Name: Измерение In Vitro АТФазы для ферментативного определения характеристик (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Узнайте метод количественного определения активности АТФазы in vitro для функциональной характеристики очищенных белков. Этот подход позволяет исследовать новые потенциальные АТФазы и оценивать их активность.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Авторы хотели бы выразить признательность за финансирование из гранта Национального института здравоохранения RO1AI049294 (для M. S.).

1. Выполните АТФ реакция гидролиза с очищенным белком <ol><li> Подготовка запасов всех необходимых реагентов для инкубации с очищенным белком. <ol><li> Подготовка 5x HEPES / NaCl / глицерин (HNG) буфера, содержащего 100 мМ HEPES рН 8,5, 65 мМ NaCl и 5% глицерина (или другого буфера для анализа, в зависимости от обстоятельств). </li><li> Подготовьте 100 мМ MgCl 2 (или другой металл, если АТФазы металл-зависимых) в воде. </li><li> Подготовить свежие 100 мМ АТФ в 200 мМ Трис-основание (не доведения рН далее) с использованием высокой чистоты АТФ. Алиготе и хранить запас АТФ при -20 ° С в течение не более чем на несколько недель, а АТФ сломается в течение долгого времени, и воздерживаться от замораживания и оттаивания запас АТФ. </li><li> Премикс MgCl 2 и АТФ в соотношении 1: 1 как раз перед установкой реакции гидролиза АТФ. </li></ol></li><li> Подготовить и разметить 1,5 мл пробирки для сбора проб через равные промежутки времени в течение всей реакции. Подготовить пробирки для сбора образцов в момент времени 0 и в момент времени 15, 30,45 и 60 мин. Примечание: В качестве альтернативы, собирают образцы только в момент времени 0 и в конечной точке. <ol><li> Добавить 245 мкл буфера 1x Хнг в каждую пробирку для разбавления образцов, взятых из реакций гидролиза АТФ 1:50. </li></ol></li><li> Приготовьте ванну из сухого льда и этанола для быстрого замораживания образцов, чтобы остановить реакцию. В резиновый ведро льда или другого безопасного (не пластик) контейнер, добавьте несколько кусочков сухого льда и осторожно влить достаточно 70-100% этанола, чтобы покрыть сухой лед. </li><li> Развести очищенного белка в 1x буфера HNG, в случае необходимости (обычно 5-10 мкм), и держать на льду. </li><li> Настройка реакции гидролиза АТФ. <ol><li> В отдельных 0,5 мл пробирки для каждого образца, добавьте следующие реагенты (в указанном порядке): H 2 O (до конечного объема 30 мкл), 6 мкл 5х Хнг или другого буфера, 3 мкл 2 -АТФ смеси 100 мМ MgCl, и 0,25-5 мкМ белка. </li><li> Включите буферную только отрицательное состояние управления, в котором не добавляют белок.</li></ol></li><li> Удалить 5 мкл из реакционной смеси в момент времени 0, разбавленным в соотношении 1:50 в приготовленную 1,5 мл пробирку, содержащую 245 мкл буфера HNG, и немедленно заморозить образец в бане сухой лед / этанол. </li><li> Инкубируйте реакции при 37 ° С, чтобы обеспечить гидролиз АТФ, происходит в течение 1 часа. В каждом интервале (15, 30, 45 и 60 мин), удалить 5 мкл аликвоты из реакционной смеси и добавление меченых проб пробирки, содержащие Хнг буфере, как описано на стадии 1.6. </li><li> В конце реакции гидролиза АТФ, переместить разбавленных образцов в -80 ° C морозильнике для хранения. Для того, чтобы гарантировать, что все образцы полностью заморожены, подождите по крайней мере 10 минут, прежде чем продолжить. </li></ol> 2. Инкубируйте образцы, содержащие свободный Pi с детектором Реагент <ol><li> Оттаивания разбавленных образцов, содержащих АТФ аликвот реакции гидролиза в каждый момент времени (получен из шагов 1.6 и 1.7) при комнатной температуре. </li><li> Настройка 96-луночный планшет, содержащий образцы и стандарты фосфата. <ol><li> В 0,5 мл Tuбыть, разбавить стандарт фосфата (при условии, с реагентом обнаружения Pi) от 800 мкМ до 40 мкМ добавлением 5,5 мкл 800 мкМ стандартного до 104,5 мкл HNG буфера. Хорошо перемешать и добавить 100 мкл этого 40 мкМ стандарта Pi в лунку A1 96-луночного планшета. </li><li> Добавьте 50 мкл буфера для Хнг в лунки B1-H1 для 1: 1 серийные разведения стандарта Pi. </li><li> Удалить 50 мкл 40 мкМ Pi из скважины A1 и добавляют к 50 мкл буфера для анализа в хорошо В1, перемешать, и удалить 50 мкл из скважины B1 и добавить к Лунка C1, сохраняющиеся разведений через скважины G1. Откажитесь 50 мкл из скважины G1 после смешивания, чтобы обеспечить каждую лунку имеет тот же объем. Хорошо H1 должен содержать только буфер, чтобы создать стандарт Pi от 40 до 0 мкМ. Примечание: Если дополнительный фактор (такой как ингибитор) был добавлен к образцам, создать стандартную кривую, содержащую этот фактор для контроля изменений в фосфатном высвобождения или оптической плотности в этих условиях. </li><li> Добавьте 50 мкл каждого SAMPле в двух экземплярах на тарелку. Добавьте образцы из той же временной точке в столбцах по вертикали (образец 1 раз 0 = А2, А3; образец 2 раз 0 = В2, В3) и разные временные точки в горизонтальном направлении. Это позволяет до 8 проб и 5 временных точек на чашку. </li></ol></li><li> С помощью стерильной пипетки, чтобы удалить достаточное количество малахитовый зеленый / молибдат детектирующий реагент Pi, чтобы добавить 100 мкл в каждую из лунок, содержащих образцы и стандарты (необходимых реагентов (мл) = 0,1 х количество образцов и стандартов) и добавить к блюду для быстрого пипетирования с помощью многоканального пипетку. Не лейте детектирующий реагент непосредственно в чашку, а загрязнение Пи, вероятно, произойдет. </li><li> Используя многоканальную пипетку, добавьте 100 мкл реагента для детекции Pi в каждую лунку и перемешать тщательно пипетированием вверх и вниз последовательное число раз без введения пузырьков, предпочтительно, чтобы из последних моментов времени на первые моменты времени. </li><li> Инкубируйте планшет в течение 25 мин при комнатной температуре, или в соответствии с манаправления nufacturer в. </li></ol> 3. Результаты количественного анализа с использованием микропланшетов Reader, <ol><li> Измерить оптическую плотность образцов при 650 нм с использованием микропланшет-ридера абсорбцию. </li><li> Сделать стандартную кривую Pi. Используя программное обеспечение для построения графиков, график значения абсорбции для стандартных образцов Pi по сравнению с концентрацией, чтобы найти уравнение используется для решения для количества фосфата в каждом образце. </li><li> Вычислить АТФазы для каждого образца путем калибровки со стандартом фосфата. Фосфаты выпущен = (OD 650 - Y перехватывать) / наклон. <ol><li> Нормальное общее Pi из дублей каждого образца. Вычтите буферную только элемента управления чтение оптической плотности от этого числа. Умножьте это на коэффициент разбавления (50 в нашем примере). </li><li> Определить нмоль Pi выпущен на мкмоль белка. Графическое изображение этих значений для каждой временной точки в кинетическом анализе должны давать линейные припадки , по меньшей мере , R = 0,99 (рисунок 1); Если пВЗ, анализ может быть отрегулирована с более или менее белка или более или менее продолжительного времени инкубации. </li></ol></li><li> Результаты представлены как нмоль Pi / мкмоль белка / мин (фиг.2, 3), или в качестве нмоль Pi / мкг белка / мин , при желании. </li></ol>

<ol><li>Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%2B+proteins%3A+have+engine%2C+will+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AAA+ proteins: have engine, will work.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).</li>
<li>Baker, T. A., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP%2C+an+ATP-powered+unfolding+and+protein-degradation+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).</li>
<li>Maxson, M. E., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vacuolar-type+H%2B-ATPase+at+a+glance+-+more+than+a+proton+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump.</a> J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).</li>
<li>Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+genes+for+secretion+NTPases%3A+Identification+of+the+widespread+tadA+subfamily+and+development+of+a+diagnostic+key+for+gene+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).</li>
<li>Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+the+Extracellular+Protein+Secretion+NTPase+EpsE+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae.</a> J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).</li>
<li>Camberg, J. L., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+Vibrio+cholerae+type+II+secretion+ATPase+EpsE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE.</a> J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).</li>
<li>Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+secretion+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Type II secretion and pathogenesis.</a> Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct%2C+Real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green%3A+An+improvement+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation.</a> J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li>
<li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microassay+for+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A microassay for ATPase.</a> Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).</li>
<li>Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+kinetic+analysis+of+the+intracellular+domain+of+human+protein+tyrosine+phosphatase+%CE%B2+%28HPTP+%CE%B2%29+using+synthetic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides.</a> Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).</li>
<li>Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+stimulation+of+EpsE+ATP+hydrolysis+by+EpsL+and+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids.</a> EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).</li>
<li>McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+weak+ATPase+activity+of+human+Hsp90+by+a+client+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein.</a> J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).</li>
<li>Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XpsE+oligomerization+triggered+by+ATP+binding%2C+not+hydrolysis%2C+leads+to+its+association+with+XpsL%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL.</a> EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).</li>
<li>Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+flagellar+ATPase+motor+shows+ATP-dependent+hexameric+assembly+and+activity+stimulation+by+specific+lipid+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding.</a> Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Savvides, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirB11+ATPases+are+dynamic+hexameric+assemblies%3A+new+insights+into+bacterial+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion.</a> EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).</li>
<li>Sanghera, J., Li, R., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+luminescent+ADP-Glo+assay+to+a+standard+radiometric+assay+for+measurement+of+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Techn%22%5BJournal%5D)">Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity.</a> Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).</li>
<li>Sherman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+catalytic+activity+from+biological+function+of+the+ATPase+that+powers+lipopolysaccharide+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cofactor+regulation+with+disease-associated+p97%2FVCP+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).</li>
<li>Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Это общий протокол для измерения экстракорпоральное АТФазы активность очищенных белков для биохимических характеристик. Этот метод легко оптимизированы; например, регулируя количество белка, буфера и солевых композиций, температуры и изменения длины анализа и интервалы времени (в том числе и увеличение общего количества интервалов) может улучшить активность количественно оценивать. Коммерчески доступные малахитовый зеленый на основе реагенты обладают высокой чувствительностью, и могут обнаруживать небольшие кол...

АТФазы являются интегральными ферментами во многих процессах во всех сферах жизни. АТФазы действуют как молекулярные моторы, которые используют энергию гидролиза АТФ для обеспечения таких разнообразных реакций, как транспортировка белка, разворачивание и сборка; репликация и транскрипция; клеточный метаболизм; движение мышц; подвижность клеток; и ионная накачка1-3. Некоторые АТФазы являются трансмембранными белками, участвующими в транспортировке растворенных веществ через мембраны, другие являются цитоплазматическими и могут быть связаны с биологическими мембранами, такими как плазматическая мембрана или мембраны органелл.
AAA+ АТФазы (АТФазы, связанные с различными клеточными активностями) составляют большую группу АТФаз, которые имеют некоторую общую последовательность и структурную консервативность. Эти белки содержат консервативные нуклеотидсвязывающие мотивы, такие как коробки Уолкера-А и -В, и образуют олигомеры (обычно гексамеры) в их активном состоянии1. Значительные конформационные изменения в этих белках при связывании нуклеотидов были охарактеризованы среди различных членов семейства AAA+. EpsE является AAA+ АТФазой и членом бактериального подсемейства секреции II/IV типа NTPases4-6. EpsE обеспечивает секрецию II типа (T2S) в холерном вибрионере, возбудителе холеры. Система T2S отвечает за секрецию широкого спектра белков, таких как фактор вирулентности холерный токсин, вызывающий обильную водянистую диарею, когда V. cholerae колонизирует тонкий кишечник человека7. 
Методы количественного определения активности АТФазы in vitro разнообразны, но обычно измеряют выброс фосфатов с использованием колориметрических, флуоресцентных или радиоактивных субстратов8-11. Описан основной метод определения in vitro АТФазной активности очищенных белков с помощью колориметрического анализа на основе коммерчески доступного малахитового зеленого субстрата, который измеряет высвобожденный неорганический фосфат (Pi). При низком рН малахитовый зеленый молибдат образует комплекс с Pi, и уровень образования комплекса может быть измерен на длине волны 650 нм. Этот простой и чувствительный анализ может быть использован для функциональной характеристики новых АТФаз и оценки роли потенциальных активаторов или ингибиторов, для определения важности доменов и/или специфических остатков или для оценки влияния конкретных методов лечения на ферментативную активность.

<table><tbody><tr><td>HEPES буфер</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Хлорид натрия</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Хлорид магния</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Аденозинтрифосфат (АТФ)</td><td>Fisher</td><td>BP41325</td><td></td></tr><tr><td>96-луночные планшеты (прозрачные, плоскодонные)</td><td>VWR</td><td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>BIOMOL Green</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-AK111</td><td>Предпочтительный реагент для детектирования фосфатов. Внимание: раздражающее.</td></tr><tr><td>Считыватель</td><td></td><td></td> микропланшетов <td>BioTek Synergy или аналогичное</td></tr><tr><td>программное обеспечение</td><td></td><td></td> <td>Prism 5</td> GraphPad</tr></tbody></table>

Измерение<em&gt; in vitro</em&gt; АТФазы для ферментативного определения характеристик

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Аденозинтрифосфата-гидролизом ферменты или АТФазы, играют решающую роль в разнообразных клеточных функций. Эти динамические белки могут вырабатывать энергию для механической работы, такими как незаконный оборот белка и деградации, растворенной транспорта и клеточных движений. Протокол , описанный здесь , является основным анализом для измерения активности в пробирке очищенных ATPases для функциональной характеристике. Белки гидролизуются АТФ в реакции, что приводит к неорганическим высвобождение фосфата, и количество фосфата освободила затем количественно с помощью колориметрического анализа. Это хорошо адаптируется протокол может быть настроен для измерения активности АТФазы в кинетических или конечных точек анализов. Представитель протокола приводится здесь основывается на деятельности и требований белка EpsE, ААА + АТФазы участвуют в II типа секрецией бактерии холерных вибрионов. Количество очищенного белка, необходимого для измерения активности, продолжительность анализа и выбор времени и количество SAmpling интервалы, буфер и солевой состав, температура, кофакторы, стимуляторы (если таковые имеются) и т.д. могут отличаться от тех , которые описаны здесь, и , таким образом , некоторые оптимизации могут быть необходимы. Этот протокол обеспечивает базовую основу для характеризации АТФазы и может быть выполнена быстро и легко отрегулировано по мере необходимости.

Активность в пробирке из t2s АТФазы белка EpsE может стимулироваться copurification из белка EpsE с цитоплазматическим доменом ПЛЭН (ESPE-cytoEpsL) и добавлением кислого фосфолипида кардиолипина 12. Кроме того, можно определить роль отдельных остатков в EpsE гидролиза АТФ путем сравнения активности дикого типа (WT), чтобы вариантные формы белка с использованием этого анализа. При этом эффект замещения два остатка лизина в EpsE цинка-связывающего домена измеряется путе...

Мы описываем базовый протокол для количественной оценки активности АТФазы in vitro. Этот протокол может быть оптимизирован в зависимости от уровня активности и требований к данной очищенной АТФазе.

Измерение<em&gt; In Vitro</em&gt; АТФазы для ферментативного определения характеристик

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Общая цель данной процедуры заключается в количественном определении АТФазной активности очищенных белков in vitro для их функциональной характеристики. Этот метод может быть использован для характеристики новых предполагаемых АТФаз, оценки эффективности потенциальных активаторов или ингибиторов, а также для определения вклада конкретных доменов или остатков в АТФазную активность. Основным преимуществом данной методики является то, что она представляет собой простой и чувствительный способ измерения АТФазной активности in vitro и может быть легко оптимизирована.Подготовьте стоковые растворы всех необходимых реагентов для инкубации с очищенным белком в соответствии с текстовым протоколом. Непосредственно перед постановкой реакции гидролиза АТФ смешайте 100 мМ хлорида магния и 100 мМ АТФ в соотношении один к одному. Подготовьте и промаркируйте пробирки объемом 1,5 мл для сбора образцов через равные промежутки времени в ходе реакции.Подготовьте пробирки для сбора образцов в момент времени ноль, а также через 15, 30, 45 и 60 минут. Добавьте в каждую пробирку 245 µL 1x буфера HNG, чтобы разбавить образцы, отобранные из реакций гидролиза ATP, в разведении 1:50. Затем подготовьте баню из сухого льда и этанола для быстрого замораживания образцов с целью остановки реакции.В резиновый ведерный контейнер для льда или другую подходящую емкость поместите несколько кусочков сухого льда и осторожно налейте достаточное количество 70%–100% этанола, чтобы покрыть сухой лед. Разбавьте очищенный белок в 1X буфере HNG и храните его на льду. Подготовьте реакции гидролиза АТФ в подготовленных пробирках объемом 0,5 мл, добавив предварительно рассчитанный объем воды для достижения конечного объема реакции 30 µL.Затем добавьте 6 µL 5X HNG или другого буфера, 3 µL смеси 100 мМ хлорида магния и ATP, а также от 0,25 до 5 µM белка. Проведите инкубацию отрицательного контроля, содержащего только буфер без добавления белка. Затем отберите 5 µL из реакционной смеси в момент времени ноль.Затем разбавьте аликвот в 50 раз в подготовленной пробирке объемом 1,5 мл, содержащей 245 µL буфера HNG. Немедленно заморозьте образец в бане из сухого льда с этанолом. Инкубируйте реакции при 37 °C в течение одного часа для обеспечения гидролиза ATP.Через каждый интервал отбирайте из реакционной смеси аликвоты объемом 5 µL и переносите их в маркированные пробирки с буфером HNG, как было указано ранее. По завершении реакции гидролиза ATP переместите разбавленные образцы в морозильную камеру при температуре 80 °C для хранения. Чтобы убедиться, что все образцы полностью заморожены, подождите не менее 10 минут перед переходом к следующему этапу.Разморозьте при комнатной температуре разведенные образцы, содержащие аликвоты реакции гидролиза ATP для каждой временной точки. Затем подготовьте 96-луночный планшет с образцами и стандартами фосфата. В пробирке объемом 0,5 мл разведите стандарт фосфата с 800 micromolar до 40 micromolar, добавив 5,5 microliters стандарта к 104,5 microliters буфера HNG.Тщательно перемешайте и добавьте 100 µL этого 40 µM стандарта фосфата в лунку A1 96-луночного планшета. Добавьте 50 µL буфера HNG в лунки с B1 по H1 для проведения серийных разведений стандарта фосфата в соотношении один к одному. Перенесите 50 µL 40 µM раствора фосфата из лунки A1 в 50 µL буфера для анализа в лунке B1 и перемешайте.Затем перенесите 50 мкл из лунки B1 в лунку C1, продолжая разведения до лунки G1. После перемешивания удалите 50 мкл из лунки G1, чтобы объем во всех лунках был одинаковым. Лунка H1 должна содержать только буфер для создания стандартного ряда фосфатов от 40 до 0 мкМ. Далее внесите в планшет по 50 мкл каждого образца в двух повторностях.Разместите образцы, взятые в один и тот же момент времени, в колонках вертикально, а образцы из разных моментов времени — горизонтально. Это позволяет разместить до восьми образцов и пять временных точек на одной планшете. С помощью стерильной пипетки отберите достаточное количество детектирующего реагента малахитового зеленого мелиптата фосфата, чтобы добавить по 100 µL в каждую лунку, содержащую образцы и стандарты.Добавьте детектирующий реагент в кювету для удобного дозирования с помощью многоканального пипеточного дозатора. Не наливайте детектирующий реагент непосредственно в кювету, так как существует вероятность загрязнения фосфатами. Используя многоканальный пипеточный дозатор, внесите 100 microliters реагента для детектирования фосфатов в каждую лунку и осторожно перемешайте, выполнив однообразное количество циклов аспирации и диспенсирования, избегая образования пузырьков; выполняйте процедуру в порядке от последнего временного интервала к первому.Оставьте планшет при комнатной температуре на 25 минут или в соответствии с инструкциями производителя. Для количественного анализа результатов измерьте оптическую плотность образцов при 650 нанометрах с помощью микропланшетного ридера. Представлены репрезентативные результаты кинетического и конечного методов определения АТФаз, при которых активность форм дикого типа и мутантных форм АТФазы системы секреции II типа/EPSE определялась в присутствии и отсутствии стимулятора кардиолипина.Здесь представлены результаты кинетического анализа АТаЗа, стимулируемого кардиолипином, демонстрирующие линейное высвобождение фосфата с течением времени для EPSE дикого типа и двойного мутанта по лизину, при этом бычий сывороточный альбумин служит отрицательным контролем. Эти данные могут быть представлены как количество высвобожденного фосфата в минуту, деленное на концентрацию белка, для количественной оценки и сравнения АТаЗа-активности каждого белка. Данные указывают на то, что два остатка лизина, K417 и K419, вносят вклад в стимулируемую кардиолипином АТаЗа-активность EPSE.Сравнение АТФазной активности тех же белков без стимуляции кардиолипином показывает, что эти два остатка лизина не влияют на низкую базальную активность EPSE, а определяют способность белка стимулироваться кардиолипином. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как быстро и точно определить количественно АТФазную активность очищенных белков. При выполнении данной процедуры важно учитывать чувствительность реагента для определения фосфата.Чтобы избежать загрязнения фосфатами, мы рекомендуем использовать одноразовые пластиковые изделия и ультрачистую воду, а также проводить гель-фильтрацию или ионообменную хроматографию после очистки белка.

measuring-in-vitro-atpase-activity-for-enzymatic-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Метод определения активности киназы ацетат описывается. Этот тест использует прямой реакции для определения активности ферментов и кинетики ацетат киназа в ацетат формирования направления с различными фосфорильной акцепторов. Кроме того, этот метод может быть использован для опробования других ацетил фосфата или ацетил-КоА использованием ферментов.

Прямая Обнаружение ацетат формирования Деятельность киназы ацетат Фермент

Эффект активации протеинкиназы С (ПКС) изоферментов на митохондриальной функции, связанные с дыхания и окислительного фосфорилирования и на жизнеспособность клеток описаны. Подход адаптируется аденовирусной техники выборочно сверхэкспрессировать PKC изоферменты в первичной культуре клеток и различные анализы для определения функций митохондрий и энергетический статус клетки.

Оценка митохондриальной функции и жизнеспособности клеток в клетках почек гиперэкспрессией протеинкиназы С Изоферменты

Это видео демонстрирует анализ ферментов на основе тонкослойной хроматографии для определения активности пирофосфокиназы с использованием нуклеотидов, меченных радиоактивными метками. Этот метод позволяет получить представление о синтезе нуклеотидов и реакциях фосфотрансфера.

Анализ активности ферментов на основе тонкослойной хроматографии: метод определения активности пирофосфокиназы in vitro с помощью тонкослойной хроматографии

Это видео демонстрирует измерение in vitro активности фермента α-галактозидазы А и кислоты α-глюкозидазы в образцах с использованием синтетических субстратов 4-метилумбеллиферила.

Измерение in vitro активности фермента α-галактозидазы А и кислой α-глюкозидазы

Мы описываем метод количественной оценки активности K+-контртранспортирующих АТФаз P-типа путем гетерологичной экспрессии ферментов в ооцитах Xenopus и измерения поглощения Rb+ или Li+ отдельными клетками с помощью атомно-абсорбционной спектрофотометрии. Этот метод является чувствительной и безопасной альтернативой экспериментам с радиоизотопным потоком, облегчающей сложные кинетические исследования.

Измерение Катионит транспорта по Na, K и H, K-АТФазы<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии: Альтернатива радиоизотопных Анализы

Здесь мы описываем биохимические анализы, которые могут быть использованы для характеристики АТФ-зависимых ферментов ремоделирования хроматина на предмет их способности 1) катализировать АТФ-зависимое скольжение нуклеосом, 2) взаимодействовать с нуклеосомными субстратами и 3) гидролизовать АТФ нуклеосомным или ДНК-зависимым образом.

Биохимические анализы для анализа деятельности АТФ-зависимых ферментов хроматина

В настоящем отчете описывается ферментативный анализ in vitro для измерения активности фосфатидилэтаноламинметилтрансферазы с использованием экстрактов клеток Leishmania. Этот анализ основан на переносе радиоактивной метильной группы из S-[Methyl-3H]аденозил-L-метионина на эндогенный фосфатидилэтаноламин.

Экстракорпоральное анализе измерить фосфатидилэтаноламина метилтрансферазы активность

Протеинкиназы представляют собой высокоразвитые сигнальные ферменты и каркасы, которые являются критическими для меж- и внутриклеточной передачи сигнала. Мы представляем протокол для измерения активности киназы с использованием радиоактивно меченого аденозинтрифосфата ([γ- 32 P] ATP), надежного метода, помогающего выявлять регуляцию клеточной сигнализации.

Анализ активности протеинкиназы с радиоактивно меченым АТФ

Существует требование сделать Доклинические испытания для класса Роман «сирота» препаратов, называемых фармакологических сопровождающих, воспроизводимость, быстро и эффективно. Мы разработали на основе культуры пробирного высоко стандартизированных, простой и универсальный мобильный экран для право пациентов, а также сопровождающий Роман фармакологических препаратов.

В пробирке Фермент измерения для испытания фармакологических Chaperone реагирования в Фабри и Pompe болезни

Здесь мы описываем метод для очистки гистидин меткой pyrophosphokinase ферментов и используя тонкий слой хроматографии радиоизотопами субстратов и продуктов для анализа для ферментативной активности в пробирке. Assay активность фермента широко применима к любой киназы, циклазы нуклеотидов или реакции фосфора передача, механизм которого включает нуклеотидов трифосфата гидролиза.

Очистка и пробирного активность In Vitro для ppGpp (p) синтетаза с Clostridium difficile

Никотинамид аденин динуклеотид (NADH) -связанный анализ ATPase был адаптирован к полувысокой пропускной скрининга малых ингибиторов миозина молекулы. Этот кинетический анализ проводится в формате микроплиты 384 колодца с общими объемами реакции всего 20 Лл на скважину. Платформа должна быть применима практически к любому ферменту ADP.

Полу-высокой пропускной адаптации NADH-связанных АТПас анализ для скрининга малых ингибиторы молекулы

Узнайте метод количественного определения активности АТФазы in vitro для функциональной характеристики очищенных белков. Этот подход позволяет исследовать новые потенциальные АТФазы и оценивать их активность.

Измерение

Больше видео