Name: Adenofection: Un metodo per studiare il ruolo di chaperoni molecolari in Cellular Morfodinamica da esperimenti Depletion-Rescue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Scopri l'adenofezione per esperimenti depletion-rescue che preservano l'integrità cellulare e l'omeostasi proteica. Questo metodo consente analisi funzionali di proteine coinvolte in mitosi e miogenesi a livello di singola cellula.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), dalla Fondazione Bellini e dalla Fondazione Roby.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, abbiamo descritto un metodo che consenta esperimenti svuotamento soccorso da eseguire, che è applicabile ad analisi funzionali dei processi cellulari biologici che sono particolarmente sensibili alla sovraespressione di proteine ​​che interessano la stechiometria e la dinamica di complessi proteici e strutture macromolecolari. la divisione cellulare mitotico è un esempio estremo di morfodinamica cellulari finemente sintonizzato che coinvolge i cambiamenti più drammatici e spettacolari nella struttura generale di un...

inattivazione funzionale di espressione genica in cellule di mammifero è il gold standard per sezionare le funzioni delle proteine. Tecnologie di editing del genoma basata sull&#39;uso di nucleasi specifiche del sito, come nucleasi zinc-finger di nuova concezione e cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CAS9 ora permettono la generazione di linee cellulari con mirata delezione del gene e la mutazione 1,2. Questi nuovi approcci dovrebbero rivoluzionare il modo in cui stiamo studiando la funzione delle proteine ​​e la nostra comprensione della genetica delle malattie umane. In alcuni casi, tuttavia, a lungo termine o completa knockout gene non è auspicabile e possono provocare meccanismi di compensazione cellule secondarie. La generazione di linee cellulari geneticamente modificati può anche essere limitante quando si tratta di colture cellulari primarie con capacità proliferativa limitata, o quando è richiesta proiezione di un grande insieme di mutazioni in vari tipi cellulari. Questo è spesso necessario per determinare la dipendenza di una cella bprocesso iological sui requisiti strutturali di una proteina. A tal fine, atterramento reversibile da RNA interference che consente esperimenti di deplezione-salvataggio transitori in vari ambiti di cellulari rimane ancora un approccio semplice e potente per eseguire le analisi struttura-funzione di una proteina di interesse 3. Tuttavia, un grave inconveniente di questo approccio è la difficoltà di raggiungere silenziamento efficiente e reintrodurre la proteina di interesse o sue varianti a livelli fisiologici vicino nella maggior parte della popolazione cellulare. Ciò è essenziale per consentire studi approfonditi che tentano di correlare effetti funzionali osservati a livello delle singole cellule (fenotipo hypomorphic) con quelli osservati in saggi basati sulla popolazione di cellule, per esempio sulle interazioni proteina-proteina. Utilizzando metodi di trasfezione classici, difficilmente si può ottenere espressione omogenea e bassa di proteine ​​esogene in una vasta popolazione di cellule. Trasduzione di cellule con virus ricombinanticome adenovirus spesso permette un&#39;espressione più normalizzata di proteine ​​esogene. Tuttavia, l&#39;assorbimento adenovirus è limitata dal recettore CAR, che è assente in cellule non-umane o solo debolmente espressa in alcuni tipi di cellule umane. Inoltre, l&#39;entrata cellulare di adenovirus attiva percorsi che regolano la forma delle cellule e l&#39;adesione 4-6 segnalazione. Questo ovviamente non è desiderabile quando si studiano meccanismi regolatori della morfodinamica cellulari. Siamo stati di fronte a questa problematica quando abbiamo intrapreso analisi funzionali di un complesso chaperone, BAG3-HSPB8, nella divisione cellulare e le dinamiche di actina. Lavoro pionieristico aveva descritto un ruolo per questo complesso di proteine ​​chaperone controllo di qualità e l&#39;autofagia durante lo stress 7,8. La maggior parte di questi studi, tuttavia, invocata iperespressione della proteina, partendo dal presupposto che le accompagnatori sono normalmente sovraregolati durante lo stress. Questo ha lasciato aperta la questione se BAG3, in complesso con HSPB8, può contribuire al normale funzionamento delle cellule in divisione che esprimono °accompagnatori ESE come molti tipi di cellule di cancro 9. In particolare, se il complesso chaperone contribuisce al rimodellamento delle strutture di actina-based che controllano la progressione mitotico è stato di grande interesse, date le connessioni emergenti tra accompagnatori HSPB e le dinamiche del citoscheletro 10. Per risolvere questo problema, abbiamo cercato di sviluppare un metodo efficiente per gli esperimenti esaurimento-soccorso che non interferire con la progressione mitotico o morfologia cellulare, e che sarebbe conservare l&#39;omeostasi delle proteine ​​al fine di evitare perturbazioni secondaria della dinamica dei complessi macromolecolari che regola i cambiamenti-forma delle cellule . Così idealmente, l&#39;esaurimento-add-back del gene di interesse deve essere eseguita simultaneamente. L&#39;uso di complessi di adenovirus con un polimero cationico o lipidi è stata descritta per promuovere il trasferimento genico in vitro e in vivo 11,12. Per esempio, fosfato di calcio (CAPI) sembra formare un precipitato conadenovirus che migliorano il virus vincolante-ingresso attraverso un percorso CAR-indipendenti 13. Infatti, abbiamo scoperto che la combinazione di adenovirus-based trasduzione cellulare e trasfezione con composti cationici potrebbe migliorare l&#39;efficienza degli esperimenti svuotamento soccorso. Ciò ha permesso di abbassare la quantità di virus da 3 a 20 volte, a seconda della linea cellulare e il gene di interesse, e beneficiare di una finestra più ampia al fine di regolare l&#39;espressione di proteine ​​esogene a livelli vicini endogeni nella maggioranza di una popolazione di cellule con un impatto minimo sulla morfologia cellulare. In tali condizioni, si potrebbe anche ottenere un&#39;elevata efficienza knockdown dell&#39;espressione della proteina endogena (&gt; 75%). Con la presente descriviamo il passaggio Metodo passo e fornire la prova che l&#39;omeostasi delle proteine ​​non è significativamente perturbato come valutato dai livelli invariati di accompagnatori di stress-indotta della famiglia heat shock protein, rendendo il metodo adatto per le analisi funzionali della ro fisiologicoLe di chaperon molecolari per il video microscopia time-lapse. Il protocollo è suscettibile di procedure di sincronizzazione delle cellule e per l&#39;utilizzo del baculoviruses disponibili in commercio per la co-espressione di bassi livelli di marcatori fluorescenti, con la minima interferenza con le normali dinamiche di actina-based e mandrino durante la progressione mitotico. Mostriamo ulteriormente la versatilità del metodo, applicabile a &quot;duro&quot; trasdurre cellule C2C12 mouse, senza alcun impatto significativo sulla differenziazione dei mioblasti in miotubi in vitro.

<table><tbody><tr><td>C2C12 Mioblasti di topo</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus design personalizzato</td><td>Welgen</td><td>design</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg; Actina-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10582</td><td></td></tr><tr><td>CellLight® Tubulina-RFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10614</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM), Alto glucosio</td><td>Thermo Fisher</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Piatti con fondo in vetro, 35 mm</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-20-C Custodia</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-RFP-H2B</td><td>Gentile dono della dottoressa Sabine Elowe, Qu&eacute; bec, Canada</td><td></td><td>Klebig C et al. 2009</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo, Nuova Zelanda</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina&reg; Reagente di trasfezione RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Terreno minimo essenziale (MEM) Alpha</td><td>Wisent</td><td>310-101-CL</td><td></td></tr><tr><td>Terreno minimo essenziale (MEM) Alpha senza desossiribouleosidi/ribonucleosidi</td><td>Thermo Fisher</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>Terreno minimo essenziale (MEM) Alpha senza rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Biobasic</td><td>S0404</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>rAVCMV-LifeAct-TagGFP2</td><td>IBIDI</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>siRNA duplex</td><td>Dharmacon</td><td>Design</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>Timidina</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 2,5%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15090-046</td><td></td></tr></tbody></table>

adenofection: un metodo per studiare il ruolo di chaperoni molecolari in cellular morfodinamica da esperimenti depletion-rescue

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

processi cellulari come la mitosi e la differenziazione cellulare sono regolate da cambiamenti nella forma delle cellule che in gran parte si basano su una corretta rimodellamento delle strutture del citoscheletro delle cellule. Questo prevede il montaggio-smontaggio di strutture macromolecolari ordine superiore in un dato momento e luogo, un processo che è particolarmente sensibile alle perturbazioni provocate da sovraespressione di proteine. Metodi che preservare dell&#39;omeostasi proteica e mantenere la morfologia vicino a normale cellulare sono altamente desiderabili per determinare il contributo funzionale di una proteina di interesse in una vasta gamma di processi cellulari. Transitori esperimenti esaurimento-soccorso basate su RNA interference sono approcci potenti per analizzare le funzioni delle proteine ​​e dei requisiti strutturali. Tuttavia, reintroduzione della proteina bersaglio con deviazione minima dal suo livello fisiologico è una vera sfida. Qui si descrive un metodo denominato adenofection che è stato sviluppato per studiare il ruolo di chaperon molecolari und partner nel normale funzionamento di cellule in divisione e il rapporto con l&#39;actina rimodellamento. cellule HeLa sono state esaurite di BAG3 con duplex siRNA mira la regione 3&#39;UTR. proteine ​​BAG3 GFP-tagged sono stati reintrodotti simultaneamente in&gt; 75% delle cellule utilizzando adenovirus ricombinanti accoppiati ai reagenti di trasfezione. Adenofection ha permesso di esprimere proteine ​​BAG3-GFP a livelli fisiologici vicino in cellule HeLa impoverito di BAG3, in assenza di una risposta allo stress. Nessun effetto è stato osservato sui livelli di endogeni accompagnatori heat shock protein, i principali regolatori di stress-inducibile di omeostasi delle proteine. Inoltre, aggiungendo baculoviruses guida l&#39;espressione di marcatori fluorescenti al momento della cella di trasduzione-trasfezione, potremmo sezionare dinamiche cellulari mitotiche da time-lapse microscopica analisi con perturbazione minima di progressione mitotica normale. Adenofection è applicabile anche alle cellule di topo difficili da infettare, e adatto per analisi funzionali di mioblasti differenziazione in miotubi. Così adenofection fornisce un metodo versatile per eseguire struttura-funzione analizza delle proteine ​​coinvolte nei processi biologici sensibili che si basano sulla dinamica del citoscheletro di ordine superiore.

Trasfezione di BAG3-GFP DNA plasmidico utilizzando lipidi cationici è stata associata con l&#39;espressione eterogenea in cellule HeLa, alcune cellule mostrano livelli malapena rilevabili di proteine ​​e altri cuscinetti livelli molto elevati BAG3 (Figura 2A). In queste cellule, perdita dell&#39;omeostasi proteina è stata evidenziata da accumulo di BAG3-GFP in aggregati perinucleare (Figura 2A, frecce). Al contrario, la trasduzione delle cellule con aden...

Descriviamo un metodo per esperimenti di salvataggio della deplezione che preserva l'integrità cellulare e l'omeostasi delle proteine. L'adenofemazione consente analisi funzionali delle proteine all'interno di processi biologici che si basano su dinamiche basate sull'actina finemente sintonizzate, come la divisione cellulare mitotica e la miogenesi, a livello di singola cellula.

Adenofection: Un metodo per studiare il ruolo di chaperoni molecolari in Cellular Morfodinamica da esperimenti Depletion-Rescue

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

L'obiettivo generale di questo metodo è consentire la realizzazione di esperimenti di recupero dopo deplezione in condizioni che preservino l'integrità cellulare e l'omeostasi proteica, per analisi funzionali di processi biologici a livello di singola cellula.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo le funzioni proteiche e i requisiti strutturali nella dinamica cellulare, come la mitosi e la differenziazione cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica consiste nell'eliminare una proteina di interesse e nel reintrodurre contemporaneamente una variante di tale proteina a un livello prossimo a quello fisiologico nella maggior parte delle cellule di una popolazione.Iniziare rivestendo le piastre con fondo in vetro con fibronectina. Per fare ciò, diluire un campione stock di fibronectina da un milligrammo per millilitro di un rapporto di uno a 100 con PBS sterile.Aggiungere un millilitro in ogni piastra da 35 millilitri per coprire l'intera superficie. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Durante l'incubazione, preriscaldare l'alpha MEM integrato con il 10% di FBS e un'aliquote di tripsina EDTA allo 0,05% a 37 gradi Ce

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Biologia

In questo protocollo un metodo per misurare ripiegamento delle proteine ​​intracellulari dopo shock termico è descritto. Questo metodo può essere utilizzato per studiare foldases come chaperon molecolari e la loro co-fattori o composti in grado di influenzare la loro attività. Attività Firefly luciferasi viene utilizzato come reporter per misurare l'attività ripiegamento accompagnatore.

Ripiegamento di analisi intracellulari

Fonte: Dahl, J. et al. Rilevamento dell'attività dipendente dal pH di Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro e In Vivo. J. Vis. Esp. (2016)Questo video dimostra un saggio basato su spettrofotometro a fluorescenza per valutare l'attività di chaperone su una proteina del substrato sotto stress acido e termico. Essa delinea i passaggi per monitorare lo sviluppo e l'aggregazione del substrato tramite la diffusione della luce, confrontando le condizioni con e senza il chaperone.

Valutazione dell'attività batterica di chaperone tramite lo spiegamento termico di una proteina modello

Questo articolo descrive l'uso di una proteina di fusione GFP-luciferasi lucciola per...

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Questo studio descrive le tecniche biofisiche, biochimiche e molecolari per caratterizzare l'attività chaperone di Escherichia coli HdeB in condizioni di pH acido. Questi metodi sono stati applicati con successo per altri accompagnatori acido-protettivi come HdeA e può essere modificato a lavorare per altri accompagnatori e condizioni di stress.

Rilevamento del pH-dipendente attività di<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Descriviamo come tecniche di micro - e photomanipulation come FRAP e fotoattivazione permettono la determinazione dei parametri di motilità e la dinamica spazio-temporale delle proteine all'interno di migrazione delle cellule. Letture sperimentali includono subcellulare dinamiche e fatturato dei regolatori della motilità o del citoscheletro di actina sottostante.

Tecniche di micromanipolazione che consente analisi delle dinamiche morfogenetiche e fatturato dei regolatori del citoscheletro

Uno della più difficili condizioni di stress che gli organismi si incontrano durante la loro vita comporta un accumulo di ossidanti. Durante lo sforzo ossidativo, le cellule si basano pesantemente su chaperoni molecolari. Qui, presentiamo i metodi utilizzati per indagare la redox-regolati anti-aggregazione attività, nonché monitorare i cambiamenti strutturali che disciplinano la funzione di chaperone utilizzando HDX-MS.

Definizione attività di Chaperone Redox-regolati di Hsp33 e mappatura cambiamenti conformazionali su Hsp33 usando la spettrometria totale di scambio di idrogeno-deuterio

Le proteine Cognate J-domain cooperano con l'accompagnatore Hsp70 per assistere in una miriade di processi biologici che vanno dal ripiegamento proteico alla degradazione. Qui, descriviamo un analisi di legatura di prossimità in situ, che consente il monitoraggio di questi macchinari chaperone tradotti transitoriamente in cellule batteriche, lieviti e umane.

Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

Per studiare le interazioni chaperone-chaperone e chaperone-substrato, eseguiamo screening di interazione sintetica in Caenorhabditis elegans utilizzando l'interferenza dell'RNA in combinazione con mutazioni lievi o sovraespressione di chaperoni e monitoriamo la disfunzione proteica tessuto-specifica a livello di organismo.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche

Questo protocollo presenta una tecnica per sondare le interazioni proteina-proteina utilizzando perle donatrici legate al glutatione con co-chaperoni tPR fusi GST e perle accettori accoppiate con un peptide derivato da Hsp90. Abbiamo usato questa tecnica per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.

Studi di interazioni Chaperone-Cochaperone utilizzando il saggio omogeneo basato su perle

Questo protocollo descrive una batteria di metodi che include la cromatografia analitica di esclusione dimensionale per studiare l'oligomerizzazione e la stabilità dell'istone chaperone, il saggio pull-down per svelare le interazioni chaperone-istone degli istoni, l'AUC per analizzare la stechiometria dei complessi proteici e il saggio di chaperoning degli istoni per caratterizzare funzionalmente un presunto chaperone istonico in vitro.

In vitro Caratterizzazione degli Chaperoni degli istoni mediante saggi analitici, pull-down e chaperoning

DNA curtain, una tecnica di imaging ad alto rendimento di una singola molecola, fornisce una piattaforma per la visualizzazione in tempo reale di diverse interazioni proteina-DNA. Il presente protocollo utilizza la tecnica della cortina del DNA per studiare il ruolo biologico e il meccanismo molecolare di Abo1, una ATPasi AAA+ contenente bromodominio pombe di Schizosaccharomyces .

Decifrare il meccanismo molecolare dell'assemblaggio degli istoni mediante la tecnica della tenda del DNA

Scopri l'adenofezione per esperimenti depletion-rescue che preservano l'integrità cellulare e l'omeostasi proteica. Questo metodo consente analisi funzionali di proteine coinvolte in mitosi e miogenesi a livello di singola cellula.

Adenofection: Un metodo per studiare il ruolo di chaperoni molecolari in Cellular Morfodinamica da esperimenti Depletion-Rescue

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