Name: Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprenda a gerar células dendríticas tolerogênicas e maduras a partir de monócitos para pesquisa imunológica e desenvolvimento de vacinas. Este método permite estudar perfis metabólicos e apresentação de antígenos.

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Este trabalho foi financiado pela Agência de Ciência, Tecnologia e Reasearch de financiamento principal (para JEC).

<ol><li>Jolles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paul+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Paul Langerhans.</a> J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li>
<li>Steinman, R. M., Swanson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocytic+activity+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The endocytic activity of dendritic cells.</a> J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).</li>
<li>Hemmi, H., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+and+the+function+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Immunol+Allergy%22%5BJournal%5D)">TLR signalling and the function of dendritic cells.</a> Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).</li>
<li>Mueller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+maintaining+peripheral+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms maintaining peripheral tolerance.</a> Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+phagocytosed+cellular+fragments+on+the+major+histocompatibility+complex+class+II+products+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells.</a> J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B70%2FB7-2+is+identical+to+CD86+and+is+the+major+functional+ligand+for+CD28+expressed+on+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells.</a> J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).</li>
<li>Paavonen, J., Lehtinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+human+papillomavirus+and+other+sexually+transmitted+agents+in+the+etiology+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer.</a> Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).</li>
<li>Ohtani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+target+of+rapamycin+and+glycogen+synthase+kinase+3+differentially+regulate+lipopolysaccharide-induced+interleukin-12+production+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells.</a> Blood. 112 (3), 635-643 (2008).</li>
<li>Wilde, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+renal+biopsies+of+patients+with+ANCA-associated+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis.</a> Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).</li>
<li>Al-Hello, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enterovirus+strain+isolated+from+diabetic+child+belongs+to+a+genetic+subcluster+of+echovirus+11%2C+but+is+also+neutralised+with+monotypic+antisera+to+coxsackievirus+A9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9.</a> J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), 74-80 (2010).</li>
<li>Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+blood+CD11c%28%2B%29+dendritic+cells+and+monocyte-derived+dendritic+cells+differ+in+their+ability+to+stimulate+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes.</a> Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).</li>
<li>Reynolds, G., Haniffa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Mouse+Mononuclear+Phagocyte+Networks%3A+A+Tale+of+Two+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human and Mouse Mononuclear Phagocyte Networks: A Tale of Two Species.</a> Front Immunol. 6, (2015).</li>
<li>Jefford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+comparison+of+DCs+generated+in+vivo+with+Flt3+ligand+or+in+vitro+from+blood+monocytes%3A+differential+regulation+of+function+by+specific+classes+of+physiologic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli.</a> Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).</li>
<li>Menck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+double+gradient+centrifugation+and+their+differentiation+to+macrophages+in+teflon-coated+cell+culture+bags%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags.</a> J Vis Exp. (91), (2014).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+human+granulocyte+and+monocyte+isolation+procedures+on+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies.</a> Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Faresjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+useful+guide+for+analysis+of+immune+markers+by+fluorochrome+%28Luminex%29+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique.</a> Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).</li>
<li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Defawe, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+qualification+of+a+multiplex+bead+array+to+assess+cytokine+and+chemokine+production+by+vaccine-specific+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells.</a> J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+self-healing+Langerhans+cell+histiocytosis+with+pulmonary+involvement%3A+spontaneous+regression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Assoc+Thai%22%5BJournal%5D)">Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression.</a> J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).</li>
<li>Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dendritic+cells+from+human+bone+marrow+mononuclear+cells%3A+advantages+for+clinical+application+in+comparison+to+peripheral+blood+monocyte+derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells.</a> Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).</li>
<li>Felzmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+enrichment+from+leukapharesis+products+for+the+generation+of+DCs+by+plastic+adherence%2C+or+by+positive+or+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection.</a> Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).</li>
<li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+%28Elutra%29+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).</li>
<li>Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+soluble+antigen+by+cultured+human+dendritic+cells+is+maintained+by+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+plus+interleukin+4+and+downregulated+by+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).</li>
<li>Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Langerhans+cell+histiocytosis+of+the+lacrimal+gland+in+an+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult.</a> Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).</li>
<li>Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaper+dermatitis%3A+a+review+and+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Diaper dermatitis: a review and update.</a> Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).</li>
<li>Gebhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cutaneous+Rosai-Dorfman+disease+refractory+to+imatinib+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy.</a> Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).</li>
<li>Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neural+tyrosine+hydroxylase%2C+via+modulation+of+endocrine+pancreatic+precursors%2C+is+required+for+normal+development+of+beta+cells+in+the+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas.</a> Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).</li>
<li>Pellacani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+melanoma+types+based+on+reflectance+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Distinct melanoma types based on reflectance confocal microscopy.</a> Exp Dermatol. 23 (6), 414-418 (2014).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+involvement+of+Langerhans+cell+histiocytosis+in+children--imaging+findings+of+computed+tomography%2C+magnetic+resonance+imaging+and+magnetic+resonance+cholangiopancreatography%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Radiol%22%5BJournal%5D)">Hepatic involvement of Langerhans cell histiocytosis in children--imaging findings of computed tomography, magnetic resonance imaging and magnetic resonance cholangiopancreatography.</a> Pediatr Radiol. 44 (6), 713-718 (2014).</li>
<li>Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-resistant+swelling+of+the+upper+eyelid+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologe%22%5BJournal%5D)">Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood.</a> Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).</li>
<li>Haidinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+role+of+mammalian+target+of+rapamycin+in+human+dendritic+cell+function+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A versatile role of mammalian target of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation.</a> J Immunol. 185 (7), 3919-3931 (2010).</li>
<li>Macedo, C., Turquist, H., Metes, D., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+properties+of+rapamycin-conditioned+monocyte-derived+dendritic+cells+and+their+role+in+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Res%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory properties of rapamycin-conditioned monocyte-derived dendritic cells and their role in transplantation.</a> Transplant Res. 1 (1), 16(2012).</li>
<li>Fischer, R., Turnquist, H. R., Taner, T., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rapamycin+in+the+induction+of+tolerogenic+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Exp+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Use of rapamycin in the induction of tolerogenic dendritic cells.</a> Handb Exp Pharmacol. 188 (188), 215-232 (2009).</li>
<li>Nicolette, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+for+active+immunotherapy%3A+optimizing+design+and+manufacture+in+order+to+develop+commercially+and+clinically+viable+products%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products.</a> Vaccine. 25, 47-60 (2007).</li>
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<li>Paananen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+biological+analysis+of+echovirus+9+strain+isolated+from+a+diabetic+child%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Molecular and biological analysis of echovirus 9 strain isolated from a diabetic child.</a> J Med Virol. 69 (4), 529-537 (2003).</li>
<li>HC, O. N., Wilson, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+with+in+vitro+production+of+dendritic+cells+using+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).</li>
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<li>Alarcon, C., Serna, J., Perez-Villamil, B., de Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+differentially+regulated+processing+of+proinsulin+in+developing+chick+pancreas%2C+liver+and+neuroretina%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis and differentially regulated processing of proinsulin in developing chick pancreas, liver and neuroretina.</a> FEBS Letters. 436 (3), 361-366 (1998).</li>
<li>Jekunen, A. P., Kairemo, K. J., Paavonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+Hand-Schuller-Christian+syndrome+by+a+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging of Hand-Schuller-Christian syndrome by a monoclonal antibody.</a> Clin Nucl Med. 22 (11), 771-774 (1997).</li>
<li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell metabolism.</a> Nat Rev Immunol. 15 (1), 18-29 (2015).</li>
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As taxas de acesso aberto para este artigo foram fornecidas pela Agilent Technologies.

Este artigo descreve um método para gerar a partir de monócitos moDCs imaturos, moDCs tolerogênicas e moDCs maduros. As etapas importantes neste protocolo são discutidos em detalhe nos parágrafos seguintes. É importante notar que o sangue periférico humano é usado como um material de partida neste protocolo e precauções universais para o manuseamento de sangue humano deve ser praticada. Embora seja tecnicamente viável para derivar DCs de medula óssea em seres humanos 24, a diferenciação in vitro de DC células encontradas no sangue periférico é o preferido devido à disponibilidade de sangue periférico em relação à medula óssea. Entre as células encontradas no sangue periférico, células e monócitos CD34 + hematopoiéticas estaminais são normalmente usados ​​para a geração in vitro de DCs. CD34 hematopoiético + stem células são cultivadas com GM-CSF e TNF-α para derivar subconjuntos CD1a + e CD14 +, que são então ainda mais diferenciado em Langerhanscomo as células dendríticas e as células. Por outro lado, os monócitos são cultivados em GM-CSF e IL-4 para gerar moDCs imaturos. Vários protocolos são utilizados para o enriquecimento de monócitos de sangue periférico; por exemplo, por aderência a placas de plástico, de elutriação e kits de isolamento 25, 26 As vantagens do protocolo de adesão são mínimo de danos às células e de custo relativamente eficaz no entanto célula pureza pode ser comprometida.; e um passo extra é necessária para separar as células para outras experiências. Elutriação é uma técnica que separa as células com base no seu tamanho e densidade. As vantagens da elutriação e a viabilidade celular são monócitos pode ser prontamente utilizado para outras experiências; No entanto, esta técnica é limitada pela disponibilidade de um elutriator e a incapacidade para separar diferentes populações de células (células T e monócitos) com parâmetros de sedimentação semelhantes. Comercialmente kits de isolamento disponíveis utilizam microesferas magnéticas para selecionar positiva ouseleccionar negativamente a população de monócitos. Alguns protocolos são desviadas para o isolamento de monócitos usando a seleção negativo como os monócitos isolados permanecem &quot;intocados&quot; (não vinculados por marcadores ou microesferas). Neste protocolo, contas CD14 foram usadas para monócitos humanos selecione positivos de PBMC. CD14 não tem um domínio citoplásmico e a ligação do anticorpo a CD14 não desencadear a transdução de sinal. Além disso, as microesferas irá separar a partir de monócitos após a cultura e, portanto, não impede o processo de diferenciação. Além disso, o CD14 é expresso na maior parte dos monócitos fortemente e fracamente nos neutrófilos e algumas células dendríticas mielóides, por conseguinte, este método de resultados de isolamento na pureza mais elevada de células do que os outros métodos 17. monócitos de sangue podem ser diferenciadas em DCs ou macrófagos e o destino de monócitos depende grandemente do ambiente de citocinas. Neste trabalho, moDCs são gerados pela adição de fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) E interleucina 4 (IL-4) para os monócitos de sangue periférico humano. GM-CSF é necessária para a sobrevivência dos monócitos e IL-4 exerce uma actividade inibidora sobre a diferenciação de macrófagos; e a adição combinatória de GM-SCSF e IL-4 para os monócitos produzem uma percentagem mais elevada de moDCs imaturas em comparação com citocinas individuais 27. Há outros protocolos que geram moDCs por adição de factor de necrose tumoral alfa (TNF-α), interferon alfa (IFN-α) e interleucina 13 (IL-13) para os monócitos de sangue periférico 28, 29, 30. A combinação de GM-CSF e IL-4 foi otimizado na década de 1990 e agora um protocolo aceite que gera DCs imaturas plástico diferenciadas em moDCs imunogénicas ou tolerogênicas e polarizada em Th1, Th2 ou Th17 moDCs promovendo. moDCs imaturas são diferenciadas em moDCs tolerogénicos pela adição de vitamina D3 e dexametasona. Existem vários protocolos para gerar DCs tolerogénicos por exemplo, atravésfactor nuclear kappa B (NF-kB) inibição, activação β-catenina, vitamina D3, dexametasona e Rapamicina 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Embora tanto a vitamina D3 e dexametasona foram relatados para induzir um efeito tolerogénico em DCs, a combinação de vitamina D3 e dexametasona em resultado de uma maior supressão da alloproliferation do que quando são usadas drogas individuais. Portanto, o protocolo existente para a geração de DCs tolerogénico foi modificada para uma combinação de vitamina D3 e dexametasona. Este método está sendo aceito como um modelo para DCs tolerogênicas humanos com uma utilidade terapêutica. É também importante notar que a vitamina D3 e dexametasona reconstituída tem uma vida útil curta. Neste protocolo, lipopolissacáridos (LPS) foi adicionada como um indutor de maturação de DC. moDCs imaturos também pode ser induzida a maturação utilizando cocktail pró-inflamatória:(TNF-α), interleucina 1 beta (IL-1β), Interleucina 6 (IL-6) e prostaglandina E2) ou citoquinas pró-inflamatórias (TNF-a e interferão gama (IFN-Γ)). Cocktail pró-inflamatórias gera moDCs maduras, com funções de alta co-estimuladoras e migratórias mas que produzem níveis relativamente baixos de IL-12 38. TNF-α ou IFN-Γ por si só não é capaz de induzir um fenótipo estável 39 dendrítica. LPS estimula o receptor semelhante a Toll 4 (RST4), medeia a activação da proteína-quinases activadas mitogénio (MAPKs) NF-kB e para induzir a maturação de CD. DC maturação induzida por LPS apresenta uma sobre-regulação de marcadores de maturação de DC (CD83, CD86, HLA-DR) e também levou à produção de IL-12p70. Além disso, esta etapa pode ser ainda modificado para emparelhar com LPS agonistas de TLR3 para produzir DCs maduras para vacinas contra o cancro clínicos. Neste trabalho, DCs tolerogênicas são mostrados para ser resistente a maturação após tratamento com LPS. Estes semi-maduros, como DCs não são imunogênico e não fazer releaSE citocinas pró-inflamatórias 40. As limitações deste protocolo encontram-se no processo de diferenciação. O processo leva 8 dias a partir do dia 0 ao dia 7, a qual coloca uma dificuldade de ser adaptado para análises de elevado rendimento. Uma modificação do protocolo é necessário para encurtar o processo de diferenciação ainda obter números elevados de DCs viáveis ​​nos diferentes estados. Em segundo lugar, as DCs são gerados pela adição de citocinas neste protocolo e estas citocinas não sustentar a população DC por um longo período de tempo. Além disso, as citocinas são utilizadas em concentrações muito mais elevadas do que in vivo e podem resultar no desenvolvimento de vias enviesada que não são fisiologicamente idêntico ao DCs in vivo. Por exemplo, em culturas in vitro de precursores de DC foram mostradas para responder ao GM-CSF, que não é uma citocina essencial para a diferenciação normal DC in vivo 41. No entanto, a estimulação de citocinas pode ser um método útil para geneavaliar um número elevado de DC in vitro para a experimentação. A capacidade de sujeitar essas células geradas a partir deste protocolo para outras análises, como a imunofluorescência, citometria de fluxo, alo estudos de reação e estudos metabólicos aumenta a utilidade deste método. Estes DCs in vitro servir como um bom modelo para melhorar o conhecimento do desenvolvimento DC, maturação e apresentação de antígenos, que é previamente difícil de fazer com os números raros de DCs in vivo. Capacidade DCs &#39;para regular a imunidade imunológica contra a tolerância torna-os candidatos atraentes na terapêutica contra o câncer e doenças auto-imunes 42, 43, 44, 45. DCs imunogénicas gerados neste protocolo pode ser utilizado para melhorar a eficácia de vacinação contra doenças infecciosas e de tumores; enquanto DCs tolerogénicos pode ser usado para controlar as respostas de células T indesejado e prevenir a rejeição após o transplante. o intrincadoequilíbrio entre a imunidade e tolerância depende imensamente sobre o estado de diferenciação DC. diferenciação DC é um programa celular coordenada que é governada por múltiplas vias de sinalização e destino metabólico. Diferentes estados de diferenciação de DC diferem em necessidades bioenergéticos e biossíntese; por exemplo, DCs activadas requerem adaptações metabólicas mais enérgicas importantes para a sobrevivência e migração em comparação com DCs em estado de repouso. É importante notar que a vitamina D3, dexametasona e rapamicina são conhecidos pela sua capacidade de induzir DCs tolerogénicos, têm sido descritas para influenciar o metabolismo DC. Neste trabalho, o metabolismo energético de moDCs de diferentes estados de diferenciação foram caracterizados usando analisadores de fluxo extracelular e moDCs tolerogênicas apresentou o maior maturação plasticidade metabólica e LPS induzida pela diminuição dessa plasticidade. Metabolismo anabólico suporta DCs maturação, enquanto influencia o metabolismo catabólicos tolerogênico DC funciona 46. as DCsgerado a partir deste protocolo pode ser usada para avaliar se a alteração do estado metabólico de DCs ser a chave para a modificação da imunidade e da tolerância em terapêutica. Em conclusão, nós apresentamos um protocolo para a geração de imaturo, tolerogênico e moDCs maduros crucial para estudar funções imunorregulatórios &#39;DCs.

DC foi primeiramente descrita por Paul Langerhans (células de Langerhans) no final do século XIX, como referenciado por Jolles 1 e caracterizado por Ralph Steinman e Zanvil Cohn em 1973 que os reconhecidos como apresentadoras de antígenos células profissionais 2. DCs são encontradas no sangue periférico e na maioria dos tecidos do corpo, especialmente abundante nos tecidos que estão expostos ao ambiente externo, tais como a pele (presente como células de Langerhans) e nos forros do nariz, pulmões, estômago e intestinos, que permitem -los para encontrar antigénios extrínsecos. Imaturo DCs têm capacidade endocítica mas relativamente baixa capacidade de estimular células T 3. Imaturo DCs expressam vários receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) que capturam padrões associados a patógenos moleculares (PAMPs) ou padrões moleculares associados a danos (amortece) 4. sinais de perigo ativando conduzir a maturação em direção DCs imunogênicas embora a auto-moléculas resultar em unresponsivene células Tss e apoptose 5. DCs imunogénicas são caracterizadas pela regulação positiva de moléculas de MHC e moléculas de superfície co-estimuladores e a sua capacidade de células T naive primos 6,7. DCs imaturas também pode ser amadurecido para um estado Treg de indução ou tolerogénico em resposta à vitamina D3 metabolito 1a, 25 (O) 2 D 3 e certos agentes imunossupressores como Interleucina-10 (IL-10), dexametasona e rapamicina 8-9. DCs tolerogénico são caracterizados pela sua expressão de motivos de inibição baseado em tirosina imunorreceptor (ITIMs) contendo receptores da superfície e ligandos. Transdução de sinal de ITIMs contendo membros da família ILT, ILT3 e ILT4 em DCs tolerogênicas inibir alloproliferation e impulsionar a expansão Foxp3 + Treg 10,11. Estas propriedades únicas de DCs tolerogénicos levar a sua profunda potência in vivo, ou seja, a capacidade para induzir a tolerância a enxertos alogénicos durável transplantados e suppress o desenvolvimento de doenças auto-imunes. Tolerogénico DCS pode ser visto, por conseguinte, como um subtipo de DCs maduras polarizado que funcionam na inibição da activação imunitária. Actualmente, existem dois subconjuntos gerais de células dendriticas no sangue periférico humano: DCs plasmocitoides e DCs mielóides 12. DCs circulantes são constituinte rara para menos de 2% dos leucócitos do sangue humano e isto representa uma dificuldade para o isolamento de um número apropriado de DCs para estudar as suas funções imuno-reguladoras. Para superar este problema, monócitos diferenciados DCs são utilizadas como um modelo in vitro para estudo da função de células dendríticas. Estes DCs in vitro têm receptores e funções semelhantes em comparação com DCs in vivo. Comparação detalhada das DCs in vivo e em monócitos derivados DCs in vitro gerado (moDCs) são investigados por outros laboratórios 13, 14, 15. Também é relatado que moDCs e CD1c + DCs foram equivalentes a apresentadoras de antígenos e induzir a função das células T 15. Neste trabalho, nós descrevemos um método de gerar moDCs imaturos de monócitos do sangue periférico e em seguida diferenciá-las em DCs imunogênica e tolerogênicas. Estas células dendríticas derivadas de monócitos (moDCs) são caracterizados pelos seus marcadores de superfície, perfil de citocinas, funções imuno-reguladoras e estados metabólicos. células dendríticas imunogênica e tolerogênicas produzem diferentes citocinas que resultam na expansão da utilização de células T alogénicos ou células T reguladoras. Neste trabalho, citocina perfis é realizada com sistemas que utilizam a tecnologia multiplex. O meio de crescimento de células são incubadas com o código de cores esferas de anticorpo imobilizado e lidas de um analisador compacto. estados metabólicos de DCs são analisados ​​usando analisadores de fluxo extracelulares que medem a taxa de consumo de oxigênio, um indicador da respiração celular e taxa de acidificação extracelular que reflete glycolyticfluxo em células dendríticas. A medição destes taxas bioenergética fornece um meio para controlar as alterações no metabolismo celular, que são vitais para o desenvolvimento de células dendrítica e função.

<table><tbody><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td> de isolamento PBMC <td>Becton, Dickinson</td><td>302832</td><td>Isolamento PBMC Tubo</td></tr><tr><td>de centrífuga de 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>15 ml tubo de falcão</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>PBMC Isolamento</td></tr> de <tr><td>50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PBMC isolamento</td></tr><tr><td>0.2 &micro; filtro</td><td>m Sartorius stedim biotech</td><td>17597</td><td>PBMC</td></tr><tr><td>isolamento MACs kit</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-201</td><td>Enriquecimento de monócitos</td></tr><tr><td>Separador MiniMACS</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-102</td><td>Enriquecimento de monócitos</td></tr><tr><td>Água de grau de cultura celular</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td></td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070103</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Fosfato Tamponado Salino</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10010-031</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11140-040</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15575</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-868</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-924</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Vitamina D3</td><td>Sigma</td><td>D1530</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D2915</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>l2755</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>azul de tripano</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>HLADR conjugado com PerCP&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>307628</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>CD80 BD conjugado com PE</td><td>Biosciences 557227</td><td></td><td>Citometria</td></tr><tr><td>CD83 conjugado com PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>556855</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>CD86 conjugado com PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>CD11c conjugado com APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>CD14 conjugado com PE&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-242</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>BDCA3 conjugada com PE&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-090-514</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>APC-conjugada ILT3&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-5139-73</td><td></td></tr><tr><td>Citometria Isotipo combinado PerCP- conjugado Mab BioLegend</td><td></td><td>400250</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>Isotipo combinado PE- conjugado Mab</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-835</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>Isotipo combinado APC- conjugado Mab</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-836</td><td></td></tr><tr><td>Citometria BD LSR II Citômetro de Fluxo</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD LSR II&nbsp;</td><td>Citometria</td></tr><tr><td>cytofix/cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>Citometria 554714</td><td></td></tr><tr><td>CD25 conjugada com APC/CY7</td><td>BD pharmingen</td><td></td><td>557753 Citometria</td></tr><tr><td>CD4 conjugada com PE/CY7</td><td>Citometria</td><td></td><td>de 300512</td></tr><tr><td>com CD3 conjugada com PerCP</td><td>Citometria</td><td>de 300428</td><td>Biolegend</td></tr><tr><td>Kit de enriquecimento de células T CD4+ humanas</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19052</td><td>Estudo de aloreação</td></tr><tr><td>Ímã EasySep&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td>Estudo de aloreação</td></tr><tr><td>Cell Trace Kit de proliferação de células CFSE</td><td>Sondas moleculares</td><td>C34554</td><td>Estudo de aloreação</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco, Life</td><td>Technologies 14025092</td><td>Estudo de aloreação</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-conjugado FoxP3</td><td>BD Biosciences</td><td>560889</td><td></td></tr><tr><td>Milliplex MAP Human Citocina/Quimiocina painel magnético</td><td>Millipore</td><td>HCYTOMAG-60K</td><td>Análise de citocinas</td></tr><tr><td>5 ml Tubo de poliestireno</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>Análise de citocinas</td></tr><tr><td>Fluido de bainha Luminex&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SHEATHFLUID</td><td>Análise de citocinas</td></tr><tr><td>Sistema FLEXMAP 3D com software xPONENT</td><td>Luminex Corporation</td><td>FLEXMAP 3D</td><td>Análise de citocinas</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Cell Signalling</td><td>9082</td><td>Atividade mitocondrial</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>Atividade mitocondrial</td></tr><tr><td>XF Meio de ensaio (OCR)</td><td>Cavalo-marinho Biociência</td><td>102352-000</td><td>Adaptação metabólica</td></tr><tr><td>Glicose&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td>Adaptação metabólica</td></tr><tr><td>XF Base Medium (ECAR)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Adaptação metabólica</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Adaptação metabólica</td></tr><tr><td>Calibrant</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000&nbsp;</td><td>Adaptação metabólica</td></tr><tr><td>Kit de Estresse Mito Cell XF</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103015-100</td><td>Adaptação metabólica</td></tr><tr><td>Kit de Estresse de Glicólise XF</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103020-100</td><td>Adaptação metabólica</td></tr><tr><td>Seahorse&nbsp;</td><td>Cavalo-marinho Bioscience</td><td>XFe96</td><td>Adaptação metabólica</td></tr></tbody></table>

geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos metabolic

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

resultados da resposta imune de uma interacção complexa entre o sistema imune inato antigénio não específico e do sistema imune adaptativo antigénio específico. O sistema imunológico é uma constante de equilíbrio para manter a tolerância a auto-moléculas e reagir rapidamente a agentes patogénicos. As células dendríticas (DCs) são potentes células apresentadoras de antígenos profissionais que ligam o sistema imune inato para o sistema imunitário adaptativo e equilibrar a resposta adaptativa entre o eu e não-eu. Dependendo dos sinais de maturação, as células dendríticas imaturas podem ser estimuladas selectivamente para se diferenciarem em DCs imunogénicos ou tolerogénicos. células dendríticas imunogénicas fornecer sinais de proliferação de células T específicas do antigénio para a expansão clonal; enquanto que as células dendríticas tolerogénicos regular a tolerância por deleção de células T específico para o antigénio ou a expansão clonal de células T reguladoras. Devido a esta propriedade única, as células dendríticas são muito procurados como agentes terapêuticos para o câncer e dise auto-imuneases. As células dendríticas podem ser carregadas com antígenos específicos in vitro e injectado no corpo humano para montar uma resposta imune específica ambos imunogénicos e tolerogénico. Este trabalho apresenta um meio para gerar in vitro de monócitos, células dendríticas imaturas monócitos derivados (moDCs), tolerogênico e moDCs maduros que diferem na expressão do marcador de superfície, função e fenótipos metabólicos.

Purificação de Monócitos e dendrítico Diferenciação Celular Os monócitos foram purificados a partir de PBMC por centrifugação de densidade de sangue periférico (Figura 1A), seguido por células CD14 + de separação de selecção positiva magnética (Figura 1B) e cultivadas em meio completo na presença de GM-CSF e IL-4 para se obter as células dendríticas imaturas ( A Figura 2A). A adição de vitamina D3 e dexametasona pós GM-CSF e IL-4 resultou na diferenciação de moDCs imaturos em moDCs tolerogénicas (Figura 2B). LPS foi adicionado para induzir a maturação de moDCs imaturos para amadurecer moDCs (Figura 2C) e moDCs tolerogénicos foram estimuladas com LPS para verificar a resistência à maturação (Figura 2D). As amostras de sangue utilizadas neste trabalho foram obtidas de doadores saudáveis ​​com anterior informadasconsentimento. moDC Caracterização Marcador de superfície A caracterização por Citometria de Fluxo Análise dos marcadores de superfície DC mostraram que moDCs maduros expressaram os níveis mais elevados de marcadores de maturação HLA-DR, CD83 e CD86 em comparação com moDCs tolerogénicos tratadas com LPS, moDCs tolerogénicos e moDCs imaturas (figura 3). Estes resultados demonstraram que moDCs tolerogénicos eram resistentes a maturação em comparação com moDCs imaturos após a estimulação com LPS. Além disso, LPS-tratadas moDCs tolerogênicas e moDCs tolerogênicas exibido aumento da expressão de CD14, BDCA3 (CD141) e transcrição do tipo imunoglobulina (ILT) 3 em comparação com moDCs imaturos e maduros. Os moDCs tolerogênicas que geramos aqui é consistente com relatórios anteriores 23. Caracterização funcional de moDCs moDCs induzidas para se tornar imunogénica maturação e libertação de citocinas que promovem a proliferação de células-T CD4 +. Foi avaliada a imunogenicidade dos diferentes subtipos moDC medindo a proliferação de células T em co-cultura. MoDCs tolerogénico eram fracamente imunogénica quando comparada com moDCs maduros, como mostrado por baixo alloproliferation de células T CD4 + (Figura 4A). MoDCs tolerogénico são caracterizadas pelo seu baixo IFN-Γ, baixo IL-12p40 e IL-10 de alta produção de citocinas em alloreaction co-culturas com células T CD4 + (Figura 4B). Além disso, aloespecifica aumentando o número de moDCs tolerogênicas em co-culturas de moDCs maduros induzida células-T CD4 + aumentou a freqüência de alta Foxp3 + células T reguladoras CD25 (Figura 4C). <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Análise da atividade mitocondrial Red CMXRos é usado para refletir a atividade mitocondrial para analisar os níveis de potencial de membrana mitocondrial em moDCs. MoDCs tolerogénico foram observados para ter uma maior actividade mitocondrial em comparação com os outros subtipos moDC diferenciadas (Figura 5A). Em seguida, a taxa de consumo de oxigénio mitocondrial (OCR) é avaliado para os diferentes subtipos moDC usando um Bioanalyzer. medições de OCR permitem percepções de alta resolução para o perfil metabólico, proporcionando informações, incluindo mas não limitado a respiração basal, capacidade respiratória de reposição, vazamento de prótons e respiração não-mitocondrial. A medição de OCR fornece um meio para avaliar a capacidade das células para responder ao stress. As células são metabolicamente perturbado pela adição de três compostos diferentes em sucessão. A primeira injecção é Oligomycin (ATP acoplador) que inibe complexo V da cadeia de transporte de elétrons (ETC), inibir a síntese de ATP. Esta etapa diferencia a percentagem de oxigénio consumido para a síntese de ATP e o percentagem de oxigénio consumida para vencer vazamento de protões através da membrana mitocondrial interna. A segunda injecção é FCCP (ETC acelerador), que interrompe a síntese do ATP através do transporte de iões hidrogénio através da membrana mitocondrial em vez de através do canal de protões de V. Complexo O colapso do potencial de membrana mitocondrial leva a um rápido consumo de oxigénio e de energia, sem a geração de ATP. FCCP tratamento pode ser utilizado para calcular a capacidade respiratória de reposição de células. Manutenção da capacidade respiratória de reposição sob condições de estresse é fundamental para a sobrevivência da célula. Esta capacidade é determinada por vários factores, incluindo a disponibilidade do substrato e a capacidade funcional das enzimas envolvidas na ETC. A terceira injecção é uma combinação de rotenona, um Complex I de inibidor, e antimicina A, um inibidor de Complexo III. Esta combinação é desligado e a respiração mitocondrial OCR é observado para diminuir como resultado da deficiência da função mitocondrial (Figura 5C). MoDCs tolerogénico apresentaram níveis basais mais elevados do que OCR moDCs maduros (Figura 5D). Além disso, tolerogênico, LPS-tolerogênico e moDCs imaturos mostraram aumento da capacidade respiratória de reposição comparação com moDCs maduros (Figura 5E). Caracterização metabólica dos moDCs Porque o ácido láctico e protões são libertados a partir de células durante a glicólise, analisou-se a actividade glicolítica dos moDCs através da realização de uma análise em tempo real da taxa de acidificação extracelular (ECAR) (Figura 6B). Na presença de glicose, a taxa de todas as glicolítica moDCs aumentada em comparação com a fase basal, commoDCs maduras que exibem maior taxa glicolítica que moDCs imaturas (Figura 6D). Tolerogénico e moDCs imaturos exibiu maior glicólise máxima (induzida por oligomicina na presença de glucose), em comparação com moDCs-tratados com LPS (Figura 6B). A capacidade glicolítica dos moDCs tolerogênicas e imaturas foi superior moDCs maduros (Figura 6E). Em contraste com sua alta taxa glicolítica, reserva glycolytic foi o mais baixo em moDCs maduros (Figura 6F). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig1.jpg" /> Figura 1:. Purificação de monócitos do sangue periférico (A) 25 ml de sangue são cuidadosamente em camadas sobre 15 ml de Ficoll por tubo de 50 ml antes da centrifugação. PBMC estão concentradas numa camada abaixo plasma após centrifugação de densidade. (PBMC B) são incubadas com microesferas que estão conj<html> ugated a anticorpos monoclonais CD14 humanos (isotipo: IgG2a de ratinho). e, em seguida carregada numa coluna que é colocado no campo magnético de um separador para isolar monócitos CD14 + <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig2.jpg" /> Figura 2: Caracterização morfológica de moDCs. (A) a 200 ng / ml de GM-CSF e IL-4 é adicionado a monócitos CD14 + purificadas no dia 0, 4 e 6 para gerar moDCs imaturos; e (B) um passo adicional de estimulação com 100 nM de vitamina D3 e dexametasona 10 nM no Dia 5 gera moDCs tolerogénicos. MoDCs imaturos e moDCs tolerogênicas são estimuladas com 1 ug / ml de LPS no dia 6 de gerar (C) amadurecer moDCs e moDCs (D) LPS-tolerogênicas.ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig3.jpg" /> Figura 3:. Superfície marcador Caracterização por citometria de fluxo Os níveis de expressão de marcadores de superfície de HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 e LT3 em tolerogénico (verde), LPS-tolerogénicas (preto), imatura (vermelho), madura (azul) moDCs. controles isotípicos são mostradas em cinza. histograma individual para cada tipo de célula é plotado com contagem de células do eixo Y contra o registro do eixo X da intensidade do fluoróforo e os cobriu. Todos os histogramas são representativos de quatro experiências independentes. Este valor foi modificado a partir do J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 de junho, 2015). Reproduzidos e reproduzido com permissão de direitos de autor. Direitos de autor 2015. A Associação Americana deImunologistas, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig4.jpg" /> Figura 4: Caracterização funcional de moDCs. (A) Quantificação de frequência alloproliferation de células T CD4 + induzidas por co-cultura com números crescentes de tolerogénico (TOL; verde), LPS-tolerogénico (L-TOL; preto), imatura (IMM; vermelho) e maduro (MAT ; azul) moDCs. Os dados foram reunidos a partir de quatro experiências independentes; média + SEM diferenças estatísticas entre todos os moDCs contra moDCs maduros foram analisados ​​por ANOVA de duas vias com Dunnett comparação múltipla pós-teste. (B) Análise de citocinas de IFN-Γ (painel esquerdo), IL-12p40 (painel do meio) e Il- 10 (painel da direital) em sobrenadantes de alloreactions entre CD4 + células-T co-cultivadas com um número crescente de qualquer tolerogênico (verde), imaturo (vermelho) ou azul) moDCs (maduros. Os dados foram reunidos a partir de seis experiências independentes; média ± SEM alloproliferation de células T (C) células T CD4 + e regulador de expansão de células T induzida por co-cultura com moDCs maduros na presença de um número crescente de moDCs tolerogénicos. Esquerda do eixo Y, a frequência da proliferação de células T CD4 +. Direito do eixo Y, a frequência de CD25 alta Foxp3 + células fechadas nas células T CD4 + proliferativa. Os dados foram reunidos a partir de três experiências independentes; significa ± SEM diferenças estatísticas entre presença contra ausência de moDCs tolerogênicas foram analisados ​​por ANOVA de uma via com Dunnett comparação múltipla pós-teste. (D) alloproliferation de células T CD4 + (esquerda) e frequência de células CD25highFoxP3 + (Direito) induzida por co- cultura com moDCs tolerogénicosna presença de um número crescente de moDCs maduros. Os dados foram reunidos a partir de duas a três experiências independentes; significa ± SEM diferenças estatísticas entre a presença contra ausência de moDCs maduros foram analisados ​​por ANOVA de duas vias com Dunnett comparação múltipla pós-teste. Este valor foi modificado a partir do J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 de junho, 2015). Reproduzidos e republicado com copyright permissão. Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig5.jpg" /> Figura 5: Análise de Actividade mitocondrial de moDCs. (A) Níveis de potencial de membrana mitocondrial (Red CMXRos) em moDCs foram obtidos por fanálise baixo citometria. Os dados de quatro experiências independentes foram reunidas. Média ± SEM (B) Representação esquemática de uma respiração mitocondrial em tempo real. análise OCR a partir de respiração basal e após a adição de oligomicina (inibição complexo V), FCCP (indução máxima da respiração), e rotenona / antimicina A mistura (cadeia de transporte de electrões inibição [etc.]). O SRC (basal máxima subtraída da respiração máxima) mitocondrial é derivado a partir da curva de OCR. (C) estudo cinético representativas das mitocôndrias OCR (pmol / min) em tolerogénico (TOL, verde), LPS-tolerogénico (L-TOL, preto) , imaturo (IMM, vermelho) e maduro (MAT, azul) moDCs usando adição sequencial de oligomicina (Olig), FCCP, e rotenona / antimicina A (Rot-AA). (D) OCR quantificação da respiração basal de moDCs e ( E) sobra capacidade respiratória de moDCs. Os dados foram reunidos a partir de cinco experiências independentes. A média ± SEM. Este valor foi modificado a partir do J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 de junho, 2015). Reproduzidos e republicado com copyright permissão. Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig6.jpg" /> Figura 6: Caracterização metabólica de moDCs. (A) Representação esquemática da glicólise em tempo real. análise ECAR ECAR começa a partir da base, em que as células foram incubadas em meio isento de glucose, seguido pela adição de glicose (indução glicólise), oligomicina (que induz a glicólise celular máxima e inibição complexo V), e, finalmente, 2-desoxi-D- glicose(Inibição da glicólise). Taxa glicolítica (indução glicólise subtraído para ECAR basal), capacidade glicolítica (glicólise máxima subtraído para ECAR basal), e reserva glicolítica (glicólise máxima subtraído para a indução da glicólise) são derivados a partir da curva ECAR. (B) estudo cinético representativas de-glicólise dependente ECAR (mPH / min) em tolerogênico (TOL, verde), LPS-tolerogênico (L-TOL, preto), imaturo (IMM, vermelho), e amadurecer (MAT, azul) moDCs usando adição sequencial de glicose (Gluc), oligomicina (Olig), e 2-DG. Bares (C) mostram níveis eCar basais (D) taxa glicolítica (e) de capacidade glicolítica, e (f) reserva de glycolytic de moDCs. Os dados foram reunidos a partir de três experiências independentes; significa 6 SEM. As diferenças estatísticas foram analisadas por ANOVA de uma via com uma comparação múltipla pós-teste de Tukey. Este valor foi modificado a partir do J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (01 de junho de 2015). Reproduzidos e republicado com copyright permissão. Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

As células dendríticas imaturas podem ser diferenciadas seletivamente em células dendríticas tolerogênicas ou maduras para regular o equilíbrio entre imunidade e tolerância. Este trabalho apresenta um meio de gerar a partir de células dendríticas derivadas de monócitos imaturos (moDCs), moDCs tolerogênicas in vitro e maduras que diferem em fenótipos metabólicos.

Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

O objetivo geral deste protocolo é gerar células dendríticas tolerogênicas e maduras a partir de monócitos para experimentação ou desenvolvimento de vacinas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, fornecendo um modelo para estudar o desenvolvimento, maturação e apresentação de antígenos de células dendríticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a geração de um grande número de células dendríticas in vitro para experimentação.Comece o enriquecimento de monócitos misturando 20 microlitros de células mononucleais do sangue periférico previamente preparadas, ou suspensão de células PBMC com 20 microlitros de azul de tripano, para contar o número de células vivas usando um citômetro. Em seguida, centrifugue a suspensão celular. Aspire o sobrenadante completamente e ressuspenda o pellet celular a uma concentração de 80 microlitros de tampão de coloração para 10 a sétima células.Adicione 20 microlitros de microesferas de CD-4 por 10 às sétimas células. Misture bem e incube as células por 15 minutos a quatro graus Celsius. Lave as células com um mililitro de tampão de coloração por 10 até a sétima célula e centrifugue as células.Aspirar completamente o sobrenadante e voltar a suspender o sedimento celular. Obter uma coluna média para um máximo de duas vezes 10 elevado ao oitavo total de células e colocar a coluna no campo magnético do separador. Em seguida, enxágue a coluna com 500 microlitros de tampão de coloração.Pipete a suspensão celular na coluna e colete as células não marcadas que passam pela coluna em um tubo de 15 mililitros. Substitua um novo tubo de 15 mililitros sob a coluna e lave a coluna três vezes com 500 microlitros de tampão de coloração. Certifique-se de que o reservatório da coluna esteja vazio antes de adicionar um novo tampão de coloração entre as lavagens.Remova a coluna do separador e coloque-a em um tubo novo de 15 mililitros. Pipetar um mililitro de tampão de coloração para a coluna e lavar imediatamente as células marcadas magneticamente, empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna. Em seguida, repita as etapas de separação magnética usando a fração ilustrada em uma nova coluna para aumentar a pureza das células CD14 plus.Semear quatro conjuntos de CD14 mais monócitos em uma concentração de zero vírgula três a zero vírgula cinco vezes 10 elevado a sexto por mililitro de meio de cultura celular de IL-4 em seis placas de poço. Incube as células em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius com cinco por cento de CO2. No quarto dia, remova 850 microlitros de meio da cultura e centrifugue.Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um mililitro de meio de cultura celular. Adicione a mistura de células de volta à cultura. No quinto dia, adicione um microlitro de caldo de vitamina D3 e um microlitro de caldo de dexametazona por um litro de meio a dois dos conjuntos, para gerar moDCs tolerogênicos.No sexto dia, adicione 200 nanogramas por mililitro de GMCSF e 200 nanogramas por mililitro de IL-4 a todos os conjuntos. Adicionar um micrograma por mililitro de LPS a um dos conjuntos tratados apenas com GMCSF e IL-4 para gerar moDCs maduros. Adicione um micrograma por mililitro de LPS a um conjunto de moDCs tolerogênicos para gerar moDCs tolerogênicos de LPS.Finalmente, no sétimo dia, colha os diferentes tipos de moDCs lavando a placa de cultura com PVS EDTA. Os moDCs imaturos foram gerados pela adição de GMCSF e IL-4 a CD-14 purificado mais monócitos nos dias zero, quatro e seis. A adição de vitamina D3 e dexametazona pós-GMCF e IL-4 resultou na diferenciação de moDCs imaturos em moDCs tolerogênicos.LPS foi adicionado para induzir a maturação de moDCs imaturos para moDCs maduros. E moDCs tolerogênicos foram estimulados com LPS para verificar resistência à maturação. Uma análise dos marcadores de superfície DC revelou que os moDCs maduros expressam os maiores níveis de marcadores de maturação HLA-DR, CD80, CD83 e CD86.Por outro lado, os moDCs tolerogênicos exibiram expressão aumentada de CD14, BDCA3 e transcritos semelhantes a imunoglobulinas em comparação com moDCs imaturos e maduros. Usando CMXRos vermelhos para refletir a atividade mitocondrial, observou-se que os moDCs tolerogênicos têm maior atividade mitocondrial em comparação com os outros subtipos diferenciados de moDC. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem características metabólicas em células dendríticas para o desenvolvimento de vacinas e imunoterapia.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Apresentação de antígenos em órgãos linfóides secundários pelas células dendríticas é crucial para o início da célula T mediada resposta imune adaptativa. Aqui demonstramos a cultura de medula óssea células dendríticas derivadas de camundongos, ativação e de rotulagem para os dois fótons de imagem.

Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

Este vídeo demonstra a geração de células dendríticas imaturas, maduras e tolerogênicas, ou DCs, a partir de monócitos humanos. A incubação de monócitos com fatores de crescimento e citocinas leva à produção de DCs imaturas. Em resposta a moléculas reguladoras imunológicas, DCs imaturas se diferenciam em DCs tolerogênicas e maduras.

Geração de células dendríticas imaturas, maduras e tolerogênicas a partir de monócitos

Este vídeo demonstra um método de conversão de células dendríticas (DCs) em DCs tolerogênicas (TolDCs) usando um agente farmacológico imunomodulador. Essa conversão é confirmada pela avaliação da função TolDC por meio de seu efeito imunossupressor nas células T CD4+.

Efeito de um agente farmacológico imunomodulador na interação entre células dendríticas e células T CD4+

O método mais vulgarmente usado para a geração de grandes números de células dendríticas autólogas (DCs), para uso na imunoterapia de tumores é descrita. O método utiliza a IL-4 e GM-CSF a partir de monócitos diferenciam DCs. As DC imaturas são estimuladas a maduro e, em seguida, carregado com os antigénios, antes de serem injectadas de novo no paciente.

Preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia

Células da medula óssea cultivadas com fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF) geram uma cultura heterogênea contendo macrófagos e células dendríticas (DCs). Este método destaca o uso da ligação de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar macrófagos das DCs na cultura GM-CSF. Os macrófagos nesta cultura têm muitas semelhanças com os macrófagos alveolares.

Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

Aqui nós fornecemos um método para identificar e isolar um grande número de GM-CSF dirigido pilhas myeloid usando a classificação de células de alta velocidade. Cinco populações distintas (comuns progenitores mieloides progenitoras granulócitos/macrófagos, monócitos, macrófagos derivados de monócitos e DCs derivados de monócitos) podem ser identificadas com base na expressão Ly6C e CD115.

Geração de um grande número de progenitores mieloides e células dendríticas precursores de murino medula óssea usando um celular romance classificação estratégia

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

Aqui fornecemos um protocolo para triagem de potenciais fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento de células dendríticas (DC) usando transdução lentiviral de shRNA para obter linhas celulares de knockdown estáveis para diferenciação in vitro DC.

Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Short Hairpin RNA-Mediado Gene Knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro

Um protocolo único e abrangente para gerar células dendríticas derivadas de monócitos humanos dessialiladas (mo-DCs) a partir de células mononucleares isoladas do sangue periférico (PBMCs) usando um tratamento com sialidase é apresentado. Além disso, são descritos métodos para avaliar a caracterização fenotípica e funcional das mo-DCs e avaliar como o tratamento com sialidase melhora o nível de maturação das mo-DCs.

Geração de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos com Fenótipos Sialilados Diferentes

Descrevemos um procedimento para avaliar a capacidade de agentes farmacológicos gerarem células dendríticas tolerogênicas a partir de células dendríticas derivadas de monócitos virgens in vitro e validar sua potência por geração autóloga de células T reguladoras.

Um método simples e eficiente para testar agentes imunomoduladores para geração de células dendríticas tolerogênicas a partir de monócitos CD14+ humanos

Aprenda a gerar células dendríticas tolerogênicas e maduras a partir de monócitos para pesquisa imunológica e desenvolvimento de vacinas. Este método permite estudar perfis metabólicos e apresentação de antígenos.

Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic

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