elettronica</td> <td>del cloruro di calcio</td><td>12340</td><td>100 g</td></tr><tr>Scienze della <td>microscopia elettronica</td><td>adesiva al carbonio</td><td>12664</td><td>30 g</td></tr><tr><td>Linguette adesive al carbonio Scienze</td> della <td>microscopia elettronica</td><td>77825</td><td>ordine per adattarsi ai tronchetti</td></tr><tr><td>Lame di rasoio a doppio taglio Acciaio inossidabile</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td>250/pkg</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Elettronico Microscopia Scienze</td><td>15055</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Gluteraldeide, soluzione al 50%</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>16310</td><td>grado EM, distillazione purificata</td></tr><tr><td>Acido cloridrico Microscopia elettronica</td><td>Scienze</td><td>16760 o 16770</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Fosfato monosodico NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251-250G</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Osmio Microscopia elettronica a tetrossido</td><td></td><td>Scienze 19100</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Microscopia elettronica</td><td>adesiva conduttiva argento</td><td>Scienze 12686-15</td><td>15 g</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Acido tannico, 5% Acquoso&nbsp;</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>21702-5</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Triidrato di sodio cacodilato Microscopia</td><td>elettronica Scienze</td><td>12300</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Lega d'oro-palladio o</td><td>sistemi di raffinazione dell'oro, Inc.</td><td>varia</td><td>in base alla marca e al modello del rivestimento per polverizzazione catodica</td></tr><tr><td>Essiccatore per punti critici</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>850</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori in legno semplice</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-102</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 250 SEM ambientale FEI</td><td></td><td>Q250 SEM</td><td></td></tr><tr><td>Sputter Coater</td><td>Cressington Scientific Instruments Ltd.</td><td>Modello 108</td><td></td></tr><tr><td>Stub di campioni SEM in alluminio</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>75220-12</td><td>specifiche per il miscroscopio</td></tr></tbody></table>

scanning electron microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

La fibrosi è un componente di tutte le forme di malattie cardiache indipendentemente dall'eziologia, e mentre sono stati fatti molti progressi nel campo della biologia della matrice cardiaca, ci sono ancora grandi lacune legate a come si forma la matrice, come differiscono il rimodellamento fisiologico e patologico e, soprattutto, come la dinamica della matrice potrebbe essere manipolata per promuovere la guarigione e inibire la fibrosi. Attualmente non esiste un'opzione terapeutica per il controllo, la prevenzione o l'inversione della fibrosi cardiaca. Parte del motivo è probabilmente l'enorme complessità della formazione di cicatrici cardiache, come quella che si verifica dopo l'infarto del miocardio per sostituire immediatamente i cardiomiociti morti o morenti. La matrice extracellulare stessa partecipa al rimodellamento attivando le cellule residenti e anche aiutando a guidare le cellule infiltranti verso la lesione defunta. La matrice è anche una sorta di deposito per le proteine matricellulari che sono cruciali per il normale turnover della matrice, così come per la segnalazione fibrotica. È stato inoltre dimostrato che la matrice svolge un ruolo elettromeccanico nel tessuto cardiaco. La maggior parte delle tecniche per la valutazione della fibrosi non sono di natura qualitativa, ma forniscono piuttosto risultati quantitativi utili per confrontare due gruppi ma che non forniscono informazioni relative alla struttura della matrice sottostante. Di seguito è evidenziata una tecnica per visualizzare l'ultrastruttura della matrice cardiaca. La microscopia elettronica a scansione di tessuto cardiaco decellularizzato rivela notevoli differenze nella struttura che altrimenti potrebbero sfuggire utilizzando i tradizionali metodi di ricerca quantitativa.

La tecnica evidenziata è stata applicata ai tessuti cardiaci da un inutilizzato trapianto di cuore umano donatore (figura 1), i tessuti espiantati da pazienti sottoposti a trapianto, cuori da wild-type e topi distrofici (figura 3), e in campioni di cuore post-infartuati da un porco modello di danno cardiaco (Figura 2). Come mostrato in figura 1, la matrice cardiaco umano è un tessuto intricata di proteine ​​reticolate ch...

Qui viene mostrato un metodo per visualizzare l'ultrastruttura della matrice extracellulare in tessuti cardiaci decellularizzati.

Scanning Electron Microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

L'obiettivo generale di questo metodo è visualizzare la struttura della matrice cardiaca in assenza di cellule o altri materiali non matriciali. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della fibrosi, in particolare in che modo le differenze nel contenuto della matrice possano influenzarne l'organizzazione, e come questi cambiamenti possano influire su diverse cardiomiopatie o altre malattie fibrotiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una visione qualitativa della matrice che può essere utilizzata per integrare misure quantitative.I dottori Galindo e Sawyer hanno avuto per primi l'idea di utilizzare questa tecnica dopo aver scoperto che il trattamento regolare di suini post-infarto provocava cambiamenti nell'espressione genica simili ai cambiamenti nel contenuto della matrice dopo il trattamento. Le persone alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà se non hanno esperienza precedente nella preparazione di campioni per microscopia elettronica a scansione (SEM), a causa delle abilità motorie fini richieste. Il campione di tessuto deve essere abbastanza grande da essere facilmente visibile e conservato in soluzione di glutaraldeide al quattro percento a quattro gradi Celsius.Rimuovere il tessuto dal congelatore e sciacquarlo con acqua distillata. Successivamente, immergere il tessuto in una soluzione al 10 percento di idrossido di sodio, preparata al momento da pastiglie in acqua. Assicurarsi di adottare le opportune precauzioni.Mantenere il tessuto nella soluzione di idrossido di sodio per sei-dieci giorni a temperatura ambiente. Procedere quando il colore del tessuto diventa bianco sporco o bianco. Quindi, risciacquare il tessuto con acqua distillata fino a quando non diventa trasparente.Successivamente, indossare i guanti e immergere il tessuto in acido tannico all'uno percento per quattro ore a temperatura ambiente. Dopo il bagno in acido tannico, risciacquare il tessuto in acqua distillata per tutta la notte. In preparazione, sotto cappa e indossando i guanti, preparare una soluzione madre di tampone sodico cacodilato 0,2 molare e una soluzione madre acquosa di tetrossido di osmio al due percento.Utilizzare una protezione anti-schizzi, poiché il tetrossido di osmio rappresenta un grave rischio per inalazione. Preparare ora una diluizione 0,1 molare del buffer cacodilato di sodio e incubare il tessuto in esso per cinque minuti con agitazione delicata. Cambiare il buffer due volte per lavare il tessuto un totale di tre volte con cacodilato di sodio.Successivamente, preparare una miscela uno a uno del cacodilato di sodio stock e dell'osmio tetraossido stock. Incubare il tessuto nella nuova miscela su un agitatore rotante per un'ora. Successivamente, riposizionare il tessuto nel cacodilato di sodio 0,1 M e incubare con agitazione delicata per cinque minuti.Cambiare questa soluzione due volte nell'arco di 15 minuti. Successivamente, disidratare il tessuto utilizzando una serie di bagni di etanolo con concentrazioni crescenti. Lasciare il tessuto in ammollo per 15 minuti in ciascun bagno con agitazione delicata.Successivamente, trasferire il tessuto e la soluzione in una capsula di Petri poco profonda riempita con etanolo al 100 percento. Poi, con attenzione, tenere due lamette molto affilate in modo che le superfici piane dei lati siano a contatto tra loro e i bordi taglienti si incrocino formando due lati di un triangolo equilatero sopra il campione. Ora, utilizzare la mano dominante per posizionare la seconda lametta all'estrema sinistra del campione e tagliare verso destra.Pertanto, far scorrere le lame l'una contro l'altra da direzioni opposte per effettuare un singolo taglio uniforme con una deformazione o forza di strappo minima. L'obiettivo è esporre la superficie più ampia possibile senza danneggiare il campione. Ripetere il procedimento fino a quando non sono state preparate un numero sufficiente di sezioni trasversali soddisfacenti per l'esame al microscopio elettronico a scansione (SEM).Utilizzando una spatola o delle pinzette, trasferire il tessuto nel portacampioni del CPD, mantenendolo immerso in etanolo al 100 percento. Il tessuto non deve essere esposto all'aria per più di pochi secondi. Utilizzare il CPD per sostituire l'etanolo con anidride carbonica liquida ed eseguire il ciclo di essiccazione come indicato dal produttore.Successivamente, preparare un supporto per campione al microscopio elettronico a scansione (SEM) per ciascun campione. Applicare un disco adesivo al carbonio sulla superficie superiore del supporto in alluminio. Sotto uno stereomicroscopio, fissare con attenzione il campione sul disco adesivo in modo che la superficie della sezione trasversale d'interesse sia rivolta verso l'alto, lontana dal disco, e il più possibile planare rispetto alla superficie del supporto.Non esaminare né toccare la superficie di interesse. Per i campioni più piccoli e difficili, spezzare il bastoncino di legno per usarlo come spatola. Inoltre, lavorare su un foglio di carta filtro di grandi dimensioni per evitare di perdere un campione caduto.Per un'adesione migliore, utilizzare un bastoncino applicatore rotto per creare un pennello conica e applicare una vernice di argento o carbonio alla base e ai lati del campione. Estendere una linea molto sottile di vernice fino a un bordo della superficie di interesse. Ciò creerà un percorso di carica dalla superficie di interesse verso massa.Quindi, applicare due o tre piccole gocce di vernice lungo il perimetro della linguetta di carbonio per creare un percorso conduttivo dalla superficie della linguetta al supporto metallico. Questo funge da massa. Mettere da parte il campione e lasciare asciugare la vernice conduttiva per due ore.Dopo l'essiccazione, utilizzare un rivestitore a sputtering per applicare un rivestimento relativamente spesso di lega oro-palladio o oro sul campione. Si desidera uno strato dello spessore di 30-40 nanometri. Eseguire la microscopia elettronica a scansione a una tensione di accelerazione relativamente bassa per minimizzare i problemi associati a una scarsa dissipazione della carica nel campione.Utilizzare la modalità a pressione variabile, se disponibile. Innanzitutto, aumentare la distanza di lavoro per ottenere una profondità di campo sufficiente a mettere a fuoco le fibre nella dimensione Z. A tale scopo, aprire la scheda Navigazione in alto a destra.Quindi, accedere alla scheda Coordinate dal menu della piattaforma. Inserire un valore più elevato per la coordinata Z, ad esempio 20 millimetri. Infine, premere la scheda Vai a per eseguire la modifica.Successivamente, posizionare la superficie di interesse ortogonalmente al fascio di elettroni. Fare clic e tenere premuto il pulsante destro del mouse, quindi spostarlo a sinistra o a destra per mettere a fuoco il campione vicino alla periferia del piano superficiale preparato di interesse. Prendere nota della distanza di lavoro a fuoco.Quindi, utilizzando il joystick dell'interfaccia utente manuale, spostare la vista fino al bordo opposto e ripetere il metodo di messa a fuoco. Se la distanza di lavoro è cambiata, inclinare il campione per ottenere un'approssimativa corrispondenza in entrambe le posizioni. Utilizzare la scheda Coordinate del menu Stage e inserire un valore di inclinazione nel campo della coordinata T.Ora ruotare il campione di 90 gradi inserendo questo valore nel campo delle coordinate R. Successivamente, ripetere il processo di inclinazione fino a quando tutte le posizioni sono messe a fuoco a una distanza di lavoro approssimativamente identica. La tecnica descritta è stata applicata a tessuti cardiaci provenienti da un donatore umano per trapianto di cuore non utilizzato.La matrice cardiaca umana è una complessa rete di proteine legate tra loro che presenta un aspetto simile a un alveare in sezione trasversale. Ogni struttura alveolare ha un diametro di circa 40 micron e normalmente circonda un singolo miocita. Quando connesse mediante dischi intercalati, diverse cellule miocardiche possono essere immaginate come un'asta che si estende longitudinalmente attraverso una struttura simile a un tunnel.Oltre a fornire informazioni strutturali, un'analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM) di tessuti descelularizzati può consentire una valutazione qualitativa significativa in risposta a lesioni o forme non lesive di cardiomiopatia, come i tessuti cardiaci infartuati provenienti da suino. In uno studio separato, l'isoforma GGF2 della NRG-1 beta si è rivelata un possibile trattamento terapeutico per l'insufficienza cardiaca. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come preparare un tessuto, in particolare un tessuto cardiaco, per l'analisi al microscopio elettronico a scansione, inclusa la tecnica per esporre la superficie di interesse e per montare il campione.Al termine di questa procedura, altre tecniche come la spettrometria di massa, il sequenziamento dell'RNA e vari altri saggi possono essere utilizzate per misurare le proteine della matrice extracellulare e altre responsabili di fenomeni di segnalazione e di osservazione organizzativa. Inoltre, non dimenticare che l'osmio tetraossido è una sostanza chimica pericolosa, poiché i vapori possono fissarsi sulle membrane mucose. Ricordarsi sempre di lavorare in una cappa aspirante indossando guanti in nitrile e utilizzando un paravento anti-schizzi o il vetro della cappa.

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Biologia

Descriviamo il metodo di prototipo per la produzione di vetrini al microscopio a fluorescenza rivestite con gelatina per la visualizzazione invadopodia-mediata degradazione della matrice. Tecniche di calcolo utilizzando il software disponibile sono presentati per quantificare i livelli risultanti di proteolisi matrice di singole cellule all'interno di una popolazione mista e per gruppi multicellulari che comprende interi campi microscopici.

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

La matrice extracellulare subisce sostanziale rimodellamento durante la guarigione delle ferite, l'infiammazione e tumorigenesi. Vi presentiamo un approccio immunofluorescenza intravitale romanzo per visualizzare le dinamiche di fibrillare come pure componenti della matrice maglia-come con alta risoluzione spaziale e temporale con epifluorescenza o microscopia a due fotoni.

A lungo termine intravitale immunofluorescenza Imaging di tessuto componenti della matrice con Epifluorescenza e due fotoni Microscopia

Questo protocollo descrive una procedura per arricchire le proteine ECM da tessuti o tumori e deglicosilare e digerire i preparati arricchiti con ECM in peptidi per analizzare la loro composizione proteica mediante spettrometria di massa.

Arricchimento della matrice extracellulare proteine ​​da tessuti e digestione in Peptidi per l&#39;analisi Spettrometria di Massa

Vi presentiamo un protocollo per ottenere matrici derivati ​​dalle cellule ricche di proteine ​​della matrice extracellulare, utilizzando Crowders macromolecolari (MMC). Inoltre, vi presentiamo un protocollo che incorpora MMC nella generazione di pelle co-coltura organotipica 3D, che riduce i tempi di cultura, pur mantenendo la maturità di costrutto.

Migliorare 2D e 3D della pelle<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli con Macromolecole affollamento

La matrice extracellulare svolge un ruolo importante nella definizione del microambiente delle cellule e nella modulazione del comportamento e del fenotipo cellulare. Descriviamo un metodo rapido per l'isolamento di matrice extracellulare di derivazione cellulare, che può essere adattato a diverse scale per studi microscopici, biochimici, proteomici o funzionali.

A Rapid, metodo scalabile per l&#39;isolamento, studio funzionale, e analisi di Cell-derivati ​​matrice extracellulare

Trappole extracellulari del macrofago sono un'entità recentemente descritta. In questo articolo si concentrerà sui metodi di microscopia confocale e come essi sono visualizzati in vitro e in vivo da campioni del polmone.

Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale

L'obiettivo del presente protocollo è la produzione delle fibre di intera tabella extracellulare mirati per la riparazione della ferita che sono adatti per la valutazione preclinica come parte di un impianto di impalcatura rigenerativa. Queste fibre sono prodotte dalla cultura dei fibroblasti su membrane a fibra cava ed estratte dalla dissoluzione delle membrane.

Produzione di fibre di matrice extracellulare tramite fibra cava sacrificale membrana Cell Culture

Questo protocollo presenta un metodo per la decellularizzazione e la successiva formazione di idrogel di cuscinetti di grasso mammari a seguito di irradiazione ex vivo.

Studiare i normali effetti di radiazione dei tessuti utilizzando idrogel a matrice extracellulare

Descriviamo la preparazione di nastri di sezioni seriali e la loro raccolta su un ampio supporto di trasferimento per l'uso come campioni di tomografia array, insieme a procedure di imaging automatizzate in un microscopio elettronico a scansione. Il protocollo consente lo screening, il recupero e l'imaging mirato di eventi locali rari e l'acquisizione di grandi volumi di dati.

Flusso di lavoro di tomografia ad array per l'acquisizione mirata di informazioni sul volume utilizzando la microscopia elettronica a scansione

Il presente protocollo ottimizza i metodi di perfusione/decellularizzazione del fegato in situ e microscopia a due fotoni per stabilire una piattaforma affidabile per visualizzare la dinamica del rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) durante la steatoepatite non alcolica (NASH).

Imaging 3D della matrice extracellulare del fegato in un modello murino di steatoepatite non alcolica

Proponiamo un protocollo per valutare la rigenerazione ossea a vari livelli gerarchici. Questo approccio multimodale consente un'analisi strutturale su diverse scale di lunghezza, affrontando efficacemente le sfide nella preparazione del campione. Fornisce inoltre un flusso di lavoro affidabile per valutare l'efficacia dei biomateriali nel promuovere la rigenerazione ossea.

Approccio multimodale per valutare la rigenerazione ossea e le prestazioni dell'impalcatura

Impara la microscopia elettronica a scansione di tessuto cardiaco decellularizzato per visualizzare la matrice extracellulare. Questa tecnica fornisce informazioni qualitative sulla struttura della matrice nelle cardiomiopatie fibrotiche.

Scanning Electron Microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare

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