Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic

O objetivo geral deste protocolo é gerar células dendríticas tolerogênicas e maduras a partir de monócitos para experimentação ou desenvolvimento de vacinas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, fornecendo um modelo para estudar o desenvolvimento, maturação e apresentação de antígenos de células dendríticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a geração de um grande número de células dendríticas in vitro para experimentação.

Comece o enriquecimento de monócitos misturando 20 microlitros de células mononucleais do sangue periférico previamente preparadas, ou suspensão de células PBMC com 20 microlitros de azul de tripano, para contar o número de células vivas usando um citômetro. Em seguida, centrifugue a suspensão celular. Aspire o sobrenadante completamente e ressuspenda o pellet celular a uma concentração de 80 microlitros de tampão de coloração para 10 a sétima células.

Adicione 20 microlitros de microesferas de CD-4 por 10 às sétimas células. Misture bem e incube as células por 15 minutos a quatro graus Celsius. Lave as células com um mililitro de tampão de coloração por 10 até a sétima célula e centrifugue as células.

Aspirar completamente o sobrenadante e voltar a suspender o sedimento celular. Obter uma coluna média para um máximo de duas vezes 10 elevado ao oitavo total de células e colocar a coluna no campo magnético do separador. Em seguida, enxágue a coluna com 500 microlitros de tampão de coloração.

Pipete a suspensão celular na coluna e colete as células não marcadas que passam pela coluna em um tubo de 15 mililitros. Substitua um novo tubo de 15 mililitros sob a coluna e lave a coluna três vezes com 500 microlitros de tampão de coloração. Certifique-se de que o reservatório da coluna esteja vazio antes de adicionar um novo tampão de coloração entre as lavagens.

Remova a coluna do separador e coloque-a em um tubo novo de 15 mililitros. Pipetar um mililitro de tampão de coloração para a coluna e lavar imediatamente as células marcadas magneticamente, empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna. Em seguida, repita as etapas de separação magnética usando a fração ilustrada em uma nova coluna para aumentar a pureza das células CD14 plus.

Semear quatro conjuntos de CD14 mais monócitos em uma concentração de zero vírgula três a zero vírgula cinco vezes 10 elevado a sexto por mililitro de meio de cultura celular de IL-4 em seis placas de poço. Incube as células em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius com cinco por cento de CO2. No quarto dia, remova 850 microlitros de meio da cultura e centrifugue.

Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um mililitro de meio de cultura celular. Adicione a mistura de células de volta à cultura. No quinto dia, adicione um microlitro de caldo de vitamina D3 e um microlitro de caldo de dexametazona por um litro de meio a dois dos conjuntos, para gerar moDCs tolerogênicos.

No sexto dia, adicione 200 nanogramas por mililitro de GMCSF e 200 nanogramas por mililitro de IL-4 a todos os conjuntos. Adicionar um micrograma por mililitro de LPS a um dos conjuntos tratados apenas com GMCSF e IL-4 para gerar moDCs maduros. Adicione um micrograma por mililitro de LPS a um conjunto de moDCs tolerogênicos para gerar moDCs tolerogênicos de LPS.

Finalmente, no sétimo dia, colha os diferentes tipos de moDCs lavando a placa de cultura com PVS EDTA. Os moDCs imaturos foram gerados pela adição de GMCSF e IL-4 a CD-14 purificado mais monócitos nos dias zero, quatro e seis. A adição de vitamina D3 e dexametazona pós-GMCF e IL-4 resultou na diferenciação de moDCs imaturos em moDCs tolerogênicos.

LPS foi adicionado para induzir a maturação de moDCs imaturos para moDCs maduros. E moDCs tolerogênicos foram estimulados com LPS para verificar resistência à maturação. Uma análise dos marcadores de superfície DC revelou que os moDCs maduros expressam os maiores níveis de marcadores de maturação HLA-DR, CD80, CD83 e CD86.

Por outro lado, os moDCs tolerogênicos exibiram expressão aumentada de CD14, BDCA3 e transcritos semelhantes a imunoglobulinas em comparação com moDCs imaturos e maduros. Usando CMXRos vermelhos para refletir a atividade mitocondrial, observou-se que os moDCs tolerogênicos têm maior atividade mitocondrial em comparação com os outros subtipos diferenciados de moDC. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem características metabólicas em células dendríticas para o desenvolvimento de vacinas e imunoterapia.