Name: Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer hoe u tweekleurige antigenmicroarrays genereert voor de simultane detectie van IgG- en IgM-autoantistoffen in menselijk en muizenserum. Deze methode maakt hoogdoorvoer screening mogelijk met minimale hoeveelheden serum.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.C. werd ondersteund door een postdoctorale beurs van de Heart and Stroke Foundation of Canada en het Training Program in Regenerative Medicine (Canadian Institutes of Health Research). F.Y.Y.H. werd ondersteund door het Training Program in Regenerative Medicine. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van Astellas Pharma Canada. We willen ook Dr. Mark Menenghini (University of Toronto) bedanken voor het gebruik van zijn Axon microarray scanner.

1. Verdunning antigenen en genereren Antigen Microarrays <ol><li> Verdun antigenen in PBS tot een eindconcentratie van 0,2 mg / ml. Druk tot 162 unieke antigenen in tweevoud met een microarrayprinter configuratie met 9 pinnen. Onder IgG en IgM antigenen in het antigeen bibliotheek als positieve controles. Omvatten PBS alleen als een negatieve controle. </li><li> Voeg 20 ul van elk antigeen aan de 384 goed bronplaat. Antigenen toevoegen bronplaat in groepen die de instelling van de printkop spiegel (bv regelen antigenen in groepen van 9 bij 9 kunnen worden gebruikt voor het afdrukken). </li><li> Cover bron plaat met folie en bevriezen bij -80 ° C tot klaar om arrays te drukken. </li><li> Reinig solide microarrayprinter pinnen door hen te incuberen in een sonicatie bad met gedemineraliseerd water gedurende 3 x 1 min. Plaats pinnen in rack te drogen en te regelen dan pinnen in microarray printkop. 9 pinnen, gebruik dan een 3 x 3-configuratie. </li><li> Programma microarrayprinter voor print gerund door het instellen van het aantal pinnen op de printkop,aantal dia&#39;s af te drukken, het aantal kussentjes op elke dia, en het aantal herhaalde plekken voor elk antigeen. Gewoonlijk gebruiken 9 pins, 70 dia&#39;s, 2 pads / glijbaan, en 2 herhaalde plekken voor elk antigeen. Programma microarrayprinter pinnen ultrasone trillingen in het water tussen verschillende groepen antigenen. </li><li> Dooi bron plaat en vervolgens centrifuge plaat gedurende 1 minuut bij 100 x g. Plaats de bron plaat in de aangewezen plek in microarrayprinter. Neem de snij folie die over de eerste groep van antigenen te drukken. </li><li> Schik onbedrukte dia&#39;s op Arrayer oppervlak en run druk programma. Print slides bij RT met vocht zich op de Arrayer bij 55-60% met de ingebouwde bevochtiger van de array machine. </li><li> Nadat elke groep antigenen op de objectglaasjes geprint, pauzeren microarrayprinter. Bedek de antigenen die net waren bedrukt met folie (om verdamping te voorkomen) en onthullen de volgende groep antigenen te drukken. Doorgaan druk programma. </li><li> Nadat alle antigenen zijn afgedrukt, cover bron plat met nieuw stuk folie en bevriezen bij -80 ° C. Plaats gedrukt dia&#39;s in dia doos en vacuüm afdichting. Slides kunnen de volgende dag tot een maand later worden gebruikt of niet. </li></ol> 2. Probing Antigen Microarrays met verdunde Sera <ol><li> Plaats de dia&#39;s in frames met behulp van incubatie kamers. Voeg 700 pl blokkerende buffer (2,5% [v / v] Foetaal kalfsserum (FCS), 0,1% [vol / vol] Tween 20 in PBS) aan elk array-oppervlak. </li><li> Plaats de zelfklevende folie over frame en plaats in een afgesloten container met een stukje natte weefsel. Incubate O / N bij 4 ° C op een rocker. </li><li> Verdunde serummonsters 1: 100 in het blokkeren van buffer. Aspireren blokkeeroplossing van arrays en voeg 500 pl verdund monster op elke array oppervlak. </li><li> Dek af met zelfklevende folie en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C met schommelen. </li><li> Verdun secundaire antilichamen in het blokkeren van buffer. Menselijke studies, verdun een Cy3 gelabeld geit anti-humaan IgG antilichaam tegen 0,33 ug / ml en een Cy5 gelabeld geit anti-human IgM-antilichaam tot 0,25 ug / ml. Voor muizen hebben verdun een Cy3 gelabeld geit anti-muis IgG antilichaam tegen 0,38 ug / ml en een Cy5 gelabeld geit anti-muis IgM antilichaam aan 0,7 ug / ml. </li><li> Aspireren monsters van arrays en spoel matrix oppervlakken 4 keer met spoelbuffer (0,1% Tween 20 in PBS). Pour buffer op om dia&#39;s en flick snel af. </li><li> Voeg 700 ul van het blokkeren van buffer aan elke array oppervlak wassen en incubeer 10 min bij RT met schommelen. Herhaal wasstap nog twee keer. </li><li> Voeg 500 ul van verdund secundair antilichaam aan elke dia oppervlak en dek af met zelfklevende folie. Incubeer 45 min bij 4 ° C met schommelen. </li><li> Zuig secundair antilichaam mengsel van dia&#39;s en spoel 4 keer als hierboven. Wassen slides 3 maal met 700 ui blokkerende / verdunningsbuffer als hierboven. </li><li> Verwijder dia&#39;s uit frames en plaats in de metalen schuif rack dat is ondergedompeld in PBS. Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur met orbitaal schudden. Plaats in nieuwe container van PBS en incubeer nog eens 20 min met schudden. </li><li> Plaats dia rek in container van gedemineraliseerd water 15 sec. Plaats rek in een nieuwe bak met water en incubeer nog eens 15 sec. </li><li> Om droge dia&#39;s, dia plaats rek op een ELISA-plaat adapter in centrifuge en draaien op 220 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats de dia&#39;s in lichtdichte doos tot klaar om te scannen. </li></ol> 3. Scanning Antigen Microarrays en Gegevens exporteren <ol><li> Scan dia&#39;s met behulp van een microarray scanner die Cy3 en Cy5 fluorescente signalen kan detecteren. Om de fotomultiplicatorbuis (PMT) niveau van de scanner passen, pre-scan één dia die alleen werd geprobed met secundaire antilichamen. Opmerking: Deze schuif is moeten de antigeen library erop gedrukt waaronder positieve (IgG en IgM) en negatieve (PBS) controlegroep. De pre-scan is een lage resolutie scan dat de gebruiker snel maakt het mogelijk om de optimale PMT instellingen te vinden. </li><li> Stel de PMT waarden, zodat het menselijk IgG-functies (op de Cy3 kanaal) en de bromeen IgM kenmerken (de Cy5 kanaal) dezelfde mediane fluorescentie-intensiteit minus achtergrond (MFI-B) (typisch 40.000). De PMT niveaus worden door op de &#39;hardware&#39; knop in te stellen. Eenmaal ingesteld, constant te houden deze PMT instellingen. </li><li> Scan de experimentele dia&#39;s op de twee kanalen door te drukken op de knop &quot;Scannen&quot;. Sla de dia&#39;s (beide kanalen) na elke scan. </li><li> Plaats de dia te analyseren in de microarray-software met behulp van de &quot;file&quot; knop. </li><li> Laad het bestand gen-array lijst (GAL) met behulp van de &quot;file&quot; knop. GAL bestand heeft de indeling van de array met de identiteit van de matrix functies. </li><li> Plaats de arraysjabloon via gescande afbeelding zodat de arrays kenmerken overeenkomen met de sjabloon zo dicht mogelijk. </li><li> Lijn functies in alle blokken met de sjabloon door op de &quot;align&quot; knop. Het programma zal in het algemeen vindt de omtrek van de cirkelvormige functies maar handmatige aanpassingen nodig zijn. Deze aanpassingen kunnen worden gemaakt door lopen de toepassingsmode. De software berekent dan een MFI-B voor elk van de antigenen. </li><li> Gebruik de &quot;file&quot; knop om deze resultaten te exporteren als een tekstbestand. </li></ol> 4. analyseren Array gegevens met de Betekenis Analyse van Microarrays (SAM) <ol><li> Laad individuele tekstbestanden in Excel en identificeren van de kolommen die MFI-B voor de Cy3 en Cy5 kanalen. </li><li> Bereken het gemiddelde van de dubbele functies. </li><li> Voor eventuele negatieve MFI-B, vervang de negatief getal met 10. Transformeer gegevens door te delen raw MFI-B met 100 en vervolgens door het berekenen van log base 2. </li><li> Analyseer log-getransformeerde gegevens Betekenis Analyse van Microarrays (SAM) zoals eerder 7 beschreven. </li><li> Voor een onderzoek met behulp van twee groepen (bijvoorbeeld gezonde controles vs. patiënten), label één groep &quot;1&quot; en de groep &quot;2.&quot; Gebruik een twee-klasse, ongepaarde analyse in SAM antigenen reactiviteiten die s te identificerenignificantly verschillend tussen beide groepen (q-waarde &lt;0,05). </li><li> Gebruik clustering en warmte-map genererende software om foto&#39;s te maken voor de presentatie 8. </li></ol>

<ol><li>Naparstek, Y., Plotz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autoantibodies+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of autoantibodies in autoimmune disease.</a> Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).</li>
<li>Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+2015%3A+From+diagnostic+biomarkers+toward+prediction%2C+prognosis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention.</a> Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).</li>
<li>Robinson, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+microarrays+for+multiplex+characterization+of+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+medicine%22%5BJournal%5D)">Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses.</a> Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).</li>
<li>Quintana, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+microarrays+identify+unique+serum+autoantibody+signatures+in+clinical+and+pathologic+subtypes+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).</li>
<li>Hueber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+microarray+profiling+of+autoantibodies+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).</li>
<li>Price, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarray+analysis+reveals+BAFF-binding+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).</li>
<li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).</li>
<li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).</li>
<li>Chruscinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Antigen+Microarrays+to+Screen+for+Autoantibodies+in+Heart+Failure+and+Heart+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation.</a> PloS one. 11, e0151224(2016).</li>
<li>Price, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+influenza+vaccine+immunogenicity+using+influenza+antigen+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays.</a> PloS one. 8, e64555(2013).</li>
<li>Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivity+profiles+of+broadly+neutralizing+anti-HIV-1+antibodies+are+distinct+from+those+of+pathogenic+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies.</a> Aids. 25, 1247-1257 (2011).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+humoral+rejection+of+human+kidney+allografts+associates+with+broad+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses.</a> Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).</li>
<li>Haddon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+epitopes+of+U1-70K+autoantibodies+at+single-amino+acid+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution.</a> Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).</li>
<li>Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of immunoglobulins.</a> J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven protocol maakt de kwantificering van auto-antilichamen met het antigeen microarray techniek. Antigeen microarrays bieden verscheidene voordelen boven conventionele ELISA screening voor autoantilichamen. Allereerst een grote antigenen zoals nucleïnezuren, eiwitten, peptiden, en cellysaten worden opgesteld op de met nitrocellulose gecoate glaasjes, hetgeen aldus gemultiplexte screenen van autoantilichamen. Bovendien, slechts microgram antigeen nodig om de arrays genereren aangezien nanoliters antigeendo...

Autoantilichamen zijn aanwezig in veel ziektetoestanden en kunnen vaak direct pathogene activiteit hebben1. Identificatie van autoantilichamen is belangrijk voor de diagnose van bepaalde ziekten, voor de prognose van het verloop van de ziekte en voor de classificatie van patiënten die mogelijk baat hebben bij specifieke therapieën2. Autoantilichamen worden doorgaans in patiëntenserum geïdentificeerd met behulp van de ELISA-techniek; het screenen op meerdere antigenen met deze techniek is echter arbeidsintensief en vereist een grote hoeveelheid monsters. Nieuwe technologieën zijn daarom nodig om autoantilichamen op grotere schaal te profileren.
De antigeenmicroarraytechniek is een proteomische technologie die het mogelijk maakt om autoantilichamen multiplex te profileren3. In de eerste stap van dit proces wordt een antigeenbibliotheek gearrayeerd op een schuifoppervlak met behulp van een robotische microarrayer. De schuiven worden beproefd met verdund serum en vervolgens worden fluorescent gelabelde secundaire antilichamen toegevoegd. Antilichaamreactiviteiten worden gevisualiseerd door de schuiven te scannen met een microarrayscanner en gekwantificeerd door fluorescente intensiteiten. Antigene microarrays bieden meerdere voordelen ten opzichte van de ELISA-techniek bij het screenen op autoantilichamen: 1) ze vereisen slechts microliters serum om autoantilichamen tegen meerdere antigenen gelijktijdig te profileren, 2) ze gebruiken antigeen spaarzaam, aangezien slechts nanoliters antigeen op de arrays worden aangebracht, 3) ze hebben een verbeterde gevoeligheid3 in vergelijking met ELISA en 4) ze maken de gelijktijdige, maar aparte detectie van meer dan één antilichaamisotype mogelijk. Antigene microarrays zijn gebruikt om autoantilichamen in auto-immuunziekten zoals reumatoïde artritis, multiple sclerose en systemische lupus erythematodes4-6 te profileren. In alle drie deze ziekten werd nieuwe inzicht in de ziektepathogenese verkregen door autoantilichamen op grote schaal met de arrays te profileren.
Hier beschrijven we een protocol om antigeenmicroarrays te genereren met behulp van met nitrocellulose beklede schuiven. Een verscheidenheid aan antigenen, waaronder eiwitten, peptiden en celextracten, kan met deze techniek op de schuiven worden gearrayeerd. De arrays kunnen eenvoudig worden aangepast door antigenen van belang in de bronplaat die de antigeenbibliotheek bevat op te nemen. Bovendien laten we zien hoe een paar secundaire antilichamen kan worden gebruikt om IgG- en IgM-reactiviteiten op hetzelfde schuifoppervlak te scheiden. We hebben deze techniek nu geoptimaliseerd om autoantilichamen bij zowel mensen als muizen te meten.

<table><tbody><tr><td>Ribosomal P0</td><td>Diarect</td><td>14100</td><td>verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>human IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>009-000-003</td><td>verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>human IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>009-000-012</td><td>verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>mouse IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5381</td><td>verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>mouse IgM</td><td>Biolegend</td><td>401601</td><td>verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>double-stranded DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>single-stranded DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8899</td><td>verdunnen tot 0,2 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>microarrayer</td><td>Virtek</td><td>VersArray Chipwriter Pro</td><td>veel soorten arrayers zijn geschikt</td></tr><tr><td>solid printing pins</td><td>Arrayit Corporation</td><td>SSP015</td><td></td></tr><tr><td>software voor robotische microarrayer</td><td>Virtek</td><td>Chipwriter Pro&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FAST slides (2 Pad)</td><td>GVS Northa America</td><td>10485317</td><td></td></tr><tr><td>FAST frame</td><td>GVS Northa America</td><td>10486001</td><td></td></tr><tr><td>FAST incubation chambers (2 Pad)</td><td>GVS Northa America</td><td>10486242</td><td></td></tr><tr><td>384 well plates</td><td>Whatman</td><td>7701-5101</td><td></td></tr><tr><td>plate sealers</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>foil plate covers</td><td>VWR</td><td>60941-124</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Invitrogen</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 goat anti-human IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-165-096</td><td>gebruik werkstock in 50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy5 goat anti-human IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-175-129</td><td>gebruik werkstock in 50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy3 goat anti-mouse IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-165-071</td><td>gebruik werkstock in 50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy5 goat anti-mouse IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-175-075</td><td>gebruik werkstock in 50% glyercol</td></tr><tr><td>Microarray Scanner</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon 4200A</td><td></td></tr><tr><td>Microarray software</td><td>Molecular Devices</td><td>Genepix 6.1</td><td></td></tr><tr><td>Clustering software</td><td>eisenlab.org</td><td>Cluster 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Heatmap software</td><td>eisenlab.org</td><td>Treeview 1.60</td><td></td></tr><tr><td>Microarray statistische software</td><td>Stanford University</td><td>SAM 4.0 (Significance Analysis of Microarrays)</td><td></td></tr></tbody></table>

genereren van tweekleurige antigen microarrays voor de simultane detectie van igg en igm autoantistoffen

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Auto-antilichamen, die antilichamen zijn tegen zelf-antigenen, zijn aanwezig in veel ziektetoestanden en kunnen dienen als markers voor ziekteactiviteit. De niveaus van auto-antilichamen tegen specifieke antigenen worden typisch gedetecteerd met de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) techniek. Het screenen op meerdere auto-antilichamen met ELISA kan echter tijdrovend zijn en vereist een grote hoeveelheid monsters van patiënten. De antigen microarray techniek is een alternatieve methode die kan worden gebruikt om auto-antilichamen op een multiplex manier te screenen. In deze techniek worden antigenen gearrayd op speciaal gecoate microscoopglazen met een robotische microarrayer. De glazen worden onderzocht met serummonsters van patiënten en vervolgens worden fluorescent-gelabelde secundaire antilichamen toegevoegd om binding van serum auto-antilichamen aan de antigenen te detecteren. De reactiviteit van de auto-antilichamen wordt onthuld en gekwantificeerd door de glazen te scannen met een scanner die fluorescente signalen kan detecteren. Hier beschrijven we methoden om aangepaste antigen microarrays te genereren. Onze huidige arrays worden gedrukt met 9 vaste pins en kunnen tot 162 antigenen bevatten die in duplicaat zijn aangebracht. De arrays kunnen eenvoudig worden aangepast door de antigenen in de bronplaat te veranderen die door de microarrayer wordt gebruikt. We hebben een tweekleurige detectiemethode voor secundaire antilichamen ontwikkeld die IgG en IgM reactiviteit op hetzelfde glazuuroppervlak kan onderscheiden. Het detectiesysteem is geoptimaliseerd om binding van humane en muis-auto-antilichamen te bestuderen.

Antigenen zijn aangebracht in een plaat met 384 putjes en gedrukt op objectglaasjes door een robot microarrayprinter zie figuur 1. Figuur 2 toont glaasjes geplaatst in een frame met incubatie kamers en een gescande dia na verwerking. Figuur 3 toont positieve en negatieve controleglaasjes. De negatieve schuif alleen maar geprobed met secundaire antilichamen, en de positieve controle dia geprobed met serum van een patiënt met systemische l...

We beschrijven hier een methode om aanpasbare antigeen-microarrays te genereren die kunnen worden gebruikt voor de gelijktijdige detectie van serum IgG en IgM auto-antilichamen van mensen en muizen. Deze arrays maken een doorvoer en kwantitatieve detectie mogelijk van antilichamen tegen willekeurige antigenen of epitopen van belang.

Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Het algemene doel van deze techniek is om autoantistoffen snel op multiplex-wijze te screenen. Deze methode kan helpen bij het identificeren van kernvragen op het gebied van autoimmuniteit, zoals welke autoantistoffen gecorreleerd zijn met verschillende ziektestadia. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat autoantistoffen parallel gescreend kunnen worden, er slechts microliters serum nodig zijn en er slechts microgrammen antigeen vereist zijn.Om antigeen-microarrays te genereren, begint u met het verdunnen van antigenen in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg/mL. Stel een configuratie van de microarrayer in met negen pinnen om maximaal 162 unieke antigenen in dubbeltoets te printen. Neem IgG- en IgM-antigenen op in de antigeenbibliotheek als positieve controles.Gebruik uitsluitend PBS als negatieve controle. Voeg 20 µL van elk antigeen toe aan de 384-well bronplaat in groepen die overeenkomen met de configuratie van de printhoofd. Dek de bronplaat af met aluminiumfolie en vries de plaat in bij -80 °C tot het moment dat de arrays geprint kunnen worden.Reinig de pinnen van de vaste microarray door ze drie keer gedurende één minuut in een ultrasoon bad met gedeïoniseerd water te incuberen. Plaats de pinnen in een rek om te drogen. Plaats de pinnen vervolgens in de microarray-printkop.Gebruik voor negen pinnen een configuratie van drie bij drie. Programmeer vervolgens de microarrayer voor de printrun door het aantal pinnen op de printkop, het aantal te printen objectglazen, het aantal pads op elk objectglas en het aantal replica-spots voor elk antigeen in te stellen. Programmeer de microarrayer daarnaast zo dat de pinnen in water worden gesoniceerd tussen verschillende groepen antigenen.Centrifugeer daarna, na het ontdooien van de bronplaat, deze gedurende één minuut bij 100 ×g. Plaats de bronplaat op de aangewezen positie in de microarrayer en verwijder vervolgens het stuk folie dat de eerste groep antigenen bedekt die geprint moeten worden. Plaats de ongeprinte objectglazen op het oppervlak van de arrayer en start het printprogramma. Print de objectglazen bij kamertemperatuur, waarbij de luchtvochtigheid op de arrayer is ingesteld op 55 tot 60%. Pauzeer de microarrayer nadat elke groep antigenen op alle objectglazen is geprint.Dek de zojuist geprinte antigenen af met folie om verdamping te voorkomen en maak de volgende groep te printen antigenen vrij. Vervolg daarna het printprogramma. Nadat alle antigenen zijn geprint, dient de bronplaat met een nieuw stuk folie te worden afgedekt en bij minus 80 degrees Celsius te worden ingevroren.Plaats de geprinte slides in een slide-doos en seal deze vacuüm. De slides kunnen de volgende dag of tot een maand later worden gebruikt. Om microarrays te sonderen met verdunde sera met behulp van incubatiekamers, moeten de slides in frames worden geplaatst.Voeg vervolgens 700 microliters blokkeringsbuffer toe aan elk array-oppervlak. Plaats de adhesieve folie over het frame en breng dit over naar een afgesloten container met een stukje nat vloeipapier. Incubeer de slides daarna gedurende de nacht bij vier graden Celsius op een rocker.Verdun de serummonsters de volgende dag 1 op 100 in blokkeringsbuffer. Aspireer vervolgens de blokkeringsoplossing uit de arrays en voeg 500 microliters van het verdunde monster toe aan elk arrayoppervlak. Dek de arrays daarna af met adhesiefilm en incubeer één uur bij vier graden Celsius, onder voortdurend schudden.Aspire vervolgens de serummonsters uit de arrays en spoel de array-oppervlakken vier keer met spoelbuffer door de buffer over de slides te gieten en deze snel af te schudden. Gebruik 700 microliters blokkeringsbuffer om elk array-oppervlak te wassen en laat dit 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur onder schudden. Voeg daarna 500 microliters verdunde secundaire antilichamen toe aan elk slide-oppervlak en dek dit af met adhesieve folie.Incubeer de coupes bij vier graden Celsius onder schudden gedurende 45 minuten. Aspireer na de incubatie het mengsel van secundaire antilichamen van de coupes en spoel vier keer af, zoals zojuist gedemonstreerd. Was de coupes vervolgens drie keer gedurende 10 minuten met 700 microliters blokkeringsdilutiebuffer.Verwijder de objectglaasjes uit de frames, plaats ze vervolgens in een metalen objectglasrekje en dompel ze onder in PBS. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur onder orbitale schudding. Plaats een objectglasrekje gedurende 15 seconden in een bak met gedeïoniseerd water.Plaats het rek vervolgens in een nieuwe bak met water en laat dit nog 15 seconden incuberen. Om de coupes te drogen, plaatst u het couperek op een ELISA-plaatadapter in de centrifuge en centrifugeert u vijf minuten bij 220 ×g en kamertemperatuur. Bewaar de coupes in een lichtdichte doos tot ze gescand worden.Gebruik voor het scannen van de slides een microarray-scanner die SI drie en SI five fluorescente signalen kan detecteren. Bepaal de optimale multiplier tube, of PMT-instellingen, door vooraf een volledige antigenbibliotheek-slide te scannen die uitsluitend met secundaire antilichamen is beproefd. Stel de gebruikte PMT-waarden in door op de hardwareknop te drukken, zodanig dat de menselijke IgG-kenmerken op het SI drie-kanaal en de menselijke IGM-kenmerken op het SI vijf-kanaal een vergelijkbare mediane fluorescentie-intensiteit minus achtergrond, of MFIB, hebben, wat doorgaans 40 000 is.Scan vervolgens de experimentele slides op de twee kanalen door op de scan-knop te drukken. Sla de slide-afbeeldingen van beide kanalen na elke scan op. Laad met de bestandsknop de te analyseren slide in de microarray-software.Gebruik vervolgens de bestandsknop om de gen-arraylijst, of GAL-bestand, te laden, waarin de indeling van de array staat met de identiteiten van de array-kenmerken. Plaats het array-sjabloon over de gescande afbeelding, zodat de kenmerken van de array zo nauwkeurig mogelijk met het sjabloon overeenkomen. Druk op de uitlijnknop om de kenmerken in alle blokken uit te lijnen met het sjabloon.De software berekent vervolgens een MFI minus achtergrond voor elk van de antigenen. Gebruik tenslotte de bestandsknop om de resultaten als tekstbestand te exporteren en analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol. In deze figuur, waarin positieve en negatieve controle-dia's worden getoond, is de negatieve dia alleen behandeld met secundaire antilichamen en is de positieve controledia behandeld met serum van een patiënt met systemische lupus erythematosus.Zoals hier aangegeven, blijkt het positieve controleserum, met bekende reactiviteit voor riboP, IgM-antilichamen tegen enkelstrengs DNA en IgG-antilichamen tegen riboP te bevatten. Lineaire responsen werden waargenomen voor IgM bij alle serumverdunningen, en voor IgG tot een MFI minus achtergrond van ongeveer 30 000. In dit experiment wordt de array onderzocht met menselijk serum van een patiënt met cryoglobulinemische vasculitis, met een gedocumenterde reumafactor, wat een IgM-antilichaam tegen IgG is.Het IgG-kenmerk is geel-groen vanwege de binding van IgM in het serum van de patiënt aan het geïmmobiliseerde IgG op de array. Bij gebruik van enkel secundaire antilichamen is geen IgM-reactiviteit zichtbaar tegen het IgG dat op de array is gespot. Hier is te zien dat muis IgM en IgG, gespot op de array, uitsluitend worden gedetecteerd met respectievelijk anti-muis secundaire antilichamen tegen IgM en IgG.Deze figuur toont de uitlijning van een sjabloonraster op een gescande array-afbeelding, met behulp van microarray-analyse-software. Zodra de uitlijning is voltooid, kunnen de array-kenmerken worden geanalyseerd om de mediane fluorescentie-intensiteit minus de achtergrond voor elk kenmerk te verkrijgen. Zodra men hiermee bekend is, kan de probing van antigeen-microarrays in vier uur worden voltooid als dit correct wordt uitgevoerd.Na deze procedure kunnen andere technieken, zoals ELISA, worden uitgevoerd om de resultaten van de antigeen-microarrays te valideren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u antigeen-microarrays print, hoe u antigeen-microarrays met serum sondeert en hoe u antigeen-microarrays met een scanner scant. Vergeet niet dat werken met menselijk serum risicovol kan zijn en dat universele voorzorgsmaatregelen in acht moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

generation-two-color-antigen-microarrays-for-simultaneous-detection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we demonstrate the process for detecting antibody isotypes in multiple human serum samples using a microarray slide printed with antigenic subtypes of influenza virus strains.

Viral Antigen Microarray Assay to Detect Antibody Isotypes in Serum Against Viral Antigen

This video demonstrates printed glycan array technology for analyzing circulating anti-glycan antibodies in mouse serum. The antibodies in the serum interact with specific glycans on the chip, which is confirmed by immunostaining followed by fluorescence scanning.

Detecting Circulating Anti-Glycan Antibodies with a Printed Glycan Array

This video demonstrates a protocol for detecting serum-specific immunoglobulin E using a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system. Serum IgEs interact with distinct allergens immobilized in the reaction zone of the cartridge, which are subsequently detected with peroxidase-conjugated anti-IgE antibodies and a chemiluminescent substrate, allowing simultaneous detection of multiple allergen-specific IgEs.

A Microfluidic Cartridge-Based Detection System for Allergen-Specific Immunoglobulin E

We tonen een module chiptechnologie voor het uitvoeren van cross-country-reactivity-vrije multiplexed sandwich-immunoassay door simpelweg twee dia's uitlijnen. Een apparaat module wordt gebruikt voor het op betrouwbare wijze overbrengen van reagentia van microarray-naar-microarray. De module-chip kan worden gebruikt voor alle biochemische reacties vereisen colocalization van verschillende reagentia zonder kruisbesmetting.

Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay

Hier voorgesteld hebben we de methoden voor het detecteren van menselijke islet autoantilichamen met behulp van electrochemiluminescence (ECL) testen. Het protocol, gebruikt voor het voorspellen van type 1 diabetes, kan worden uitgebreid om te detecteren autoantilichamen voor andere auto-immune ziekten.

Electrochemiluminescence testen voor menselijke Islet autoantilichamen

We presenteren een protocol voor het gebruik van een proteïne-Microarray die is geconstrueerd door het afdrukken van influenza-antigenen op nitrocellulose gecoate dia's om gelijktijdig sonde serum te gebruiken voor meervoudige antilichaam isotypes tegen meer dan 250 antigenen van verschillende virusstammen, dus het meten van de breedte van serum antilichamen over virus subtypen mogelijk te maken.

Gebruik van een influenza antigeen Microarray voor het meten van de breedte van serum antilichamen over de virus subtypen

We modelleren een eenvoudige multiplexed ECL-test die 7 autoantilichaamtests samen combineert. De test is in staat om tegelijkertijd te screenen op T1D en meerdere andere auto-immuunziekten, waaronder coeliakie, auto-immuun schildklierziekte en auto-immuun polyglandulair syndroom 1.

Een high-throughput elektrochemiluminescentie 7-Plex-test die tegelijkertijd screent op type 1 diabetes en meerdere auto-immuunziekten

Een stroomanalysesysteem voor op kralen gebaseerde multiplexed-assays dat een twee-reporter-uitlezing biedt, werd gebruikt voor de ontwikkeling van multiplex serologische en antilichaamneutralisatietests die tegelijkertijd neutraliserende IgG- en IgM-antilichamen voor SARS-CoV-2 kunnen meten.

Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

In lijn met de dringende behoefte aan screening op type 1 diabetes, coeliakie en coronavirusziekte 2019, hebben we een high throughput 6-Plex elektrochemiluminescentietest ontwikkeld om tegelijkertijd alle vier de eilandjesautoantilichamen, weefseltransglutaminase autoantilichamen en antilichamen tegen het receptorbindingsdomein van ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 te detecteren.

Een high-throughput multiplexed screening voor type 1 diabetes, coeliakie en COVID-19

Een driekanaals dual-reporter fluorescentiestroomanalysesysteem werd gebruikt om een op kralen gebaseerde multiplex-immunoassay te ontwikkelen die tegelijkertijd serummonsters evalueert voor IgG en IgM die worden opgewekt tegen meerdere antigenen van verschillende Borrelia-soorten die Lyme-borreliose veroorzaken in Europa en Noord-Amerika.

Gelijktijdige detectie van verschillende antilichaamklassen in een gemultiplexte serologische test

Leer hoe u tweekleurige antigenmicroarrays genereert voor de simultane detectie van IgG- en IgM-autoantistoffen in menselijk en muizenserum. Deze methode maakt hoogdoorvoer screening mogelijk met minimale hoeveelheden serum.

Genereren van tweekleurige Antigen Microarrays voor de simultane detectie van IgG en IgM Autoantistoffen

Meer video's verkennen