Name: Rápida análise de fenótipos circadianos em Arabidopsis Protoplastos transfectadas com um relógio Reporter luminescentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a analisar fenótipos circadianos em Arabidopsis usando protoplastos transfectados com repórteres luminescentes. Este método rápido permite estudar ritmos biológicos sem linhagens transgênicas estáveis.

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Gostaríamos de agradecer ao Prof. David Somers e ao Dr. Jeongsik Kim pelo plasmídeo repórter de luciferase e pelo desenvolvimento do método inicial. A Prof. Karen Halliday gentilmente forneceu todas as linhagens mutantes circadianas usadas neste estudo. Esta pesquisa foi apoiada pelas bolsas de pesquisa da Royal Society RS120372 e RS140275. GvO é pesquisador da Royal Society University (UF110173).

NOTA: Neste protocolo, reagentes e volumes descritos são expressos por linha Arabidopsis que é testado, e resultará em seis poços replicados para que o genótipo. Multiplicar os materiais com o número de linhas a serem analisados ​​ao analisar mais do que uma linha. No vídeo, do tipo selvagem de Arabidopsis serão comparados com o relógio circadiano mutante ZTL linha (embora os resultados representativos de linhas adicionais serão fornecidos posteriormente). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> solução de enzima </td><td></td></tr><tr><td> celulase </td><td> 0,5% (w / v) </td></tr><tr><td> pectinase R10 </td><td> 0,25% (w / v) </td></tr><tr><td> D-manitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> solução W5 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> solução de MMG </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> D-manitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> solução de PEG </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40% (w / v) </td></tr><tr><td> D-manitol </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td&gt; <td> 100 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> solução de imagem </td><td></td></tr><tr><td> solução W5 </td><td> até ao volume final </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> luciferina </td><td> 1,2 mm </td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Lista de soluções. 1. Preparação de Materiais e buffers <ol><li> materiais vegetais <ol><li> Manter Arabidopsis Col -0 sementes em água em um tubo de 1,5 ml, a 4 ° C no escuro durante quatro dias. Pipeta as sementes no solo em uma panela e transferir para condições de dia longo (16 horas de luz 8 h escuro) a 21 ° C durante 7 dias. Deixar uma tampa na panela durante os primeiros três dias para assegurar a alta humidade. Transplante de seis mudas para uma nova 8 cm x 13 cm x 5 cm panela e continuar a crescer as plantas sob as mesmas condições para another 21 dias. Verifique se o solo está úmido por toda parte. </li></ol></li><li> O plasmídeo repórter <ol><li> Purifica-se o CCA1pro: plasmídeo repórter LUC 19 a partir da cultura bacteriana previamente, usando um kit de isolamento de ADN de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: 20 ug de plasmídeo repórter é requerida (10 ul em 2 mg / mL em dH2O) para uma transfecção. </li></ol></li><li> soluções NOTA: Para este protocolo são necessários cinco soluções: solução de enzima, solução de lavagem 5 (W5) solução, manitol-magnésio (MMG), polietileno glicol (PEG) de solução e solução de imagem (Tabela 1). Prepare estes antes de prosseguir para a etapa de isolamento de protoplastos. <ol><li> Preparar 10 ml de solução de enzima conforme a Tabela 1, a adição de enzimas anterior, e filtra-se esterilizar a solução através de um filtro de seringa de 0,22? M. </li><li> Prepare as soluções restantes nos seguintes volumes: 15 ml W5 solução, 10 ml MMG solution, 1 ml de solução PEG e solução de imagem 1,5 ml conforme a Tabela 1. NOTA: É importante que a solução de PEG é não menos do que um preparado h antes da transfecção para assegurar que o PEG tem totalmente dissolvido. Filtro de esterilizar a solução de imagem através de um filtro de seringa de 0,22? M. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Figura 1:. O isolamento de protoplastos As folhas de plantas de Arabidopsis adultos (A) são fixas na fita de autoclave com a camada epidérmica inferior voltada para cima (B). (C) fita mágica é suavemente pressionada contra a camada epidérmica inferior com a ponta de um tubo de 15 ml. (D) A fita mágica é removida para expor as células de mesófilo (E). (F) Tiras de fita de autoclave com licenças ligados são flutuados na solução de enzima contendo celulase e pectinase, libertando protoplastos na solução. (G) A folha esqueletos permanecem na fita de autoclave após a digestão enzimática e são descartadas, deixando os protoplastos em solução de enzima (H). Finais protoplastos mesofilo resultantes (Barra de escala = 50 mm) (I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2. protoplastos Isolamento <ol><li> Rotular uma placa de Petri e adicionar 10 ml de solução de enzima esterilizada por filtração. </li><li> Fix quatro tiras de fita autoclave com o lado adesivo para cima sobre uma superfície laboratório limpo, e marcar o tamanho da placa de Petri nas tiras. </li><li> Corte as folhas de 4 semanas plantas velhas (Figura 1A), e pressione a epiderme superior na fita autoclave (ou seja, a superfície epidérmica inferior voltada para cima ( <strong&gt; Figura 1b)). </li><li> Pressione suavemente as tiras de fita mágica sobre a superfície epidérmica inferior utilizando um tubo de 15 ml. Tome cuidado para não esmagar o tecido foliar (Figura 1c). Retire cuidadosamente a fita mágica fora para retirar a epiderme inferior (Figura 1d) e expor as células do mesofilo (Figura 1e). </li><li> Cortar a fita de autoclave para ajustar a placa de Petri, use uma pinça para mover a fita no prato de petri e flutuar sobre a solução de enzima (Figura 1F), deixa voltado para baixo. Rodar a 60 rpm num agitador de plataforma durante 60 min, durante o qual os protoplastos será libertado para a solução. </li><li> Use uma pinça para remover e descartar as tiras de fita autoclave (Figura 1 g) e pipeta a solução contendo os protoplastos (Figura 1h) em um tubo de 50 ml. Use uma ponteira de grande calibre (como uma dica P5000 ou uma dica P1000 com o fim cortadas). </li><li> Centrifugar os protoplastos em 100 xg durante 3 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante com uma pipeta. Tome cuidado, pois o pellet é muito solto. </li><li> Adicionar solução W5 10 ml aos protoplastos e ressuspender suavemente agitando o tubo. </li><li> Descanse os protoplastos em gelo durante 30-60 minutos. Durante esta etapa, avaliar um rendimento de protoplastos por contagem num hemocitómetro (Figura 1-I). </li><li> Recolher os protoplastos por centrifugação a 100 x g durante 3 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante com uma pipeta. Tome cuidado, pois o pellet é muito solto. </li><li> Ressuspender as protoplastos para uma concentração de 5 x 10 5 protoplastos / ml em solução MMG. </li></ol> 3. protoplastos transfecção <ol><li> Adicionar 10 ul de plasmídeo repórter (2 ug / uL) para um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 400 uL de protoplastos para o tubo. </li><li> Adicionar um volume (410 mL) solução de PEG e misture invertendo suavemente o tubo 12 vezes para transfectar os protoplastos. </li><li> Após 8-15 min incubation à temperatura ambiente, diluir a mistura de protoplastos-ADN-PEG com quatro volumes (1640 uL) solução W5 e misturar por inversão suave seis vezes. </li><li> Recolher os protoplastos transfectados por centrifugação a 100 xg durante 2 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante com uma pipeta. Mais uma vez, tome cuidado, pois o pellet é muito solto. </li><li> Ressuspender os protoplastos em solução de imagem ul 1.250. </li><li> Alíquota de 200 ul em seis cavidades replicadas de uma placa de 96 poços, preencher quaisquer vazios poços com solução W5, e selar a placa com uma tampa transparente adesivo adequado para imagiologia luminescente. </li></ol> 4. Criação de Imagens <ol><li> Transferir a placa para qualquer configuração de imagem luminescente adequado para imagens de plantas. Mudar as tampas adesivas sobre as placas 10-15 minutos após a transferência para evitar diferenças de condensação e de pressão entre os poços, em seguida, começar de imagem. Ler a placa a cada ~ 45 min (3 s por poço) durante cinco dias à temperatura ambiente. Note ofrequência da placa lê e o tempo de leitura por poço pode variar dependendo da estrutura de imagem. </li></ol> Análise 5. Os dados <ol><li> Analisar os resultados de luminescência usando qualquer software de análise (por exemplo, Biological Rhythms Analysis System Software (BRONZE) 22). Compare a linha mutante para controles do tipo selvagem para revelar defeitos circadianos. </li></ol>

<ol><li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, apresentamos um ensaio rápido para rastrear defeitos período circadianos em linhas de Arabidopsis, incluindo o isolamento de protoplastos, transfecção, e imagiologia luminecent. O período circadiano no tipo selvagem Arabidopsis eo relógio mutantes CCA1 / lhy, ZTL e CCA1 OX foi calculado a partir de medições de luminescência de um CCA1pro: Repórter da LUC e verificou-se ser consistente com os dados publicados gerados a partir de plantas inteiras usando mais tempo- consumindo abordagens transgénicas (Tabela 2). Utilizando este ensaio para rastrear os mutantes de Arabidopsis evita o requisito inicial para gerar linhas transgénicas luminescentes, que é demorado e apenas pode mostrar que um mutante particular, exibe ritmos de tipo selvagem. Uma clara vantagem deste protocolo é que qualquer linha de Arabidopsis podem ser rastreados em curto espaço de tempo para os ritmos circadianos alterados de transcrição, o que ajudará a identificação de mais genes que afetam a cronometragem em plantas. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Isolamento de protoplastos pode ser trabalhoso, especialmente se a linha mutante exibe um fenótipo anão. Métodos descritos anteriormente para gerar protoplastos envolvem o corte ou folhas de plântulas em tiras finas e de vácuo que se infiltram as tiras com solução de enzima para permitir que os enzimas para atingir as paredes celulares 26,27. A digestão subsequente requer, pelo menos, 3 horas de incubação no escuro a libertar os protoplastos para a solução de enzima. Quando infiltração por vácuo não é aplicada, tempo de incubação até 18 horas é recomendado. No protocolo aqui apresentado, infiltração por vácuo é desnecessário porque a camada de células epidérmicas impenetrável para as enzimas é removida pela fita adesiva. Ao gerar protoplastos cortando material vegetal é necessário protoplastos separar os restos da parede celular após a digestão; Isto é feito tipicamente por filtração da solução ou purificando-o em um gradiente de açúcar 27,26. Aqui, qualquer tecido não digerido permanecerá na fita autoclave depoisdigestão, assim filtração e purificação com gradiente de açúcar dos protoplastos pode ser omitido. Há uma chance de que o estresse resultante de procedimentos protoplasting prolongados afeta a viabilidade celular eo relógio circadiano. O método protoplasting baseado em fita 20 visualizados aqui produz um elevado número de protoplastos; e determinado a viabilidade das células ao longo de uma série de tempo circadiano e os comprimentos correspondentes período de protoplastos e plantas inteiras (Tabela 2), a metodologia aqui descrita é preferido em relação aos métodos alternativos para gerar protoplastos. A etapa de transfecção do protocolo é um passo crítico que os impactos sobre a viabilidade dos protoplastos. A solução de PEG permite que o ADN a ser emitido para dentro da célula, e o tempo de incubação nesta solução (passo 3.4) e a percentagem de PEG deve ser determinada empiricamente. A concentração do padrão é de 20%, com concentrações mais baixas reduzem a eficiência de transformação e maiorconcentrações reduzindo a viabilidade 28. O tempo de incubação tão curto quanto cinco minutos poderia render transfecção eficiente dos protoplastos 27. Os protoplastos podem ser visualizados em qualquer plataforma de imagem luminescente. Neste vídeo, utilizou-se um leitor de placas de luminescência equipado com luzes externas (vermelho e azul, os LEDs 630 e 470 nm, respectivamente, a uma intensidade combinada de ~ 20 μE), que permite a pesquisa de alto rendimento e medições frequentes. Outros equipamentos de imagem que detecta luminescência, tais como leitores de placas ou configurações alternativas com base em torno de um dispositivo (CCD) de acoplamento de carga, pode ser aplicado igualmente bem, desde que a iluminação está disponível para a fotossíntese. A vantagem de utilizar uma câmara CCD montada num armário controlável é que a luz e temperatura podem ser programados. Uma desvantagem é o tempo de captura mais tempo, a introdução de períodos prolongados de escuridão que podem causar estresse aos protoplastos, além de perturbaring cronometragem endógeno. Independentemente de qual plataforma experimental é escolhido, o ajuste de configurações é provável que seja necessário em comparação com configurações para mudas ou plantas maduras. Em nossa experiência, aumentando as concentrações de plasmídeo repórter durante a transfecção e / ou luciferina no buffer de imagens pode resolver todos os ritmos irregulares ou rapidamente de amortecimento que podem ocorrer em experimentos iniciais. Em experiências subsequentes, a metodologia descrita aqui pode ser aplicado para estudar o fenótipo circadiano de qualquer linha de Arabidopsis mutantes. Com pequenas modificações, por exemplo, o efeito de várias drogas na cronometragem pode ser estudada nesta configuração. Além disso, a transfecção pode ser modificado para incluir microARN artificial para silenciamento de genes 19, expandir ainda mais a versatilidade do presente protocolo. Protocolos para gerar protoplastos de arroz são bem estabelecida 29 e o protocolo de imagem aqui apresentada poderia igualmente ser aplicada para promover nossa understanding do relógio na economicamente importantes plantas cultivadas monocotiledôneas.

A maioria dos organismos vivos possuem uma cronometrista endógena para auxiliar negociação eficaz das variações diárias para o ambiente. Este cronometrista, o relógio circadiano, regula muitos aspectos do metabolismo e fisiologia de um organismo para antecipar as mudanças previsíveis no ambiente externo. Nas plantas, por exemplo, a antecipação de patógenos ou herbívoros ataques temporalmente previsíveis reduz fortemente a suscetibilidade geral 1-4. Metabolismo do amido é rigidamente controlado pelo relógio circadiano para garantir que as reservas de amido última até o amanhecer se crescido a longas ou curtas condições de dia 5. Na verdade, as plantas com relógios circadianos que correspondem aos ambiente mostram o aumento das taxas de crescimento de 24 hr, as taxas de fixação de carbono e as taxas de sobrevivência em comparação com plantas que executam um relógio de período incompatíveis 6. A grande influência dos ritmos circadianos em todos estes processos surge em grande medida a partir da regulação ritmada de até um terçodo transcriptoma total na Arabidopsis 7. Estes produtos de genes estão envolvidos em rítmicos uma ampla variedade de processos celulares, incluindo vias metabólicas, hormona de sinalização, e respostas de stress 7. Além disso, a regulação circadiana direta da função da proteína é estabelecido pela regulação circadiana da fosforilação 8 e, muito provavelmente outras modificações pós-traducionais (PTMs). No centro do relógio circadiano que impulsiona essa reprogramação transcricional diária encontra-se uma rede de transcrição / feedback translacional loops (TTFLs), incluindo os genes expressos de manhã CIRCADIANO relógio associado 1 (CCA1) e tardia alongada hipocótilo (LHY) que reprimem a expressão do genes noite CALENDÁRIO dE CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) e os membros do complexo à noite (CE); LUX ARRHYTHMO (LUX), floração precoce 3 (ELF3) e ELF4 9-11. sagacidade juntosh os -genes REGULADOR DE PSEUDO de resposta (PRR3, 5, 7 e 9), TOC1 reprime CCA1 expressão / LHY enquanto a CE atua como um regulador positivo 12-14. Adicional para mecanismos de feedback, pós-transcricional e pós-translacional regulação dos componentes de rede TTFL desempenha um papel importante no ritmo circadiano de ajuste. Até à data, a PTM mais abundantes em proteínas relógio circadiano é fosforilação 15. A fosforilação de CCA1 pela caseína quinase 2 (CK2) afeta a sua ligação ao alvo promotores 16 e é importante para a compensação de temperatura do relógio circadiano 17. As proteínas PRR são fosforilados diferenciada ao longo do ciclo circadiano, e fosforilação de TOC1 afeta a interação com o seu regulador negativo, o ZEITLUPE componente relógio faseada-noite (ZTL) 18. Estes exemplos ilustram como PTMs e interacções proteína-proteína sintonizar a rede TTFL em um 24-hroscilador transcricional. Para uma introdução mais detalhada para a rede relógio transcricional e de sua regulamentação, excelentes comentários recentes estão disponíveis (por exemplo, referência 15). No entanto, o que continua a ser menos claro é a medida em que os processos regulados ritmicamente e outros aspectos do metabolismo celular de volta para alimentar o próprio mecanismo de cronometragem. rastreio extensivo de Arabidopsis mutantes quanto a defeitos de relógio pode ganhar mais compreensão de quais mecanismos ou vias de sinalização pode estar envolvida na geração de ritmos 24 hr a partir de uma rede TTFL. Para este fim, Kim e Somers publicado anteriormente um método break-through para a análise eficiente e rápida da função relógio em qualquer linha de Arabidopsis 19. Com base na utilização da expressão transitória em protoplastos, este método ultrapassa a necessidade de linhas transgénicas estáveis ​​ou cruza a linha do relógio de marcadores luminescentes. Aqui, nós visualizamos um alto isolatio protoplastos rendimentoMétodo N 20 combinado com um protocolo optimizado para rastrear defeitos circadianos por imagem luminescente de marcadores de relógio expressos transitoriamente num leitor de placas de 96 poços. Nós vamos comparar do tipo selvagem de Arabidopsis 0 cola- se a mutantes de relógio bem caracterizados para confirmar a metodologia descrita aqui com sucesso detecta ritmos circadianos alterados. Protoplastos derivados destas linhas são transfectadas com uma construção repórter de luciferase de pirilampo que expressa a partir do promotor CCA1 circadiano; CCA1pro: 19 LUC. A luciferase catalisa a reacção de passos múltiplos em que a luciferina é convertido animado electronicamente oxiluciferina que emite luz 21, que é criada uma imagem ao longo do tempo para avaliar o período, amplitude e fase dos ritmos de transcrição nestes protoplastos. O protocolo consiste em três partes principais; isolamento dos protoplastos, os protoplastos transfecção com o plasmídeo repórter, e im luminescenteenvelhecimento. Estas três peças devem sempre ser realizada num único dia, utilizando tampões e reagentes recém-preparados. O crescimento das plantas e a purificação de quantidades suficientes de plasmídeo repórter deve ser executada antecipadamente e não são visualizados no presente protocolo.

<table><tbody><tr><td>CELULISINA Celulase, Trichoderma viride&nbsp; </td><td>Merck Millipore</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectinase R10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Acros Organics</td><td>327765000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>327300010</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fischer Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol (PEG) 4000</td><td>Acros Organics</td><td>434630010</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina, Firefly</td><td>Biosynth AG</td><td>L-8200</td><td>Dissolva o pó de luciferina em tampão trifosfato 0,1 M pH 8,0 a uma concentração de 50 mM</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9618</td><td></td></tr><tr><td>Comply Fita Indicadora de Vapor</td><td>3M</td><td>1222</td><td></td></tr><tr><td>Fita Mágica</td><td>3M</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Suprimentos de Laboratório Científico</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca, 96 poços, fundo plano, branco</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>TopSeal-A, tampas adesivas para placas de 96 poços</td> Seringa <td></td> 6050195 <td></td><td>Perkin Elmer</td></tr><tr><td>, 10 ml, sem agulha</td><td>BD Plastipak</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa 0.22 &micro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Software de Análise de Ritmos Biológicos (LATÃO)</td><td></td><td></td><td>Download gratuito no amillar.org</td></tr><tr><td>QIAfilter Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12262</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem Fuch-Rosenthal modificada, célula dupla</td><td>Hawksley</td><td>AC6000</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de campo brilhante</td><td>Optika Microscópios</td><td>B-150POL-B</td><td></td></tr><tr><td>LB942 TriStar2 leitor multimodo, com módulo de luminescência</td><td>Berthold Technologies Ltd</td><td>57947/57948</td><td></td></tr></tbody></table>

rápida análise de fenótipos circadianos em arabidopsis protoplastos transfectadas com um relógio reporter luminescentes

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

O relógio circadiano da planta permite a antecipação de mudanças diárias no ambiente. Essa antecipação auxilia nas respostas ao estresse biótico e abiótico temporalmente previsível. Por outro lado, a interrupção da cronometragem circadiana compromete gravemente a saúde das plantas e reduz o rendimento das culturas agrícolas. Portanto, é imperativo que entendamos a intrincada regulação dos ritmos circadianos nas plantas, incluindo os fatores que afetam o movimento do próprio relógio transcricional.
Testar defeitos circadianos na planta modelo Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) tradicionalmente envolve o cruzamento de linhagens mutantes específicas para uma linha que expressa ritmicamente a luciferase do vaga-lume de um promotor do gene do relógio circadiano. Essa abordagem é trabalhosa, demorada e pode ser infrutífera se um mutante não tiver fenótipo circadiano. A metodologia aqui apresentada permite uma rápida avaliação inicial dos fenótipos circadianos. Protoplastos derivados de Arabidopsis mutante e selvagem são isolados, transfectados com um repórter luminescente ritmicamente expresso e fotografados sob condições de luz constante por 5 dias. Traços luminescentes revelarão diretamente se o período de funcionamento livre das plantas mutantes é diferente das plantas do tipo selvagem. A vantagem do método é que qualquer linha de Arabidopsis pode ser rastreada com eficiência, sem a necessidade de gerar uma linha de marcador de relógio luminescente transgênica estável nesse fundo mutante.

Os protoplastos de Arabidopsis de tipo selvagem foram comparadas com os mutantes de relógio conhecidos CCA1 / LHY (período curto mutante 2), ZTL (período longo mutante 23), e a linha a superexpressão CCA1 OX (arrítmicos 24). Todos foram transientemente transfectadas com o CCA1pro: repórter LUC e fotografada em luz constante num leitor de placas durante 5 dias. Aqui mostramos que no mutante CCA1 / LHY, o período de funcionamento livre da expressão do gene circadiano-controlada é reduzido (Figura 2a), em linha com o período de publicada analisados ​​por expressão transgénica estável de relógio marcadores luminescentes 2,9. O período de oscilações circadianos em protoplastos do mutante ZTL é mais longo do que no tipo selvagem (Figura 2b), de acordo com resultados previamente publicados de mudas, suspensão de células cultures e protoplastos 19,23,25. Superexpressão de CCA1 bloqueia o relógio na manhã de fase e transcrição global se torna arrítmico 24. Consistentemente, não observamos oscilações na CCA1pro: Expressão LUC em protoplastos -oX CCA1 (Figura 2c). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Figura 2: protoplastos ritmos circadianos Protoplastos de Col- 0, CCA1 / lhy, ZTL e CCA1 OX foram transitoriamente transformada com o CCA1pro: LUC construir e ritmos circadianos em luminescência foram fotografadas ao longo de 5 dias (A - C). (D) as estimativas de período circadiano com base em traços de luminescência em Col -0, CCA1 / lhy e ZTL (A - B). Euum ± SEM, n = 3-5, t-teste p-valor, conforme indicado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Genótipo </td><td> Período (protoplastos) </td><td> Período (transgênico) </td><td> Reportado por: </td><td> Referências </td></tr><tr><td> col- 0 </td><td> 23,0 ± 0,21 </td><td> 24,4 ± 0,09 </td><td> pCCA1: LUC em Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> CCA1 / lhy </td><td> 20,6 ± 0,13 </td><td> 19,9 ± 0,11 </td><td> pCCA1: LUC em Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> RNA em G fundo er </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25,1 ± 0,12 </td><td> 27,4 ± 0,5 </td><td> CAB2: LUC em C24 ecotype </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 OX </td><td> arrítmico </td><td> arrítmico </td><td> pCCA1: LUC (dados LD apenas) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> arrítmico </td><td> RNA e proteína na Col -0 fundo </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tabela 2: ritmos circadianos em protoplastos comparação com transgênicos Mudas O período circadiano da pCCA1:. Expressão LUC em protoplastos comparação com os comprimentos período relatados pela primeira vez para a mutação e, se disponível, com pCCA1: Expressão LUC em Col -0.

O relógio circadiano regula a cerca de um terço do transcriptoma de Arabidopsis, mas a percentagem de genes que se alimentam de volta para cronometragem permanece desconhecida. Aqui nós visualizamos um método para avaliar rapidamente os fenótipos circadianos em qualquer linha mutante de Arabidopsis utilizando imagens luminescentes de um repórter circadiano transitoriamente expressa em protoplastos.

Rápida análise de fenótipos circadianos em Arabidopsis Protoplastos transfectadas com um relógio Reporter luminescentes

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

O objetivo geral deste ensaio é determinar o período circadiano em linhagens de Arabidopsis por meio da medição da luminiscência emitida por protoplastos transfectados. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da biologia circadiana, como quais genes exercem retroalimentação sobre o próprio mecanismo de marcação do tempo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma análise rápida do período circadiano de qualquer mutante de Arabidopsis, sem a necessidade de gerar linhagens transgênicas estáveis.Para iniciar este procedimento, rotule uma placa de Petri e adicione a ela 10 mililitros de solução enzimática filtrada e esterilizada. Fixe quatro tiras de fita para autoclave com o lado adesivo para cima sobre uma superfície limpa de laboratório e marque o tamanho da placa de Petri nas tiras. Colete as plantas da sala de crescimento.Corte folhas de plantas com quatro semanas de idade e pressione a epiderme superior contra a fita adesiva para autoclave, de modo que a superfície epidermal inferior fique voltada para cima. Coloque tiras de fita adesiva mágica sobre a superfície epidermal inferior. Usando um tubo cônico de 15 mililitros, pressione suavemente as tiras sobre as folhas, tomando cuidado para não esmagar o tecido foliar.Retire cuidadosamente a fita para destacar a epiderme inferior e expor as células do mesófilo. Em seguida, corte a fita autoclavada para ajustá-la à placa de Petri e use pinças para transferir a fita para a placa, flutuando-a na solução enzimática com as folhas voltadas para baixo. Incube em agitador rotativo a 60 RPM durante 60 minutos, período no qual os protoplastos serão liberados na solução.Após 60 minutos, use pin&ccedil;as para remover e descartar as tiras de fita para autoclave. Usando uma ponteira de pipeta de grande di&acirc;metro, pipete a solu&ccedil;&atilde;o contendo os protoplastos para um tubo c&ocirc;nico de 15 mililitros. Centrifugue os protoplastos a 100 &times;g durante tr&ecirc;s minutos a quatro graus Celsius e remova cuidadosamente o sobrenadante, pois o precipitado &eacute; muito solto.Adicione 10 mililitros de solução W5 aos protoplastos e re-suspenda suavemente girando o tubo. Retire uma alíquota de protoplastos para contagem. Mantenha os protoplastos em gelo por 30 a 60 minutos.Enquanto os protoplastos estiverem no gelo, avalie o rendimento contando os protoplastos em um hemocitômetro. Colete os protoplastos por centrifugação a 100 ×g durante três minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante com cuidado, pois o pellet é muito solto.Por fim, re-suspenda os protoplastos em solução MMg até uma concentração de 500.000 protoplastos por mililitro. Inicie o procedimento de transfeção de protoplastos adicionando dez microlitros de plasmídeo repórter a um tubo cônico de 15 mililitros, seguido por 400 microlitros de protoplastos. Adicione um volume de solução de polietileno glicol, ou PEG, e misture invertendo suavemente o tubo 12 vezes para transfectar os protoplastos.Incube por oito a 15 minutos à temperatura ambiente. Os protoplastos devem ser incubados por tempo suficiente para garantir uma transfeção eficiente, mas não por muito tempo, pois isso reduzirá sua viabilidade. Em seguida, dilua a mistura de DNA-PEG dos protoplastos com quatro volumes da solução W5 e homogeneíze invertendo suavemente seis vezes.Coletar os protoplastos transfectados por centrifugação a 100 gee durante dois minutos à temperatura ambiente. Remover o sobrenatante com uma pipeta, tomando novamente muito cuidado, pois o pellet é muito solto. Suspender novamente os protoplastos em 1.250 microlitros de solução de imagem.Os protoplastos devem ser ressuspendidos com relativa facilidade, indicando que estão intactos após a transfeção. Aliquotar 200 microlitros por poço em seis poços replicados de uma placa de 96 poços e preencher quaisquer poços vazios com solução W5. Vedar a placa com uma tampa adesiva transparente apropriada para imageamento luminiscente.Para obter imagens dos protoplastos, transfira a placa de 96 poços para qualquer sistema de imagem luminiscente adequado para imagens de plantas. Substitua a tampa adesiva da placa entre 10 e 15 minutos após a transferência para evitar condensação e diferenças de pressão entre os poços. Inicie a aquisição de imagens.Leia a placa a cada 45 minutos durante cinco dias à temperatura ambiente. Posteriormente, analise os resultados de luminiscência utilizando qualquer software de análise, por exemplo, o Sistema de Software de Análise de Ritmos Biológicos. Os protoplastos de mesófilo isolados por este protocolo são mostrados nesta imagem com uma ampliação de 200 vezes.Protoplastos de arábide selvagem e do mutante cca1/lhy foram transfectados e analisados em luz constante em um leitor de placas durante cinco dias. Como esperado, o período livre da expressão gênica controlada pelo relógio é encurtado nesse mutante. Em contraste, o período das oscilações circadianas em protoplastos do mutante ztl é alongado.Em protoplastos com superexpressão de CCA1, não houve oscilações na expressão do construto repórter, pois a superexpressão de CCA1 leva à arritmia. Este gráfico de barras mostra as estimativas do período circadiano com base nos traçados de luminescência em protoplastos de tipo selvagem e mutantes do relógio. Esses períodos circadianos são consistentes com dados publicados gerados a partir de plantas inteiras utilizando abordagens transgênicas demoradas.Ao realizar este procedimento, é importante utilizar plantas saudáveis e manipular os protoplastos com cuidado, pois são frágeis. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro horas, se executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar, transfectar e imaginar protoplastos de Arabidopsis.Essas técnicas agora podem ser aplicadas a qualquer linhagem mutante, ou até mesmo ser modificadas para obter imagens de protoplastos de outras espécies vegetais.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A base molecular do espaço-respostas específicas fitocromo está sendo investigado o uso de plantas transgênicas que apresentam tecidos e órgãos específicos deficiências fitocromo. O isolamento de células específicas exibindo esgotamento cromóforo fitocromo induzida por fluorescência-Activated Celular classificação seguido por análises de microarray está sendo utilizada para identificar genes envolvidos em respostas espaciais específicos fitocromo.

Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana</em

Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

Aqui, descrevemos as configurações para monitorar em paralelo a bioluminescência circadiana e a atividade secretora das células das ilhotas humanas e miotubos primários. Para isso, empregamos a entrega do gene lentiviral de um repórter de relógio central de luciferase, seguido de sincronização in vitro e coleta de meio de saída por perifusão celular contínua.

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Um ensaio de bioluminescência em vitro para determinar celular ritmo circadiano em células epiteliais mamárias é apresentado. Este método utiliza plasmídeos de repórter de pilha mamífera expressando desestabilizado luciferase sob o controle do promotor do gene de período 2 . Ele pode ser adaptado para outros tipos de células para avaliar efeitos de órgãos específicos no ritmo circadiano.

In Vitro Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias

Luciferase geneticamente codificado é um repórter popular não-invasivo da expressão do gene. Uso de um automatizado do longitudinal luciferase gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré) de imagem permite gravação longitudinal das células bioluminescentes sob uma ampla gama de condições. Aqui nós mostramos como jacaré pode ser usado no contexto de pesquisa de ritmos circadianos.

Medição flexível de repórteres bioluminescentes usando um Luciferase Longitudinal automatizado de imagem gravador de gás e temperatura-otimizado (jacaré)

Esta tecnologia baseada em fluorescência recém-desenvolvido permite a monitoração a longo prazo da transcrição de genes do relógio circadiano no núcleo supraquiasmático (SCN) de movimentando-se livremente os ratos em tempo real e em uma alta resolução temporal.

Na Vivo Monitoramento de expressão de Gene relógio circadiano no núcleo supraquiasmático do Mouse usando a repórteres de fluorescência

O objetivo do presente protocolo é estabelecer ex vivo da drosófila cultura larval cérebro otimizada para monitorar circadianos ritmos moleculares com imagem de lapso de tempo a longo prazo da fluorescência. A aplicação deste método de ensaios farmacológicos também é discutida.

Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

Os ritmos circadianos, que existem na maioria dos organismos, regulam a organização temporal dos processos biológicos. Os organoides 3D surgiram recentemente como um modelo in vitro fisiologicamente relevante. Este protocolo descreve o uso de repórteres bioluminescentes para observar ritmos circadianos em organoides, possibilitando investigações in vitro de ritmos circadianos em sistemas multicelulares.

Monitoramento de oscilações circadianas com um repórter de bioluminescência em organoides

Este relatório descreve um método envolvendo um script R no software de código aberto RStudio para analisar conjuntos de dados em larga escala obtidos de experimentos de séries temporais.

Uma análise R poderosa e fácil de usar de conjuntos de dados em grande escala

Este vídeo mostra um procedimento para isolar protoplastos intactos a partir de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis. Dado que o protoplastos isolados permanecem intactos por pelo menos 96h e são isoladas de mudas, em vez de um mês de idade plantas maduras, esse procedimento agiliza ensaios exigindo protoplastos intactos.

Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana</em

Aprenda a analisar fenótipos circadianos em Arabidopsis usando protoplastos transfectados com repórteres luminescentes. Este método rápido permite estudar ritmos biológicos sem linhagens transgênicas estáveis.

Rápida análise de fenótipos circadianos em Arabidopsis Protoplastos transfectadas com um relógio Reporter luminescentes

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