Name: subtipagem de Campylobacter jejuni Ssp. doylei Isolados Utilizando PhyloProteomics baseados em espectrometria de massa (MSPP) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a subtipar cepas de Campylobacter jejuni ssp. doylei usando filoproteômica baseada em espectrometria de massa. Este método rápido e econômico auxilia na epidemiologia de infecções nosocomiais.

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Somos gratos a Hannah Kleinschmidt pelo excelente suporte técnico. Este artigo foi financiado pelo programa de apoio ao Acesso Aberto da Deutsche Forschungsgemeinschaft e pelo fundo de publicação da Georg August Universität Göttingen.

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<li>Stark, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+profiling+of+Bacillus+cereus+strains+and+quantitation+of+the+emetic+toxin+cereulide+by+means+of+stable+isotope+dilution+analysis+and+HEp-2+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay.</a> Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).</li>
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Os autores não têm nada a divulgar.

O passo mais crítico no estabelecimento de um regime de MSPP é a determinação genética inequívoca de identidades biomarcador íon. Se não for possível identificar um biomarcador, sem dúvida, então ele deve ser excluído do regime 13. A C. ssp. doylei esquema jejuni inclui 14 diferentes íons de biomarcadores. Estes são menos 5 em comparação com o C. jejuni ssp. esquema jejuni MSPP 13 .A diferença mais significativa entre o detec...

Durante a última década, laser assistida por matriz dessorção ionização espectrometria de tempo-de-voo de massa (MALDI-TOF MS) tem avançado para ser um método padrão altamente valorizado por género microbiana e identificação de espécies em microbiologia clínica 1, 2. A identificação da espécie é baseada no registo de impressões digitais pequenas proteínas de células intactas ou de lisados ​​celulares. A faixa de massa típica para um espectrómetro de massa usado em microbiologia clínica de rotina é 2-20 kDa. Além disso, o espectro resultante pode ser utilizado para discriminar estirpes com as espécies e abaixo-abaixo-subespécies de nível três. Estudos pioneiros iniciais identificaram iões de biomarcadores específicos para um subgrupo particular de estirpes de Campylobacter jejuni 4, 5 Clostridium difficile, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9, e Escherichia coli 10-12. A combinação de várias massas de biomarcadores para variáveis ​​correspondentes isoformas alélicas oferece a opção de subtipagem mais profunda. Anteriormente, foi implementado com sucesso um método para converter essas variações nos perfis de massa em relações phyloproteomic significativos e reprodutíveis chamados massa phyloproteomics baseados espectrometria (MSPP) em um C. ssp jejuni. coleção isolado jejuni 13. MSPP pode ser usado uma espectrometria de massa equivalente a técnicas de subtipagem baseada na sequência de DNA como digitação sequência multilocus (MLST). Espécies de Campylobacter são a principal causa de gastroenterite bacteriana em todo o mundo 14, 15. Como consequência da Campilobacteriose sequela pós-infecciosa, ou seja, síndrome de Guillain Barré, artrite reactiva e doença inflamatória intestinal pode surgir 16. As principais fontes de infecção sãocarne de gado contaminado de frango, peru, suínos, bovinos, ovinos e patos, leite e água de superfície 15, 17. Portanto, estudos de vigilância epidemiológica regulares no contexto da segurança alimentar são necessários. MLST é o &quot;padrão ouro&quot; na tipagem molecular de espécies Campylobacter 18. Uma vez que a sequenciação de Sanger-base MLST método é um trabalho intensivo, que consome tempo e relativamente cara, é restrito MLST tipagem de relativamente pequenas coortes isolados. Por conseguinte, existe uma necessidade de métodos de subtipagem barata e mais rápida. Essa necessidade pode ser satisfeita através de métodos de espectrometria de massa como MSPP. Este artigo apresenta um protocolo detalhado para MSPP-digitação usando uma coleção de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolados e comparação de seu potencial com MLST.

<table><tbody><tr><td>acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Autoflex III TOF/TOF 200</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td> GT02554 Padrão de teste bacteriano de <td>espectrômetro de massa</td><td>G201</td></tr><tr><td>BTS</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>263564</td><td>Pacote de software</td></tr><tr><td>Bruker IVD Bakterial Test Standard</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>8290190</td><td>5 tubos</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Coleção coordenada de microrganismos da Bélgica/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; cepa 093</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Bélgica coleção coordenada de microrganismos/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Coleção coordenada de microrganismos da Bélgica/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350; CCUG 18265; Kasper 71; LMG 8219; NCTC 11847</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Bélgica coleção coordenada de microrganismos/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Bélgica coleção coordenada de microrganismos/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603/87</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Bélgica coleção coordenada de microrganismos/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolado&nbsp;</td><td>Bélgica coleção coordenada de microrganismos/Laboratório de Microbiologia UGent BCCM/LMG Ghent, Bélgica</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613/87</td></tr><tr><td>Base de ágar Columbia</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.10455 .0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Bússola para FlexSeries 1.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>Pacote de</td><td>Software</td>251419</tr><tr><td>sangue de ovelha desfibrinado&nbsp;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Alemanha</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>02854 Ácido</td> fórmico Fluka <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Matriz HCCA</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes papel tissue</td><td>Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td></td><td></td>Z188956</tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>Pacote de</td><td>software</td></tr><tr><td>259935 Frascos de mastro Cryobank Mast</td><td>Diagnostica, Reinfeld, Alemanha</td><td>Alvo de aço polido CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>insulina humana recombinante</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>água, grau de biologia molecular</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

subtipagem de<em&gt; campylobacter jejuni</em&gt; ssp.<em&gt; doylei</em&gt; isolados utilizando phyloproteomics baseados em espectrometria de massa (mspp)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS oferece a possibilidade de diferenciar algumas bactérias não só ao nível de espécies e subespécies, mas ainda abaixo, a nível da estirpe. isoformas alélicas dos íons de biomarcadores detectáveis ​​resultar em deslocamentos de massa específica do isolados. phyloproteomics à base de espectrometria de massa (MSPP) é um nova técnica que combina as massas espectrometria de massa de biomarcadores detectáveis ​​em um esquema que permite a dedução de relações phyloproteomic de deslocamentos de massa específicos do isolado em comparação com uma estirpe de referência do genoma sequenciado. As sequências de aminoácidos deduzidas são então usados ​​para calcular dendrogramas baseados em MSPP. Aqui nós descrevemos o fluxo de trabalho de MSPP digitando um ssp Campylobacter jejuni. Doylei coleção isolado de sete cepas. Todas as sete cepas eram de origem humana e multilocus digitação sequência (MLST) demonstraram a sua diversidade genética. MSPP-digitação resultou em sete tipos de seqüência MSPP diferentes, refletindo suficientemente sua phyrelações logenetic. A C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP inclui 14 diferentes íons de biomarcadores, proteínas principalmente ribossômicas na faixa de massa de 2 a 11 kDa. MSPP pode, em princípio, ser adaptado para outras plataformas de espectrometria de massa com uma faixa de massa estendida. Portanto, esta técnica tem o potencial para se tornar uma ferramenta útil para nível de tensão tipagem microbiana.

Anteriormente, nós estabelecemos com sucesso um esquema MSPP para C. ssp jejuni. jejuni 13. Aqui, o objetivo foi estender o método para o irmão subespécie C. ssp jejuni. doylei. Neste cenário específico, sete C. jejuni ssp. doylei isolados foram adquiridos a partir da coleção belga de microorganismos / Laboratório de Microbiologia UGent BCCM / LMG Ghent, Bélgica. Todos os sete isolados utilizados para noss...

Massa phyloproteomics à base de espectrometria (MSPP) foi usado para digitar uma coleção de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isola a nível da estirpe em comparação com digitação sequência multilocus (MLST).

subtipagem de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolados Utilizando PhyloProteomics baseados em espectrometria de massa (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

O objetivo geral deste procedimento de espectrometria de massas, chamado MSPP ou Filoproteômica baseada em Espectrometria de Massas, é subtipar bactérias no nível de linhagem. Este método pode ser utilizado para responder perguntas fundamentais nas áreas de Microbiologia, Epidemiologia e Higiene. Por exemplo, pode ser usado para analisar situações de surto ao visualizar a relação filoproteômica.Em comparação com outros métodos de tipagem, o MSPP é barato por amostra e muito rápido. Infecções nosocomiais são uma questão de importância crescente, e esperamos que nosso esquema MSPP possa ser estendido para a tipagem epidemiológica de outras bactérias, ou até mesmo fungos. Nosso esquema MSPP fornece informações sobre a relação entre cepas, portanto, para a predição de fenótipos relevantes, como resistência a medicamentos ou até virulência, faz sentido aplicá-lo quando esses fenótipos se correlacionam com genótipos específicos.Para iniciar este procedimento, prepare dois tubos de solução matriz dissolvendo 2,5 miligramas de HCCA em 250 microlitros de uma mistura de solvente orgânico, 50%isonitrila. Adicione insulina humana recombinante como padrão interno a um deles, seguido de 47,5%água bidestilada e 2,5%ácido trifluoroacético. Em seguida, espalhe uma quantidade do tamanho de uma cabeça de alfinete de uma colônia da cepa de referência diretamente sobre uma placa-alvo para MALDI.Para determinação da massa exata do pico de calibração, coloque um microlitro do padrão de teste em outro local. Cubra cada ponto de bactéria e padrão com 1 microlitro de solução de matriz adicionada com HCCA e deixe cristalizar à temperatura ambiente. Para cada cepa a ser analisada, repita a preparação do esfregaço.Cubra cada ponto com 1 microlitro de solução de matriz HCCA adicionada e deixe cristalizar à temperatura ambiente. Alternativamente, as proteínas podem ser extraídas de células difíceis de lisar. Para isso, colete aproximadamente 5 colônias de um cultivo em placa de ágar com um alça de inoculação.Suspenda-os em 300 microlitros de água destilada duplamente em um tubo de reação de 1,5 mililitro e misture bem por pipetagem repetida até que as colônias bacterianas estejam completamente suspensas. Em seguida, adicione 900 microlitros de etanol absoluto e misture. Centrifugue a amostra a 13.000 g por 1 minuto.Após secar o pellet, re-suspenda-o pipetando para cima e para baixo em 50 microlitros de ácido fórmico 70%. Em seguida, adicione 50 microlitros de acetonitrila e misture. Remova os detritos por centrifugação a 13.000 g por 2 minutos.Quando finalizado, transfira 1 microlitro do sobrenadante para uma posição de amostra em uma placa alvo para MALDI. Após deixar a amostra secar, recubra cada ponto com 1 microlitro de solução da matriz HCCA e deixe cristalizar à temperatura ambiente. Neste momento, realize a análise por MALDI-TOF coletando 600 espectros em etapas de 100 disparos para cada ponto.Primeiro, clique na aba de execução automática no software de configuração do espectrômetro de massas. Abra o método clicando com o botão esquerdo do mouse no botão de método e escolhendo o método no menu suspenso. Em seguida, clique com o botão esquerdo do mouse no botão editar para abrir o editor de método de execução automática.Na guia acumulação, defina o valor de disparos satisfatório como 100 e o valor de soma como 600. Para cada espectro, escolha o pico do calibrante a partir da lista, clique em 'atribuir automaticamente' e pressione 'OK'. Após obter os espectros de massa de cada ponto, determine experimentalmente a massa exata do pico de calibração, abrindo um espectro com o navegador de espectros e identificando o pico na massa esperada em comparação com um espectro sem calibrante. Verifique se o pico do calibrante não está encoberto por qualquer outro biomarcador do organismo de interesse.A partir dos dados de sequenciamento genômico da linhagem de referência, calcule o peso molecular monoisotópico teórico de cada uma das proteínas codificadas traduzindo a sequência de DNA na sequência de aminoácidos correspondente. Faça o upload do arquivo ou copie e cole a sequência proteica na caixa de entrada do painel do recurso bioinformático apropriado e calcule o ponto isoelétrico teórico e o peso molecular. Copie os resultados para uma planilha com uma coluna contendo o identificador do gene e outra coluna com o peso molecular.Ordene as linhas pelo peso molecular calculado, para facilitar a consulta das massas. Insira uma coluna adicional na planilha para o peso molecular da forma desmetanada, subtraindo 135 dáltons do peso molecular mono-isotópico. Atribua cada massa principal de biomarcador medida às massas calculadas da cepa de referência, consultando a massa medida na tabela genômica.Em outra planilha, registre a massa e o identificador para cada íon biomarcador. Agora, calibre os espectros de massa obtidos a partir dos isolados coletados, da mesma forma que foi feito para a cepa de referência. Para um isolado por linha, identifique biomarcadores variantes nos espectros de massa, registre a massa medida para cada biomarcador e o isoforma previsto nas colunas respectivas.O espectro de massa MALDI-TOF de C-Jejuni Subspécie doylei ATCC 49349 contém 14 íons biomarcadores com carga simples que puderam ser identificados pela comparação das massas moleculares calculadas com o espectro de referência. Na coleção, foram detectadas formas iso variáveis para L32 sem metionina, L33 e a proteína hipotética codificada por gil152939117, S20 M e S15 M. As massas restantes atribuídas aos íons biomarcadores foram invariáveis nos isolados testados. A substituição de aminoácidos correspondente à mudança de massa foi identificada por amplificação PCR e sequenciamento Sanger do gene específico utilizando os iniciadores listados aqui.As sequências de aminoácidos de todos os íons biomarcadores incluídos no esquema MSPP, bem como as isoformas alélicas detectadas, estão indicadas aqui. A dendrograma UPGMA baseado em MLST, construído a partir dos isolados examinados de C jejuni subsp. doylei, mostra que cada isolado pertence a um tipo de sequência MLST diferente. E a cepa LMG7790 apresenta a maior distância filogenética.Como observado na análise de MLST, o isolado LMG7790 apresenta a maior distância filoproteômica na análise MSPP dos isolados examinados da subespécie C jejuni doylei. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em até um dia, se for executada corretamente. Ao seguir este procedimento, é importante lembrar da toxicidade de algumas substâncias utilizadas durante o experimento.Por exemplo, o aceto-nitrila pode causar irritação na pele. Além disso, outros métodos como o sequenciamento de DNA podem ser realizados para analisar parâmetros adicionais, como a presença de genes de resistência. O desenvolvimento dessa técnica abre caminho para pesquisadores na área de microbiologia explorarem a fotogenia.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como o MSPP funciona e como ele pode ser aplicado a questões específicas. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos virulentos pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de equipamentos de laboratório de nível S2, devem sempre ser tomadas.

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