Name: Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Impara la tecnica di patch-clamp subcellulare dai dendriti di neuroni dopaminergici nigrali. Questo metodo consente di mappare l'attività dei canali ionici a livello subcellulare con elevata stabilità.

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Ringrazio il dottor Vincent Seutin per il costante appoggio, Christelle Gillissen e Laurent Massotte per un&#39;eccellente assistenza tecnica, i dottori Jean Defourny e Sandra Ormenese per consigli con il microscopio confocale, il dottor Jacques destinare per il dono del secondo amplificatore Axopatch 200B, il GIGA-Imaging piattaforma per condividere le microscopio confocale e software Imaris e il dottor Stephen Freeman per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal FRS belga - FNRS (U.N002.13 e T.N0015.13) e pubblicato con il sostegno della Fondazione belga Università (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

L&#39;autore dichiara che non ha interessi finanziari concorrenti.

Questo rapporto descrive un protocollo step-by-step per realizzare registrazioni cellule intere Somatodendritic doppi e registrazioni dendritiche locali. È utile per determinare l&#39;influenza dei canali ionici (cioè, i h) sul decorso temporale dei potenziali postsinaptici e la mappatura della distribuzione del canale ionico (I h) lungo il dominio Somatodendritic dei neuroni dopaminergici nigral rispettivamente. Risultanti misurazioni elettrofisiologiche sono combinati per pubblicare istochimica hoc per recuperare la morfologia cellulare. La procedura è stata impiegata per studiare i neuroni DA situati nella substantia nigra, ma può essere generalizzata per i neuroni vicini nigrali GABA, ventrale tegmentale neuroni dopaminergici o altri neuroni del mesencefalo. Tutte le fasi possono anche essere seguiti per esaminare altri canali ionici espressi in dendriti dei neuroni della sostanza nera, senza importanti modifiche. Post hoc visualizzazione è particolarmente pertinente per i neuroni con assone-cuscinettodendriti, come i neuroni dell&#39;ippocampo, nigrali 25,26 interneuroni Oriens-Alveus 21 o alcuni neuroni CA1 piramidale 67. È interessante notare che i neuroni che condividono questa caratteristica sembra essere più comune di quanto generalmente si pensa 67. L&#39;analisi morfologica rivela anche la posizione precisa degli elettrodi e assone. La rilevazione di questi ultimi può essere ottimizzato per l&#39;etichettatura delle proteine espresse nel segmento assone iniziale (canali Na + voltaggio-dipendenti o Ankyrin G) utilizzando immunoistochimica 68,69. L&#39;affidabilità dei dati raccolti con le registrazioni dendritiche e la successiva etichettatura neuronale dipende sempre dalla qualità fetta. Massimo sforzo deve quindi essere applicato per preservare la vitalità delle cellule all&#39;interno del tessuto. Questo risultato è ottenuto con un trattamento delicato di animali sani, utensili di alta qualità e reagenti, sufficiente ossigenazione dei tessuti e temperature ghiacciate durante la preparazione di fette. condizioni di registrazione stabili si basano sulla selezione di neuroni sani. Nella modalità cellula intera, resistenza serie dovrebbe inizialmente essere il più basso possibile e mantenuta costante durante l&#39;esperimento. La stabilità delle registrazioni continui a dipendere manipolatori di alta qualità prive di deriva e vibrazioni. Tali perturbazioni possono essere ridotti ottimizzando la stabilità pipetta: verifica della connessione al titolare pipetta e headstage, controllare che i cavi micromanipolatore allentate, evitando sbalzi di temperatura o movimento scenico e controllando il meccanismo del manipolatore. Per le registrazioni doppio, metilsolfato 13,15,21 è stato incluso nella soluzione intracellulare, ma gluconato 9,14,25 può alternativamente essere impiegato. Tuttavia, l&#39;anione principale può alterare il potenziale di membrana 70,71 e alcune correnti voltaggio-dipendenti 72. soluzione intracellulare può essere completata con l&#39;ATP, GTP e fosfocreatina per preservare la physiolofunzioni gici dei neuroni. Inoltre, l&#39;aggiunta di un colorante fluorescente nella soluzione pipetta (ad esempio, Alexa 594 o solforodamina 101 41) per visualizzare i dendriti durante una registrazione somatica può essere utile ad esempio per inserire un applicazione di pressione (figura 7 in rif. 41) o un stimolante elettrica pipetta. La soluzione pipetta per le registrazioni delle cellule-attached contiene un&#39;alta concentrazione di K + e nessun Na + per registrare grandi I h. Degno di nota il rapporto di concentrazione di Na + / K + influenza l&#39;ampiezza della corrente 10, il potenziale di inversione della corrente 11 e la gating di I h 73. In alternativa, i h possono essere registrati anche con fuori-out 10. In questa configurazione di registrazione tuttavia, l&#39;ambiente intracellulare in prossimità dei canali può essere perturbata. Di conseguenza, le differenze di attivazione dipendente dalla tensione di I &lt;sub&gt; h si osserva quando le correnti si confrontano ottenuti utilizzando le patch di cella-attached e fuori-out 10. Gonfiore dei neuroni è talvolta incontrato durante la registrazione patch-clamp, e spesso deriva da cause diverse, come la bassa qualità dell&#39;acqua, forte squilibrio osmolarità e pH tra soluzioni 39 o errori intra ed extracellulare nella composizione delle soluzioni. La qualità delle registrazioni elettrofisiologiche incide direttamente sulla qualità della morfologia dei neuroni recuperati. Alta resistenza pipette somatici sono utilizzati per le registrazioni doppi (6 - 10 MW, come in Refs 6,11.) E per singole registrazioni somatiche dopo registrazioni cella-attached per minimizzare la diluizione del ambiente intracellulare 14. La registrazione integrale delle cellule somatiche a seguito della contabilizzazione delle cellule-attached è quindi mantenuta breve (&lt;10 min). patch fuori-fuori sia dal somatiche e dendritiche pipette sono essenziali per una corretta chiusura del cell membrana e successivo recupero della morfologia cellulare. Oltre alla struttura della cella, il contenuto neurochimico può essere determinato per i neuroni registrati 59,74. Per esempio, il intracellulare della proteina tirosina idrossilasi può essere immunolabeled per l&#39;identificazione inequivocabile di neuroni DA 13. Neuroni DA sono concentrate principalmente nel SN pars compacta, con una densità molto più bassa presente nel SN pars reticulata, dove vengono mescolati con un maggior numero di neuroni GABA 75. Mentre il corpo cellulare dei neuroni dopaminergici è spesso maggiore di quella dei neuroni GABA, l&#39;identificazione visiva di queste cellule con IR-videomicroscopia è incerta e parzialmente ostacolato dall&#39;opacità della pars compacta. Per aggirare queste limitazioni, la preselezione dei neuroni dopaminergici può essere facilitata mediante l&#39;uso di topi transgenici che esprimono un marcatore fluorescente in una specifica popolazione di neuroni (TH 65 o DAT per neuroni dopaminergici, GADper i neuroni GABA) e l&#39;illuminazione epifluorescenza. In alternativa, un colorante fluorescente può essere incluso nella soluzione dell&#39;elettrodo somatica per facilitare la visualizzazione dei dendriti. Maggiore risoluzione della cella fluorescente viene portato da Nipkow filatura confocale disco 14,22,30 o microscopia a due fotoni 7 combinati per IR-DGC 6. Diversi vantaggi sono riportate DGC rispetto al DIC. In primo luogo, come prismi DIC non sono necessari, l&#39;immagine IR-DGC può essere sovrapposto con un 49,52,53,76 immagine di fluorescenza. In secondo luogo, DGC può essere combinato con fotostimolazione e optogenetics 77. Uno svantaggio di preparazione fetta è la preservazione dell&#39;integrità dei neuroni. Neuroni DA estendono loro dendriti nei tre piani spaziali 78,79 e quindi troncamento del compartimento dendritico non possono essere completamente evitato in fette 80. La scelta dell&#39;orientamento delle fette (coronale, orizzontale o parasagittale) è un trade-off. L&#39;origine della innervazione e il disegno sperimentale deve essere considerato selezionare il giusto orientamento delle fette. patch dendritica diretta è la tecnica utilizzata per mappare la distribuzione di canali ionici funzionali nei diversi comparti delle cellule. Inoltre, questa tecnica offre per determinare la variabilità nelle proprietà funzionali dei canali 20. Come complemento la posizione e la densità dei canali ionici possono essere accertate mediante immunoistochimica ai livelli di luce e microscopia elettronica 17,23. Questo approccio offre anche la possibilità di determinare la densità di canale in piccole strutture calibro inaccessibili alle pipette di patch. Tuttavia questi canali potrebbero essere in uno stato funzionale distinta 24 o addirittura inattiva rispetto a quelli registrati utilizzando tecniche di patch-clamp. Entrambe le tecniche sono quindi necessarie per ottenere un quadro completo della posizione e proprietàcanali ionici di una determinata regione cellulare 17. Con lo sviluppo di coloranti sensibili alla tensione, imaging tensione è stato utilizzato per esaminare la propagazione di AP e EPSPS nei neuroni in più posizioni 81. In alternativa registrazioni dual patch-clamp, questo approccio può anche essere implementato per dendriti sottili che non sono accessibili alle pipette di patch ma richiedono calibrazione accurata del segnale e media. Mentre neuroni dopaminergici della SN e l&#39;area ventrale tegmentale sono ampiamente indagate tramite registrazioni somatiche nel contesto fisiologico e fisiopatologico, le proprietà funzionali dei loro dendriti rimane in gran parte sconosciuto in entrambe le condizioni. Patching da dendriti è stato implementato per i neuroni dopaminergici della sostanza nera da diversi gruppi con successo 13,25,26 e rimane il metodo di scelta per sezionare proprietà eccitabili di pagine di queste strutture subcellulari 8. registrazioni dendritiche forniscono un ulteriore opportunità di controllare l&#39;efficienza e la plasticità della trasmissione sinaptica e la plasticità dell&#39;eccitabilità dendritiche 82,83.

I neuroni ricevono informazioni sinaptica prevalentemente sulle loro dendriti. Excitatory e segnali sinaptici inibitori sviluppa dal loro sito di generazione al sito di integrazione in cui potenziali d&#39;azione (AP) vengono evocati come segnale di uscita. Sulla loro strada, potenziali sinaptici sono influenzati sia dalla struttura del dendriti e l&#39;interazione tra le proprietà della membrana passivi e attivi. La combinazione di questi parametri altamente variabili allarga la potenza computazionale di neuroni 1,2. Tuttavia, il piccolo diametro dendriti ostacola tuttavia lo studio delle loro proprietà elettriche. Il continuo sviluppo della tecnica patch-clamp 3, le ottiche 4 e perfezionamento di metodi per la preparazione fetta 5 nel corso degli ultimi decenni hanno permesso registrazioni da molto sottile (0,7-3 micron Ø) dendriti 6,7. Questi metodi erano, e sono, ancora in gran parte utilizzati per esaminare l&#39;eccitabilità dei dendriti in una varietà of neuroni 8. Registrazioni dendritiche diretti sono essenziali per determinare la distribuzione 9-19 e le differenze nelle proprietà funzionali 20-22 dei canali ionici in compartimenti neuronali distinti. Questi dati sono il necessario complemento delle distribuzioni canali ionici rilevate con immunoistochimica combinato alla luce e microscopia elettronica 23,24. Registrazioni Somatodendritic doppi sono stati implementati per esplorare la propagazione dei potenziali d&#39;azione 9,13-15,21,22,25-27 e la diffusione di potenziali sinaptici 13,16,18 lungo il dominio Somatodendritic dei neuroni, ottenere modelli dettagliati di cavi passivi 28- 30 e indagare la risoluzione temporale di integrazione neuronale 31. La sostanza nera (SN) è una regione situata nel mesencefalo coinvolto in numerose funzioni come il controllo del movimento, la codifica di ricompensa e comportamenti abituali. La diminuzione della dopamina causa della specificaperdita di dopaminergici (DA) neuroni della SN è associato con i disturbi motori osservati nei pazienti affetti da morbo di Parkinson 32. Il circuito nigrale è composto da due principali tipi di cellule: dopaminergici e GABAergici neuroni. È interessante notare che questi neuroni hanno diverse caratteristiche specifiche che li distinguono dagli altri neuroni. L&#39;assone di una gran parte dei neuroni dopaminergici e alcuni neuroni GABA proviene da un sito dendritica che indica che il pergolato dendritiche è eterogenea (assone-cuscinetto e dendriti assone-carente) 25,26,33. La morfologia di questi neuroni contrasta quindi con la tipica organizzazione dei neuroni in cui il trasferimento di informazioni segue la legge della polarizzazione dinamica emessa da Cajal: partendo da dendriti, al soma e infine Axon 34. Neuroni DA sono anche noti per il rilascio di dopamina dai loro dendriti 35, generare attività scoppio 36 e la plasticità 37 NMDA-recettore. la dissezionezione di questi fenomeni è sfuggente, senza registrazioni dirette dal sito in cui sono iniziati. Per ottenere intuizioni sul rapporto tra la posizione precisa e le proprietà funzionali dei canali ionici e il loro ruolo nella dell&#39;eccitabilità e informazioni trasferimento dendritiche nei neuroni nigrali, registrazioni dendritiche diretti sono il metodo di scelta. Questo rapporto descrive una procedura dettagliata che può essere utilizzato per ottenere registrazioni di singolo e doppio patch-clamp da dendriti dei neuroni della sostanza nera e il corrispondente post hoc biocitina etichettatura. I principi di base per l&#39;applicazione di patch somatico e la membrana dendritiche sono molto simili. In pratica però, registrazioni da siti dendritiche richiedono l&#39;ottimizzazione specifica rispetto alle registrazioni somatiche. registrazioni dendritiche successo affidano alla qualità delle fette, regolazione ottimale delle ottiche, approccio dolce della pipetta cerotto e la stabilità delle registrazioni.

<table><tbody><tr><td>Acqua bidistillata</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Resistività >14 M&Omega; cm, ideale 18,2 M&Omega; cm a 25&nbsp; &deg; C, filtrato (0,22 & micro; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Candele microfiltro</td><td>Robu</td><td>Porosità 3, 6 mm o 13 mm di diametro</td><td></td></tr><tr><td>Affettatrice per tessuti con vibrosonda</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>parametri di taglio: velocità 0,07, ampiezza 1,40</td></tr><tr><td>Affettatrice per tessuti</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>parametri di taglio: velocità 4, frequenza 7</td></tr><tr><td>Lamette da barba</td><td>Strumenti di dissezione Gilette</td><td>Super Silver</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera di riserva</td><td></td><td></td><td>Becker in PP su misura</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Filtro per siringa</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 &; m</td><td></td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica&nbsp;</td><td>UHU</td><td>"Sekunden Kleber"colla</td> <td>liquida</td></tr><tr><td>Camera di registrazione&nbsp;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Slice mini camera</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore di pipette orizzontale</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm o.d./1 mm i.d. capinari in vetro, estremità lucidate a fuoco, lavate</td></tr><tr><td>Cera dentale</td><td>Colt&egrave; ne/Whaledent</td><td></td> strisce di <td>cera per vassoi ortodontici Griglia</td></tr><tr><td></td><td></td><td>in platino</td><td>per ancorare le fette nella camera di registrazione, realizzata su misura con un disco di platino</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>per lucidare a fuoco i puntali delle pipette</td></tr><tr><td>Potassio metil solfato</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sonde molecolari</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manometro</td><td>GREISINGER elettronico</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipolatori</td><td>Luigs & Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Frame grabber</td><td>La sorgente di imaging</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Condensatore</td><td>Zeiss</td><td></td><td>ad alta apertura numerica funzionante con olio</td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>Ingrandimento 63X, lunga distanza, alta apertura numerica 1.0 immersione in acqua </td></tr><tr><td>obiettivo Quadruplice cambiamento</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td>tra la fotocamera e il microscopio</td></tr><tr><td>Monitor video in bianco e nero</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>da 16 pollici, 850 linee TV,</td></tr><tr><td>bottiglie di campioni analogiche, vetro ambrato, con tappo</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>per trasferire le fette dalla configurazione alla sala istologica</td></tr><tr><td>La guida degli assoni</td> Molecular <td>Devices</td><td></td><td>Book</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Analisi dei dati elettrofisiologici</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>vedere la SCHEDA DI SICUREZZA e la Direttiva sulle sostanze pericolose (UE) prima dell'uso</td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a pozzetto</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>per la colorazione di fette fisse</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>vedere la SCHEDA DI SICUREZZA e la Direttiva sulle sostanze pericolose (UE) prima dell'uso</td></tr><tr><td>primario monoclonale anti-TH di topo</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>concentrazione di lavoro: 1/1.000</td></tr><tr><td>anticorpo secondario anti-topo di capra - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>concentrazione di lavoro: 1/500</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Sonde molecolari antisbiadimento</td><td>- Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina Avidin DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td> <td>plugin per ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>Ricostruzione di neuroni riempiti di biocitina</td></tr><tr><td>Neuromantico</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td> <td>Ricostruzione di neuroni riempiti di biocitina</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Analisi di dati elettrofisiologici</td></tr></tbody></table>

subcellulari patch-clamp dal dominio somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendriti dei neuroni dopaminergici ricevono e trasmettono ingresso sinaptico, sostegno potenziale d&#39;azione back-propagazione e il rilascio dei neurotrasmettitori. La comprensione di queste funzioni fondamentali farà luce sul trasferimento di informazioni in questi neuroni. patch-clamp dendritiche offrono la possibilità di esaminare direttamente le proprietà elettriche dei dendriti e canali ionici voltaggio-dipendenti sottostanti. Tuttavia, queste altre strutture non sono facilmente accessibili per pipette di patch a causa del loro piccolo diametro. Questo rapporto descrive una procedura passo-passo per raccogliere registrazioni stabili e affidabili dai dendriti dei neuroni dopaminergici a fette acuta. Misurazioni elettrofisiologiche sono combinati con il recupero post-hoc di morfologia cellulare. esperimenti di successo basano su una migliore preparazione delle fette, soluzioni e pipette, un&#39;adeguata regolazione delle ottiche e la stabilità della pipetta in contatto con la struttura registrata. principi standard di somatic registrazione patch-clamp sono applicati ai dendriti ma con un approccio più dolce della pipetta. Queste tecniche versatili possono essere implementate per affrontare varie questioni riguardanti le proprietà eccitabili di dendriti.

Il protocollo sopra descritta si propone di facilitare la raccolta di dati mediante patch-clamp dendritiche. Questa tecnica, combinata con istochimica post hoc, permette di acquisire conoscenze sui meccanismi di molti segnali elettrici provenienti o diffondendo in dendriti. Accesso diretto alle dendriti con pipette di patch è difficile, ma una particolare attenzione a diversi aspetti metodologici migliorerà il tasso di successo delle registrazioni. Uno sperimentatore sufficientemente sperimentato nella registrazione somatica stabile può aspettarsi di ottenere un&#39;elevata resistenza guarnizioni (GΩ) ed esperimenti complete sulla maggior parte dei tentativi. Da uno a due registrazioni dendritiche di alta qualità possono essere raccolti per la dissezione. La disponibilità di fettine di cervello di alta qualità contenenti somata sano e dendriti è un prerequisito per l&#39;accesso a pagine di queste strutture (Figura 1). i criteriuna per la selezione di questi neuroni sono una superficie liscia ed omogenea in tutto il cellulare e un soma e dendriti con basso contrasto quando osservata con ottimali regolato ottica (Figura 1A e 1B). Neuroni Selezione troppo forte contrasto in genere porta a registrazioni instabili (Figura 1C e 1C). Pertanto tali neuroni dovrebbero essere evitati. In confronto ad altri neuroni, i neuroni DA nigrali presentano caratteristiche morfologiche ed elettrofisiologiche specifiche. Queste caratteristiche generalmente valutati con una singola pipetta somatica possono essere osservati in dual somatiche (Figura 2) e le registrazioni Somatodendritic (Figura 3). Lunghe iniezioni di corrente iperpolarizzanti indurre un potenziale di rettifica membrana chiamata &#39;sag&#39; (Figure 2B e 5D). L&#39;assone origine, nella maggioranza dei casi, in un sito dendritico come identificatoutilizzando criteri complementari 13,25,26, indicando che il compartimento dendritico in questi neuroni è eterogenea (Figura 3A - 3B). Di conseguenza, il compartimento in cui l&#39;AP è osservato prima corrisponde al compartimento in cui l&#39;assone emerge (Figura 3C - 3D) 13,25,26. L&#39;assone è generalmente risolto da un vescichetta assonale causato da un taglio dell&#39;assone durante affettatura 64, ma questa struttura non viene rilevata sistematicamente. L&#39;abbassamento pronunciato osservato nei neuroni DA nigrali consecutivi all&#39;attivazione di I h suggerisce una elevata espressione di subunità HCN. Per determinare l&#39;influenza di I h sull&#39;integrazione dei segnali sinaptici, correnti (EPSC) forme d&#39;onda sinaptici come sono stati generati e iniettati tramite l&#39;elettrodo di registrazione dendritiche durante dual registrazioni Somatodendritic 55 (&lt;strong&gt; Figura 4). La cinetica di questi EPSCs simulati sono stati basati in aumento e il tempo di decadimento costanti reali EPSCs spontanee. Il aEPSP risultante è stato registrato con l&#39;elettrodo somatica. Applicazione Bagno della I h bloccante ZD 7288 aumentato la durata del aEPSP, indicando il contributo di I h per l&#39;andamento temporale dei segnali sinaptici (Figura 4B). ZD 7288 ha abolito anche il potenziale di membrana di rettifica confermando che i risultati sag da attivazione del I h (Figura 4C). I risultati ottenuti con EPSPS simulati possono essere correlati a esperimenti usando EPSPS evocati elettricamente 65. Per mappare la precisa distribuzione del canale nel dominio Somatodendritic di neuroni dopaminergici, le registrazioni delle cellule-attached sono stati attuati (Figura 5). Un sigillo ad alta resistenza (&gt;&gt; 1 G) è una necessità assoluta per le registrazioni delle cellule-attached (Figura 5B </strong&gt;). In dendriti dei neuroni dopaminergici, che h si attiva lentamente con gradini di tensione iperpolarizzanti lunghi e lo stato stazionario corrente viene raggiunto dopo che centinaia di ms (Figura 5C), come precedentemente indicato 66. Questa osservazione indica che i canali HCN espressi in dendriti dei neuroni DA hanno differenti subunità rispetto a quelli in neuroni piramidali o altri tipi di cellule 10,16,66. Poiché la distribuzione del canale potrebbe essere non omogenea nel compartimento dendritico e come il vano dendritica è essa stessa eterogenea, l&#39;identità del dendrite (assone fruttifero o dendrite nonaxon-cuscinetto) è rivelata confrontando l&#39;immagine IR-DGC con l&#39;immagine confocale dopo la colorazione biocitina (Figura 3A e B). Il recupero della morfologia delle cellule è quindi necessario per entrambe le registrazioni Somatodendritic dual e per le registrazioni delle cellule-attached tramite successive registrazioni integrali di cellule somatiche. Figura 1. Visualizzare il Soma e prossimale dendriti dei neuroni dopaminergici della sostanza nera Uso degli infrarossi Videomicroscopy. (A) IR-DGC immagine di un nigrale neurone DA mostra la soma e dendriti prossimale ed entrambe le pipette somatiche e dendritiche. Una registrazione Somatodendritic duale è stata eseguita con successo su questo neurone sano. Osservare il basso contrasto e la superficie liscia tutto il dominio Somatodendritic della cellula. (B) Un altro esempio di un neurone DA sano. (C) DA neurone con una superficie ruvida e irregolare e un contrasto più forte. Mentre una doppia registrazione è stata ottenuta, la stabilità è stata ottimale e la durata della registrazione era corto (~ 15 min) a causa di un aumento graduale della resistenza di accesso ad entrambe le pipette. (D) Secondo esempio di un neurone DA mostra un forte contrastata soma e dendriti prossimale. In questo caso, un forte aumento della resistenza di accesso è stata osservata poco dopo la pausa in modalità whole-cell. Un tentativo di diminuire la resistenza di accesso da pressione negativa non ha avuto successo. I neuroni nel pannello C e D potrebbero essere stati danneggiati durante la procedura di taglio e deve essere evitato per gli esperimenti. (E) simultanea doppia registrazione somatica in un ambiente sano neurone DA all&#39;inizio della registrazione. (F) stesso neurone come nel pannello E con un corpo cellulare gonfio dopo ~ 17 min. Si noti la completa assenza di contrasto, l&#39;aspetto palla-come del soma e la presenza del grande nucleo che non è evidente nei neuroni sani. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Figura 2. </sTrong&gt; simultanea doppia registrazione somatica da un DA Neuron. (A) immagine IR-DGC durante la registrazione doppia somatica da un neurone DA. (B) iperpolarizzante e depolarizzante 1 s lunghi iniezioni correnti (-160 a 80 Pa, incrementare 80 pA) e variazioni di tensione corrispondenti registrati simultaneamente con entrambe le pipette di patch. Da notare la presenza del abbassamento nella traccia di tensione con il lungo passo corrente iperpolarizzante e la grande dopo-iperpolarizzazione dopo l&#39;AP durante l&#39;impulso di corrente depolarizzante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Figura 3. Dual S Registrazione omatodendritic in un DA Neuron. (A) immagine IR-DGC di un neurone DA. La distanza tra il dendritiche e somapipetta tic è 29 immagine micron. (B) confocale Z-proiezione del neurone nel pannello A marcato con avidina coniugata con isotiocianato di fluoresceina (FITC). Il neurone è stato riempito con biocitina durante la registrazione. L&#39;assone origine da un dendrite prossimale vicino al soma come indicato dalla freccia. (C) Registrazione simultanea dual Somatodendritic tensione whole-cell dal neurone nel pannello A. AP registrata nel soma (tracce tensione nero) e dendrite (rosso tensione tracce) in risposta a un 1 s fase di iniezione di corrente lungo la via somatica (sinistra, nero traccia corrente) e pipetta in alternativa dendritiche (a destra; rosso traccia corrente) (D) somatica e AP dendritiche mostrato a scala temporale espansa.. Con entrambi somatici o iniezione di corrente dendritica, somatica AP (nero) preceduto il dendritica AP (rosso). Il ritardo tra i punti di accesso in questo neurone era di 120 ms e 210 ms rispettivamente con somatica e iniezione di corrente dendritiche,. ritardisono stati misurati a AP ampiezza metà-massimale durante la fase di salita della AP. L&#39;AP è osservato prima nel vano vicino alla quale l&#39;assone emerge, confermando le osservazioni precedenti 25,26. In questo caso, la registrazione dendritica è fatto da una dendriti assone-carente. Un esempio di una registrazione da un assone dendriti-cuscinetto è in Rif. 13 (nella loro Fig. 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> Figura 4. Propagazione della EPSPS artificiali Lungo la Somatodendritic Asse di DA neuroni. (A) immagine IR-DGC di un neurone DA. La distanza tra il dendritiche e pipetta somatica è di 45 micron. Entrambe le pipette di patch sono in modalità di cellula intera registrazione corrente-clamp. (B) Correnteregistrato con la pipetta dendritiche in current-clamp e utilizzato per generare la EPSP artificiale (in alto). La corrente è ottenuta mediante l&#39;iniezione di una forma d&#39;onda EPSC-like (t aumento = 0,6 ms; T si decadimento = 3 ms; ampiezza = 100 pA) tramite la registrazione pipetta dendritica 55. In fondo, aEPSPs registrati alla soma in condizioni di controllo (nero) propagate e dopo l&#39;applicazione il bagno del ZD7288 I h bloccante (30 micron; traccia rossa). Ogni traccia tensione è la media di 40 singole scansioni. Osservare il grande aumento della durata EPSP in presenza di ZD7288 indicante il contributo di I h per la durata d&#39;EPSPS. (C) Tensione tracce registrate dal soma in condizioni di controllo (nero) e dopo l&#39;applicazione di 30 pM ZD 7288 ( rosso) in risposta ad una lunga (30 pA; 1 s) passaggio corrente iperpolarizzante. Si noti l&#39;assenza del potenziale di membrana rettificazione (abbassamento) dopo il blocco di I &lt;sub&gt; h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> Figura 5. Presenza di I h in dendriti di DA Neuron. (A) IR-DGC immagine di un neurone DA e pipetta sul dendrite prossimale. (B) capacitivi e perdite correnti durante un comando di tensione 5 mV in configurazione cell-attached. La resistenza sigillo era 5 GΩ in questo esempio passo (C) Tensione iperpolarizzanti. (90 mV; superiore) da un potenziale di membrana di 0 mV indotto a Ho attivando lentamente h. La traccia corrente è stato invertito e dotato di una singola funzione esponenziale dando una costante di tempo T si = 632 ms. (D) Tensionerisposte del soma registrato cellula intera (pannello A) a 1 s iper e depolarizzanti impulsi di corrente (-160 a 120 pA, 40 pA incremento). La registrazione intero-cellula somatica è stata eseguita dopo la registrazione cella-attached. Si noti l&#39;assenza di AP dovuto all&#39;applicazione extracellulare TTX e Cd 2+ sopprimere scarica spontanea durante la registrazione cell-attached. Questi voltaggio-dipendenti Na + e Ca 2+ sono stati aggiunti bloccanti attuali per sopprimere le correnti d&#39;azione. Pannelli A - D sono dallo stesso neurone (E) Immagine IR-DIC di un altro neurone DA e una pipetta dendritiche correnti (F) voltaggio-dipendenti attivati da un impulso di prova a 0 mV da un prepulse 50 ms a -120 mV.. in una patch fuori-out asportato dal dendrite prossimale del neurone nel pannello di E. Tenere potenziale -80 mV. Si noti l&#39;inattivazione dipendente dal tempo della corrente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare un più grande</a>versione di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sostanza </td><td> g / mol </td><td> Concentrazione </td><td> per 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 125 mm </td><td> 7.305 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2.100 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,551 </td><td> 2,5 mm </td><td> 0,186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mm </td><td> 0.172 g </td></tr><tr><td> glucosio </td><td> 198,17 </td><td> 25 mM </td><td> 4,95 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 1 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 2 mm </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarità: ~ 310 mOsmol / L (range ottimale: 314-325 mOsmol / L), pH = 7.4 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: liquido cerebrospinale artificiale (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sostanza </td><td> g / mol </td><td> Concentrazione </td><td> per 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 87 mm </td><td> 5.084 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,1001 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 7.551 </td><td> 2,5 mm </td><td> 0,18,637 mila g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mm </td><td> 0,17,248 mila g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 7 mm </td><td> 7 mL </td></tr><tr><td> glucosio </td><td> 198,17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> saccarosio </td><td> 342,29 </td><td> 75 mm </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 0,5 mm </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarità: ~ 326 mOsmol / L, pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabella 2: saccarosio-ACSF per preparare fette. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sostanza </td><td> g / mol </td><td> Concentrazione </td><td> per 100 ml </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150.2 </td><td> 120 mm </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.56 </td><td> 20 mm </td><td> 0,14,912 mila g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 2 mm </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551,1 </td><td> 2 mm </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0,5 mm </td><td> 0,02,661 mila g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255,1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0,1 mm </td><td> 3.803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23,831 mila g </td></tr><tr><td> biocitina </td><td> 1 mg / mL </td><td></td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarità: ~ 302 mOsmol / L, pH = 7,2 regolato con KOH </td></tr></tbody></table> Tabella 3: soluzione intracellulare per le registrazioni doppio. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sostanza </td><td> g / mol </td><td> Concentrazione </td><td> per 100mL </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.56 </td><td> 120 mm </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 2 mm </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 1 mM </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23,831 mila </td></tr><tr><td> TEA-Cl </td><td> 165.7 </td><td> 20 mm </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94.11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04,705 mila g </td></tr><tr><td> BaCl 2 </td><td> 244,26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02,443 mila g </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> 183.32 </td><td> 0,02 mm </td><td> 0.3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nm </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarità: ~ 290 mOsmol / L, regolato con D-glucosio (Rif. 16); pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: soluzione elettrodi per le registrazioni delle cellule-attached.

Le registrazioni subcellulari di patch-clamp offrono la possibilità di studiare le proprietà funzionali dei dendriti. Tuttavia, queste strutture fini non sono facilmente accessibili a causa del loro piccolo diametro. Il protocollo qui descritto mira a facilitare la raccolta di registrazioni stabili e affidabili dai dendriti dei neuroni dopaminergici in fette in vitro.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia, ad esempio in che modo i singoli canali ionici attivati dal voltaggio contribuiscono alle funzioni di un neurone specifico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di mappare la funzione dei canali ionici a livello subcellulare nei neuroni. Iniziare questa procedura posizionando il cervello su una piastra di Petri da 9 centimetri con il fondo ricoperto da uno strato di SiliGuard.Successivamente, circondare il cervello con soluzione ACSF fredda di saccarosio. Per preparare sezioni coronali, effettuare due tagli per rimuovere il cervelletto e la parte rostrale del cervello. Quindi applicare una colla a base di cianoacrilato sul vassoio del campione e fissare il blocco cerebrale al vassoio in modo che la parte rostrale sia rivolta verso la piattaforma di sezionamento.Successivamente, applicare alcune gocce di ACSF con saccarosio sul cervello e immergere lentamente il vassoio nella camera di taglio. In seguito, regolare la lama del rasoio a un angolo di 15 gradi rispetto al piano orizzontale. Tagliare fette coronali del cervello di circa 500 micrometri in direzione nasale prima di raggiungere la sostanza nera.Quindi regolare lo spessore per ottenere fette di 300 micrometri contenenti la regione di interesse. Separare le fette dal blocco di tessuto utilizzando un ago molto sottile collegato a una siringa, posizionato parallelamente al bordo della lama del rasoio. Successivamente, trasferire le fette nella camera di riserva a 34 gradi Celsius per un'ora.In questa procedura, trasferire una sezione cerebrale nella camera di registrazione. Fissare la sezione sul fondo della camera di registrazione con un anello di platino ed assicurarsi che la sezione sia di buona qualità, con una superficie liscia e uniforme. Quindi selezionare un neurone con un dendrite che si estende per una lunga distanza nello stesso piano ed assicurarsi che il dendrite di interesse possa essere seguito fino a un soma ben definito.Successivamente, riempire la pipetta per il patch con la soluzione per l'elettrodo. Per eseguire il patch sul dendrite in modalità cell-attached, identificare e focalizzare una porzione del dendrite. Applicare una pressione positiva sulla pipetta e abbassarla utilizzando il micromanipolatore.Quindi posizionare la pipetta vicino alla membrana e regolare la pressione per creare una piccola depressione. Successivamente, rilasciare la pressione sulla punta della pipetta ed effettuare la registrazione su dendrite, controllando contemporaneamente la resistenza della pipetta. Tentare di ottenere una resistenza di sigillo superiore a un gigaohm, preferibilmente compresa tra tre e dieci gigaohm, per le registrazioni in configurazione cell-attached.Successivamente, ritirare la pipetta dalla membrana di alcuni micrometri, per evitare la deformazione del dendrite. Le correnti d'azione qui osservate rappresentano i potenziali d'azione spontanei dei neuroni nigrali. Per sopprimere le correnti d'azione, applicare bloccanti dei canali del calcio e del sodio all'ACSF.Applicare quindi un gradino di tensione di 90 millivolt, partendo da un potenziale di clamping pari a zero millivolt, per evocare la corrente catonica attivata dalla iperpolarizzazione. Alla fine della registrazione, rompere la membrana per ottenere la configurazione in modalità cella intera. Successivamente, ritirare lentamente e delicatamente la pipetta dendritica dalla membrana neuronale per ottenere una membrana in configurazione esterno-fuori.Per effettuare la registrazione dal soma corrispondente in modalità whole-cell, individuare il soma corrispondente al dendrite. Avvicinare una pipetta con una resistenza compresa tra cinque e dieci megaohm contenente una soluzione intracellulare a base di potassio al corpo cellulare. Applicare quindi una breve pressione negativa alla punta della pipetta per rompere la membrana e raggiungere la modalità whole-cell.Verificare l'identità del neurone in modalità di blocco della corrente applicando lunghe fasi di corrente iper- e depolarizzante, e permettere alla biocitina dalla pipetta di diffondere lungo le dendriti. Dopo 10 minuti, ritirare la pipetta per ottenere una patch in configurazione outside-out. Utilizzare una sequenza di brevi movimenti laterali verso l'alto per favorire la corretta chiusura della membrana cellulare, una volta che la pipetta si trova al di sopra della sezione, per uscire completamente dalla camera di registrazione.Mantenere la sezione nella camera di registrazione per ulteriori 15 minuti in ACSF standard per consentire l'equilibrazione della biocitina e del neurone registrato. Successivamente, trasferire delicatamente la sezione in un flacone di vetro ambrato da 25 millilitri contenente ACSF standard per l'istologia. In questa procedura, localizzare approssimativamente il neurone marcato con fluorescenza nella sezione mediante epifluorescenza.Esaminare brevemente l'albero dendritico dei neuroni e individuare l'assone e il bleb assonale utilizzando un obiettivo 10X. Successivamente, passare al microscopio confocale e selezionare il diodo laser a 488 nanometri per eccitare il neurone marcato. Seguire l'estensione dell'assone e dei dendriti lungo l'asse Z ed acquisire immagini successive al fine di ottenere uno stack Z per l'intera cellula.Regolare la risoluzione dell'asse Z ed acquisire le immagini confocali della cellula a bassa e ad alta ingrandimento. Alla fine, aprire il file dell'immagine del neurone con un software di imaging. Confrontare ad occhio l'immagine di proiezione Z con un'immagine IR-DGC per localizzare la posizione precisa della pipetta di patch durante la registrazione elettrofisiologica.Qui è mostrata l'immagine IR-DGC di un neurone dopaminergico e di una pipetta posizionata sul dendrite prossimale. Il tracciato della corrente mostra la capacità delle correnti di perdita dell'EN in risposta a un comando di tensione di cinque millivolt, in configurazione cell-attached, con una resistenza di sigillo di cinque gigaohm. Un passo di iperpolarizzazione, a partire da un potenziale di membrana di zero millivolt, ha indotto una corrente cationica attivata lentamente dall'iperpolarizzazione.La traccia della corrente è stata invertita ed adattata con una funzione esponenziale singola, fornendo una costante di tempo di 632 millisecondi. Di seguito sono riportate le risposte di tensione dell'assone registrate a livello della cellula intera mediante impulsi di corrente iperpolarizzanti e depolarizzanti di un secondo, in presenza di inibitori delle correnti di sodio e calcio regolate dalla tensione, al fine di eliminare i potenziali d'azione durante la registrazione in configurazione cell-attached. Una volta appresa, questa tecnica può essere eseguita in un solo giorno, se condotta correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di ottenere tessuto sano e condizioni di registrazione stabili. Dopo aver eseguito questa procedura, è possibile effettuare altri metodi, come l'immunohistochimica, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sull'identità del neurone registrato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurofisiologia per esplorare la funzione, le proprietà e il ruolo dei canali ionici attivati dal voltaggio nelle cellule eccitabili.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare ed esaminare la distribuzione delle correnti che attraversano i canali ionici attivati dal voltaggio nei dendriti.

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In questo video ci dimostra come applicare una conduttanza in un neurone dopaminergico registrato nella configurazione cellule intere fette di cervello di ratto. Questa tecnica è chiamata la pinza dinamica.

L&#39;applicazione di una conduttanza recettore NMDA nei neuroni dopaminergici mesencefalo Rat Utilizzando la tecnica dinamica morsetto

La tecnica di misura amperometrico il rilascio di dopamina da una singola cellula rilevando la corrente ossidativo prodotta per ossidazione spontanea dopamina. Morsetto di tensione simultanea e la metodologia amperometria rivelano il rapporto meccanicistico tra il generale "attività" del trasportatore della dopamina e il ruolo di regolamentazione di questa attività sul trasporto inverso di dopamina.

Cella di misura singola di rilascio di dopamina con simultanea di tensione-clamp e Amperometria

Questo video mostra una tecnica per la registrazione patch-clamp dalla superficie della membrana dendritica. Questo aiuta a esaminare direttamente le proprietà elettriche dei dendriti e dei canali ionici voltaggio-dipendenti sottostanti nei neuroni dopaminergici.

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Registrazione del patch clamp a cellula intera in un neurone di substantia gelatinosa di una fetta di midollo spinale

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Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

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