Name: Manipulação de ploidia de embriões Zebrafish com choque térmico 2 Tratamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda a manipular a ploidia de embriões de zebrafish usando choque térmico para induzir diploidização. Este método simples e eficaz permite a homozigose direta de alelos em indivíduos heterozigotos.

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas R21 HD068949-01 e RO1 GM065303 do NIH.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a University of Wisconsin - Madison e Animal Care Institucional e diretrizes Use Committee (IACUC) (University of Wisconsin - Madison Assurance número A3368-01). 1. Seleção de fêmeas para coleta de ovos via acasalamento Interrompida NOTA: protocolos baseados em FIV contar com a extrusão dos óvulos maduros de fêmeas através de pressão manual 9. protocolos anteriores usaram fêmeas diretamente de tanques ou em acasalamentos de pares sem as fêmeas submetidas comportamento libertação do óvulo, mas apenas uma pequena fração dessas mulheres (cerca de 20% ou menos, dependendo da linha de peixe-zebra) produzem ovos extrudados e competentes sob pressão manual. Em um procedimento melhorado, as fêmeas são pré-classificadas para a postura de ovos por observação visual direta, seguido pela interrupção imediata de acasalamento. Este procedimento é muito eficaz, como quase todas as mulheres pré-selecionados através deste rendimento etapa de acasalamento interrompido ovos extrudados e competentesmediante pressão manual. <ol><li> A tarde antes do experimento, criar pares de acasalamento da estirpe de peixe-zebra desejado em caixas de acasalamento de peixe-zebra padrão. Mantenha homens na mesma câmara como fêmeas ainda fisicamente separadas a partir deles, seja por meio de uma divisão caixa de acasalamento ou colocando o homem sob uma inserção de postura ea fêmea dentro da inserção. </li><li> Na manhã do experimento, remover a partição física, colocando ambos os sexos masculino e feminino na mesma pastilha de postura, de modo que o acasalamento começa. </li><li> Inspecione visualmente os tanques que contêm pares de acasalamento para detectar extrusão de ovos durante o acasalamento natural. Aos primeiros sinais de extrusões de ovo, separado masculina e feminina para interromper a reprodução. Após a separação a partir de machos, fêmeas manter os pré-seleccionado, quer separadamente ou misturadas no mesmo tanque. Use várias fêmeas, dependendo do número de embriões desejados (tipicamente 50-150 ovos / fêmea). </li></ol> 2. Preparar uma solução de esperma NOTA: a fertilização in vitro relies na exposição dos ovos maduros a uma solução de esperma. Esta solução pode ser não tratada, para gerar zigotos diplóides (o qual após tratamento HS2 tornaram embriões tetraplóides) ou UV-tratado, para gerar zigotos haplóides (o qual após tratamento HS2 tornaram embriões diplóides homozigóticos). Esperma protocolos de preparação anteriores sugeriu a utilização de tubos capilares para recolha de sémen a região anal do sexo masculino vivos, mas foi um processo ineficaz uma vez que apenas uma pequena fracção de esperma produziu machos 9. O protocolo apresentado a seguir baseia-se em vez sobre a preparação esperma de testículos dissecados cortadas, que produz resultados mais confiáveis. <ol><li> Preparar a solução de Hank antes do tempo como solução de pré-mistura de um Hank, composto de todos os componentes (Soluções 1, 2, 4 e 5), exceto a solução de bicarbonato de sódio (solução 6). Preparar a solução de 6 fresco e adicionar à pré-mistura da manhã da experiência (Tabela 1). Para fazer a solução de Hanks (solução final, a preparação da manhãprocedimento de fertilização in vitro), misture 990 ul de Premix de Hank e 10 ul da recém-feitos Solução 6. </li><li> Eutanásia machos pela exposição excessiva ao tricaina como uma solução de 0,016% em água condicionado. <ol><li> Prepare tricaina como uma solução de estoque de 0,2% em água (tampão a pH 7,0 com Tris 1M pH 9,0) e manter a 4 ° C. Adicionar 8 mL de uma solução de estoque tricaina por 100 ml de água numa proveta, e utilizar um líquido para transferir os machos à solução tricaina. </li><li> Usar o equivalente de testículos de um macho por embraiagem necessário para ser fertilizado num volume de solução de Hank correspondente a 100 uL para cada macho (por exemplo, os testículos de 10 machos recolhidos em 1 ml de solução de Hank, para fertilizar 10 embraiagens com 100 ul / embraiagem). </li><li> Confirmar eutanásia por cessação de movimentos de emalhar por 15 minutos. Após a eutanásia, remova os machos do copo com uma colher. Lavar os machos brevemente com água condicionada e seque-os levemente, colocando-os brevemente sobre vários locais de umapapel toalha. </li></ol></li><li> Para remover os testículos, primeiros decapitar sacrificados machos usando tesouras de dissecação ou uma lâmina de barbear, e fazer um corte longitudinal ao longo do abdômen com dissecando scissors.Under um microscópio de dissecação com uma fonte de luz refletida, remover os órgãos internos com uma pinça de dissecação. Puxe cada uma das massas testículos com uma pinça e colocá-los dentro do tubo de microcentrífuga contendo solução de Hank. NOTA: Testículos pode ser identificado como cada uma das duas estruturas alongadas de aspecto translúcido encontrados ao lado das paredes do corpo e que convergem perto da cloaca. Testículos pode ficar 2-3 minutos sobre uma superfície da placa de Petri após a dissecação, e antes da sua colocação em solução de Hank. </li><li> Liberar o esperma para a solução por corte dos testículos com uma espátula estreita e / ou cuidado pipetando para cima e para baixo 5-6 vezes os testículos em solução com uma micropipeta 1.000 ul-ponta, evitando a formação de bolhas de ar. Deixar depositar o testículos detritos. </li><li> Guardar a solução de espermatozóides no gelo, onde ele pode manter a sua potência para até 2-3 horas. Se procedendo à luz UV-tratamento de solução de esperma, transferir a solução para um tubo de microcentrífuga limpo deixando as partes de trás dos testículos. </li></ol> 3. Tratamento de UV NOTA: O tratamento de UV é usada para a ligação cruzada de ADN de esperma de modo a torná-lo inactivo no embrião. Este passo só é usado quando a produção de embriões diplóides ginogenéticos haplóides ou homozigotos ginogenéticos. solução de esperma para o tratamento de UV devem ser separados a partir de pedaços de testículos (passo 2.4), como grandes peças podem proteger o esperma de o tratamento com UV. <ol><li> Transferir a solução esperma para um poço seco e limpo de uma placa de vidro depressão sentado em uma cama de gelo (por exemplo gelo dentro de uma placa de petri). Use até 1 ml de solução de espermatozóides por placa de vidro bem. </li><li> Expor a solução de esperma de UV, colocando a placa de vidro depressão no leito de gelo sob uma lâmpada UV. Tratar a solução do esperma para 90 segundos com um 115 V (60 Hz, 0.68A) lâmpada UV em um 19 cm (7,5 polegadas) de distância. Com o fim de uma ponta de pipeta, misturar suavemente a solução cada 30 segundos durante o tratamento com UV (utilizar uma ponta de pipeta limpa a cada 30 seg). </li><li> Usando uma ponta de pipeta limpa e micropipeta, transferir a solução de espermatozóides tratados para um novo tubo de microcentrífuga. Armazenar em gelo até ser necessário para a fertilização in vitro (não mais do que 2-3 horas de extracção). </li></ol> 4. Extrusão manual de óvulos maduros NOTA: As fêmeas obtidas por interrupção do acasalamentos naturais prontamente produzir ovos sob anestesia e pressão manual. Durante este procedimento, o tratamento tricaina deve ser cuidadosamente controlada para evitar a exposição excessiva que pode impedir a recuperação das fêmeas. <ol><li> Anestesiar fêmeas por exposição à luz a solução tricaina: fêmeas de transferência com uma rede de tricaina solução em água condicionado (feita pela adição de 8 ml de tricaina solução stock de 0,2% a 100 ml de água de peixe condicionado) por cerca de 2-5 minutos, até a parada de peixe movimento Gill. </li> &lt;li&gt; Assim que uma mulher interrompe o movimento de emalhar, use uma colher para recolher e brevemente lave-o em água condicionada. Ainda usando a colher para mover o peixe, seque-o levemente, colocando-o brevemente e repetidamente em vários locais de uma toalha de papel, em seguida, transferi-lo para um e seco placa de 10 cm de diâmetro petri limpo. Aproxime-se do peixe com a colher na anterior à direção posterior, para evitar potencialmente danificar o opérculo branquial. </li><li> Use lenços de laboratório ou tecido mole para secar delicadamente ainda mais a área anal, para evitar quaisquer ovos liberados a partir prematuramente sendo ativado pela água. Amortecendo os dedos levemente com água (para evitá-los furando a escamas de peixe), coloque um dedo de uma das mãos nas costas do sexo feminino como suporte, e com um dedo da outra mão aplicar uma leve pressão ao longo do abdômen da fêmea até que os ovos se tornar extrudido. </li><li> Usar uma espátula estreita para mover os ovos para longe do corpo da mulher. Coloque a fêmea de volta em um tanque com água condicionada para a recuperação. <br/&gt; NOTA: Uma vez que os ovos são extrudados enquanto a fêmea está encontrando-se em um lado de seu corpo, ela pode ser capotou e o processo repetido do outro lado dela para obter ovos adicionais. Para garantir a recuperação total da fêmea, aplicam-se apenas pressão manual suave no abdômen, e realizar o procedimento de parada movimento de emalhar para voltar à água em menos de 2 min. </li><li> Ative (com exposição à água) e fertilizar (com esperma solução adição) ovos simultaneamente e dentro de 90 segundos após a extrusão (ver secção 5). </li></ol> 5. Fertilização In Vitro NOTA: a fertilização Zebrafish em cruzamentos naturais é externo, dependente do lançamento simultâneo e ativação por água de óvulos e espermatozóides durante o acasalamento. Em fertilização in vitro imita este processo, expondo os ovos de solução de esperma, na presença de água. volume de água é inicialmente pequena (1 ml), a fim de aumentar a concentração efectiva do esperma. A ligação através de esperma ocorre no prazo de 15-20 seg 10 &lt;/ Sup&gt;, e o volume de água pode, então, ser aumentada. Chorion levantamento contribui ainda mais para a próxima sincronização da embreagem através da limitação da janela para a competência para a ligação dos espermatozóides 11,12. Os embriões resultantes, portanto, exibir ciclos de divisão celular em grande parte simultâneos durante os estágios iniciais de clivagem. <ol><li> Adicionar 100 ul de solução de esperma (correspondente ao equivalente de testículos de um macho - ver Parte 2) para a embraiagem de ovos extrudido sobre uma placa de petri. Agite suavemente a ponta da pipeta usado para adicionar a solução de espermatozóides entre os ovos para misturar o esperma e os ovos juntos, certificando-se de não levantar a ponta da superfície da placa de petri para evitar danos ovo. </li><li> ativar imediatamente os ovos, adicionando 1 ml de solução embrionário médio (E3) (água condicionada também é aceitável como um substituto para a E3 nas partes 5 a 7) e novamente misture delicadamente óvulos e espermatozóides rodando suavemente com a ponta da pipeta. Iniciar um temporizador para iniciar a temporização relativa à adubação. </li&gt; <li> Em 1 mpf no volume de 1 ml, inundar o prato com E3. Antes de continuar, deixe repousar até 10-12 mpf para permitir a ativação do ovo, incluindo a expansão córion completo. </li></ol> 6. O tratamento de choque térmico NOTA: Um choque térmico aplicado no embrião inicial inibe a duplicação centriole, resultando em um complemento incompleto de centrioles para conduzir a formação do fuso durante o ciclo celular subsequente 2. A ausência de fuso por sua vez resulta na falta de formação de sulco 13. <ol><li> Após a expansão das córions (10-12 MPF), despeje os embriões a partir da placa de petri em um coador de chá. Lavar a placa de petri utilizando um frasco de lavagem com E3, a fim de recolher quaisquer embriões restantes no coador de chá. </li><li> Coloque o coador de chá com os embriões dentro de um copo num banho pré-aquecido com E3 a 28,5 ° C. Pré-equilibrar o copo e E3 à temperatura do banho de água e verifique se não há E3 suficiente para que todos os embriões no chácoador são expostos ao meio. </li><li> Aos 22 mpf, remova o coador de chá do banho de água de 28,5 ° C, brevemente apagá-lo em uma toalha de papel para remover o excesso de umidade, e colocá-lo dentro de um copo E3 semelhante pré-aquecido em um banho térmico a 41,4 ° C. </li><li> Aos 24 mpf, transferir o coador de chá de volta para a E3, em banho-maria a 28,5 ° C após uma breve blotting. Aos 29 mpf, use um frasco de lavagem com E3 para transferir os embriões do coador de chá para uma placa de Petri de 10 cm. </li></ol> 7. Seleção de embriões com um One-ciclo Citocinese Stall <ol><li> Durante o período de tempo de 35-45 MPF, sob um microscópio de dissecação com uma fonte luminosa transmitida, seleccionar os embriões que são submetidos a clivagem simétrico na fase de 2 células, e que são, portanto fertilizado. Remover embriões que não são submetidos a clivagem celular. </li><li> Continuar a observar os embriões fertilizados, seleccionados para a divisão celular normal durante o primeiro ciclo celular, e durante o segundoOND ciclo celular (50-65 MPF). </li><li> Classificar os embriões de acordo com as seguintes categorias (Figura 2C): 4 células ( &quot;no box&quot;, no 2: standard arranjo 2 para um embrião de 4 células); 3 células ( &quot;tenda parcial&quot;, em um aberrantes 2 células menores: 1 arranjo de grandes células); 2 e células ( &quot;impasse&quot;, embriões exibindo um atraso do ciclo de uma célula numa mistura 1: 1 arranjo idêntico ao de um embrião de duas células). Organizar os embriões paralisadas em uma placa de petri fresca. NOTA: Nesta fase, embriões no 2: arranjo 2 correspondem àquelas em que durante o segundo ciclo celular nem blastomere sofreu uma tenda divisão celular; embriões em um aberrantes 2 células menores: 1 arranjo de grandes células correspondem àquelas onde de choque térmico causado uma tenda do ciclo celular durante o segundo ciclo celular em um blastomere mas não o outro; e embriões &quot;estagnadas&quot; numa proporção de 1: 1 arranjo correspondem àqueles em que durante o segundo ciclo celular ambos os blastómeros foram submetidos a divisão celular desejadotenda. embriões paralisadas deve retomar a clivagem celular durante o período seguinte do ciclo celular (65-80 MPF). A disposição dos blastómeros podem ser variável, devido aos sinais incompletos do ciclo celular anterior para estabilizar o eixo de 2,14, mas a maioria dos embriões vai formar uma blástula relativamente normal que pode sofrer o desenvolvimento normal. </li><li> Permitir que embriões para desenvolver na placa de Petri, com um limite de 80 embriões por placa de 10 cm. Aos 24 hpf, observar os embriões para determinar se eles têm uma morfologia característica normal dos embriões diplóides diplóides ou homozigóticos 6 (medida normal da extensão do eixo (Figura 3A, 3C)), em contraste com a extensão do eixo reduzida e aumento da espessura da característica corpo de haplóides (Figura 3B)), e / ou avaliar diploidização utilizando marcadores genéticos de pigmento em 36 MPF, tal como ouro ou albino e outros tais ensaios (Figura 3 e ver abaixo) 2,6,9. </li&gt; <li> Remova todos os embriões que parecem ter uma morfologia haplóides, ou que tenham lisadas ou apresentar outros defeitos grosseiramente anormais. NOTA: Se desejar, permitir que os embriões a se desenvolver até 5 dias após a fertilização, continuando a remover embriões lisadas ou grosseiramente anormais em uma base diária e adicionando fresco E3 para refrescar o meio. NOTA: Sobrevivência embriões podem também ser cultivados após a insuflação da bexiga natatória no dia 5 por transferência para um sistema de alimentação e incubação sob condições padrão. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

As etapas críticas É fundamental para o trabalho em condições de efetiva em fertilização in vitro. Para garantir um bom suprimento de óvulos maduros (passo 1), as fêmeas configurado para o acasalamento não deveria ter sido criado em cruzes de acasalamento durante pelo menos 5 dias e deve aparecer grávida. Durante a interrupção da reprodução, um observador pode monitorar 15-30 tanques de forma adequada para a primeira aparição de extrusão de ovo natural. Interrupção de acoplamento deve ocorrer o...

Este protocolo permite a manipulação de ploidia de embriões de peixe-zebra, tal como na geração de diplóides ginogenéticos homozigóticos de haplóides ginogenéticos (Figura 1) ou a produção de tetraplóides. Isto é conseguido através da indução de um atraso na citocinese correspondente a precisamente um ciclo celular (Figura 2A, 2B). O atraso tecla de um ciclo na citocinese é conseguido por tratamento com choque térmico. O protocolo padrão de Choque Térmico (SH) como originalmente descrito por Streisinger e colegas envolvido um impulso de temperatura durante o período de MPF 13-15, resultando em uma tenda a divisão celular de um ciclo durante o primeiro ciclo celular 1. A eficiência deste protocolo foi recentemente melhorado pela digitalização dos ciclos celulares início com uma janela deslizante temporal do tratamento de choque térmico. Esta verificação identificado um ponto de tempo depois de um choque de calor, ainda dentro do primeiro ciclo celular (22-24 MPF), que resulta em uma maior taxa de EMBRyos com uma tenda a divisão celular de um ciclo, que neste caso afecta o segundo ciclo celular 2. A observação de que as manipulações experimentais durante o primeiro ciclo celular interferir com a divisão celular durante o segundo ciclo celular e causar a duplicação do ADN conteúdo também tem sido relatada em outras espécies de peixe 3,4. Referimo-nos a este protocolo modificado como Choque Térmico 2 (HS2 - o termo &quot;2&quot; indica que o impulso de calor ocorre num ponto de tempo mais tarde do que o método HS padrão, e que o atraso do ciclo celular causado por HS2 ocorre durante o segundo ciclo celular ). Estes estudos mostraram que a base de prisão citocinese após o choque térmico é a inibição de duplicação centriole durante o impulso de calor, o que afecta a formação do fuso e indução sulco no seguinte ciclo celular. Resultados HS2 em rendimentos de parada do ciclo celular se aproximando de 100%, e as taxas de ploidia duplicação até 4 vezes superior HS standard 2. sagacidade embriões tratadosha choque térmico durante o ciclo celular blastomere apresentam muitos efeitos deletérios, sugerindo que o choque térmico afeta vários processos necessários para a divisão celular 2. Por outro lado, se o choque de calor é aplicada antes do início do ciclo celular (período de tempo de 0-30 MPF), parece ter efeitos consistentes com interferência específica com a duplicação centriole e não parece afectar outros processos celulares essenciais 2 . Estes estudos mostraram que o tempo antes da iniciação da divisão blastï¿½ero parece ser um período de desenvolvimento passível de choque térmico utilizando como ferramenta para manipular especificamente através da inibição de ploidia centriole. A causa subjacente da aparente selectividade para a choque térmico na duplicação centríolo é desconhecida, mas pode estar relacionada a uma degradação seletiva de subestruturas centrossoma observados em estresse por calor em certos tipos de células, como leucócitos 5. sincronização temporal de embrionáriosenvolvimento é conseguido por fertilização in vitro (FIV). O uso de esperma não tratada durante resultados de fertilização em embriões diplóides que após a HS2 induzidas por um ciclo tenda cytokinesis tornar tetraploid. O uso de espermatozóides tratados com UV, que transporta ligações cruzadas que inativam o seu DNA, resulta em embriões haplóides ginogenéticos 6, que após HSII induzidas por um ciclo cytokinesis tenda tornar diplóides ginogenéticos 2. Devido a toda a duplicação do genoma, resultando, os últimos ginogenéticos diplóides são homozigóticos em cada locus único em todo o genoma. Para concisão, nos referimos a ginogenéticos embriões haplóides como &quot;haplóides&quot; e embriões diplóides ginogenéticos homozigotos como &quot;diplóides homozigotos&quot;. Se viáveis ​​e férteis, diplóides homozigóticos pode ser utilizado para iniciar linhas estéreis e letais-livre. homozygosity direta induzida por HS2 deve também ser facilmente incorporados na análise genética ou telas genéticas, uma vez que diplóides homozigotos de fêmeas que são portadores heterozigotos de Muttaxas de exposição ções de homozigose em altas e fixas (50%) rácios 2. O protocolo a seguir descreve etapas para executar HS2 e induzem a duplicação ploidy com homozigose completa. Para a produção tetraplóide, solução de esperma deve ser tratada. Para a produção de diplóide homozigótica, o esperma deve ser inactivado por tratamento com UV. Além disso, como descrito na discussão, marcadores de pigmentos visíveis pode também ser usado para facilitar a identificação dos diplóides homozigóticos. Companheiro de peixe-zebra, principalmente durante a primeira 3 horas do início do seu ciclo de luz 7, e ambos os adultos e os ovos são sensíveis aos ritmos circadianos 8, portanto, para obter os melhores resultados do procedimento de fertilização in vitro deve ocorrer dentro deste período de tempo.

<table><tbody><tr><td>Caixas de acasalamento de peixe-zebra</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O</td><td>Sigma</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-D (MS 222)</td><td>Aprovado pela FDA (ANADA 200-226)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>para preparar 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>920-1</td><td>para preparar 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>Rede de peixe (malha fina) (4-5 in)</td><td>PennPlax</td><td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td><td>disponível em ThatFishThatPlace</td></tr><tr><td>Colher</td><td></td><td></td> de plástico <td>disponível na maioria das lojas padrão</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecação</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>disponível na Fine Science Tools</td></tr><tr><td>Estereoscópio de dissecação (com fonte de luz transmitida)</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Fonte de luz reflexiva (braços de LED)</td><td></td><td>Fostec KL1600 LED</td><td>ou</td></tr><tr><td>placas de Petri equivalentes 10 cm de diâmetro</td><td></td><td></td><td>qualquer fabricante</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf 1,5 ml</td><td></td><td></td><td>qualquer fabricante</td></tr><tr><td>Balde</td><td></td><td></td> <td>de geloqualquer fabricante</td></tr><tr><td>Pipetteman P-1000</td><td></td><td></td><td>qualquer fabricante</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta 1,000 &micro; l</td><td></td><td></td><td>qualquer fabricante</td></tr><tr><td>Espátula estreita</td><td>Fisher</td><td>14-374</td><td></td></tr><tr><td>Prato de vidro de depressão</td><td>Corning Inc</td><td>722085 (gato Fisher. No 13-748B)</td> <td>disponível a partir da</td></tr><tr><td>lâmpada UV</td><td>UVP</td> da Fisher <td>Scientific Modelo XX-15 (cat No. UVP18006201)</td> <td>disponível na Fisher Scientific. Embora não tenha sido observado por nós com este modelo, algumas fontes de UV foram observadas experimentando uma diminuição de intensidade ao longo do tempo (se for o caso, consulte Modificações e Solução de Problemas)</td></tr> <tr><td>Óculos</td><td></td><td></td> UV <td>qualquer fabricante</td></tr><tr><td>Toalhas de</td><td></td><td></td> papel <td>qualquer fabricante</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666-11</td><td>disponível na Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cronômetro</td><td></td><td></td><td>qualquer fabricante</td></tr><tr><td>Garrafa de lavagem</td><td>Thermo Scientific</td><td>24020500</td><td>disponível na Fisher Scientific</td></tr><tr>Coador de chá <td>disponível em lojas de cozinha</td><td>copos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 250 ml (2)</td><td>Corning Inc.</td><td>1000250</td><td>disponível a partir de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>banho-maria (2)</td><td></td><td></td> <td>qualquer fabricante, com precisão de 0,1 C (por exemplo Shel Lab H 2 O Bath Series)</td></tr> <tr><td>Hanks ' Solução 1</td><td>veja acima</td>, <td>veja acima</td><td>8,0 g de NaCl, 0,4 g de KCl em 100 ml ddH2O. Armazene a 4 graus C.</td></tr><tr><td>Hanks ' Solução 2</td><td>veja acima</td>, <td>veja acima</td><td>0,358 g de Na2HPO4, 0,6 g KH2PO4 em 100 ml ddH2O. Armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>Hanks ' Solução 4</td><td>veja acima</td>, <td>veja acima</td><td>0,72 g de CaCl2 em 50 ml ddH2O. Armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>Hank's Premix</td><td>veja acima</td>, <td>veja acima</td><td>, adicione, na seguinte ordem: 10,0 ml Solução 1; &nbsp; 1,0 ml Solução 2; &nbsp; 1,0 ml Solução 4; &nbsp; 86,0 ml ddH2O; &nbsp; 1,0 ml Solução 5. Armazene a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Hanks ' Solução 6</td><td>veja acima</td>, <td>veja acima</td><td>0,33 g NaHCO3 em 10 ml ddH2O. Prepare fresco na manhã do procedimento de fertilização in vitro.</td></tr><tr><td>Solução de Hank (solução final)</td> <td>veja acima</td> veja <td>acima</td><td>Combine 990 &mu; l de Hank' s Premix e 10 &mu; l da Solução 6 recém-fabricada (solução NaHCO3)</td></tr></tbody></table>

manipulação de ploidia de embriões zebrafish com choque térmico 2 tratamento

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulação de ploidia permite transformações úteis, tais como diplóides para tetraploids, ou haplóides para diplóides. No peixe-zebra Danio rerio, especificamente a geração de diplóides ginogenéticos homozigóticos é útil na análise genética, porque permite a produção directa de homozigotos de um único mãe heterozigótica. Este artigo descreve um protocolo modificado para a duplicação de ploidia com base num impulso de calor durante o primeiro ciclo celular, choque térmico 2 (HS2). Através da inibição de duplicação centriole, este método resulta em uma tenda preciso divisão celular durante o segundo ciclo celular. A baia de divisão de um ciclo preciso, acoplado a duplicação DNA afetado, resulta na duplicação do genoma inteiro. Protocolos associados com este método incluem ovo e esperma recolha, tratamento com UV de esperma, fertilização in vitro e pulso de calor para provocar um atraso da divisão do ciclo de uma célula e a duplicação de ploidia. Uma versão modificada deste protocolo pode ser aplicadopara induzir alterações de ploidia em outras espécies animais.

Apesar de a uma célula-box ciclo citocinese, a replicação do ADN ocorre normalmente em tais embriões, o que resulta na duplicação do teor de ADN do embrião (figura 1). O protocolo Streisinger Choque Térmico (HS standard) envolve um pulso de calor durante o período de 13-15 minutos após a fertilização (MPF) e induz principalmente detenção cytokinesis durante a primeira divisão celular embrionária em 35 mpf 1,2, enquanto que o método derivado descrito aqui, refe...

Um protocolo modificado para a manipulação ploidy usa um choque de calor para induzir uma tenda de um ciclo na citocinese no embrião. Este protocolo é demonstrado no peixe-zebra, mas podem ser aplicados a outras espécies.

Manipulação de ploidia de embriões Zebrafish com choque térmico 2 Tratamento

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

O objetivo geral deste procedimento é promover a diplodização no embrião inicial de peixe-zebra por meio da inibição da citocinese correspondente a um ciclo celular embrionário. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de genética, como a identificação de genes envolvidos em características adultas ou reprodutivas, a geração de linhagens endogâmicas ou outras manipulações genéticas. A principal vantagem desta técnica é que ela é simples, mas eficaz na promoção da diplodização, permitindo a homozigose direta de alelos presentes em um único indivíduo heterozigoto.No período da tarde anterior ao experimento, monte pares de acasalamento da linhagem desejada de peixe-zebra em caixas padrão para acasalamento, utilizando divisórias para separar machos e fêmeas. Na manhã do experimento, remova a divisão física para que a postura dos ovos tenha início. Inspecione visualmente os tanques contendo os pares reprodutores para detectar a extrusão de ovos durante o acasalamento natural.Na primeira evidência de extrusão de ovos, separe o macho e a fêmea para interromper o acasalamento. Mantenha as fêmeas previamente selecionadas separadamente ou agrupadas no mesmo tanque.

ploidy-manipulation-of-zebrafish-embryos-with-heat-shock-2-treatment

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este é um método para a geração de embriões diplóides gynogenetic zebrafish (embriões cuja única contribuição genética vem da mãe), bloqueando a segunda divisão meiótica imediatamente após a fertilização com esperma de luz ultravioleta inativado. EP embriões não são totalmente homozigótica devido à recombinação durante a primeira divisão meiótica, porém eles são homozigotos em todos os loci que não foram separadas de suas centrômero por recombinação.

Fazendo Zebrafish Diplóide Gynogenetic por pressão inicial

Aqui relatamos um protocolo para medir o estresse oxidativo em embriões vivos de peixe-zebra. Este procedimento permite a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tecidos embrionários inteiros e populações unicelulares. Este protocolo realizará análises qualitativas e quantitativas.

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

O peixe-zebra é um poderoso sistema modelo para biologia do desenvolvimento e pesquisa de doenças humanas devido à sua semelhança genética com vertebrados superiores. Este protocolo descreve uma metodologia para criar embriões de peixe-zebra haplóides que podem ser utilizados para estratégias de triagem direta para identificar mutações recessivas em genes essenciais para a embriogênese inicial.

Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

Este protocolo fornece instruções passo a passo sobre como gerar embriões de peixe-zebra parabióticos de diferentes origens genéticas. Quando combinado com os recursos de imagem incomparáveis do embrião de peixe-zebra, esse método fornece um meio excepcionalmente poderoso para investigar funções autônomas e não autônomas de células para genes candidatos de interesse.

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

Zebrafish recentemente foram usados como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação do ADN durante o desenvolvimento. Aqui está detalhado os protocolos para o uso de embriões de peixe-zebra para sincronismo de replicação de perfil. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tempo de replicação em mutantes, tipos de células individuais, modelos de doença e outras espécies.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar os mecanismos celulares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo barco-íris em tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Este trabalho descreve um protocolo para o monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra.

Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

Este trabalho descreve um protocolo para o sistema modular de transgênese Tol2, um método de clonagem baseado em gateway para criar e injetar construções transgênicas em embriões de peixe-zebra.

O Sistema Zebrafish Tol2: Uma Abordagem de Transgênese Modular e Flexível Baseada em Gateway

Este protocolo descreve como realizar uma edição eficiente da base de adenina sem limitação de PAM para construir um modelo preciso de doença do peixe-zebra usando zSpRY-ABE8e.

Edição de Base Eficiente sem PAM para Modelagem de Zebrafish de Doenças Genéticas Humanas com zSpRY-ABE8e

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar mutante materno que acopla uma linha knock-in zpc:cas9 estável com a entrega mediada por Tol2 de de expressão de sgRNA.

Geração de mutantes maternos usando zpc:cas9 knock-in zebrafish

Aprenda a manipular a ploidia de embriões de zebrafish usando choque térmico para induzir diploidização. Este método simples e eficaz permite a homozigose direta de alelos em indivíduos heterozigotos.

Manipulação de ploidia de embriões Zebrafish com choque térmico 2 Tratamento

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