Name: NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーに基づくNK細胞機能アッセイ。小サンプルサイズに最適化され、小児科や免疫不全患者の臨床評価に適用可能。脱顆粒とサイトカイン産生を測定し、NK細胞サブセットの役割を解明する。

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著者は、ドイツのがん援助（Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe;EU)、ドイツ・ヘッセン高等教育・研究・芸術省(III L 4- 518/17.004)およびドイツ・フランクフルト(EU)の「Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung」が資金提供するロエベ・センター・フォー・セル・アンド・ジーン・セラピー・フランクフルト(EU、ST)が資金提供しています。BJは、Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer ResearchからのMildred Scheelポスドク奨学金によって資金提供されました。STは、GO-INポスドクフェローシップ(PCOFUND-GA-2011-291776)によって設立されました。著者らは、この研究で使用したFACSCanto IIおよびCanto10c Flow Cytometry Analyzerを提供してくれたBecton Dickinson氏(BD)に感謝します。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

記載された方法は、健康なドナーまたは患者の全血試料からのNK細胞の機能を研究するための、簡単で迅速かつ信頼性の高い方法です。この方法は、他の多くの精製方法15のために必須である時間のかかる密度勾配遠心分離を避け、直接全血からNK細胞を精製するための大きな利点を提供しています。また、それは、小児及び/又は免疫不全の患者のサンプルのために適切な代替になり、「古典的な」NK細胞単離/濃縮法に比べて小さなサンプルサイズを必要とします。このプロトコルは、NK細胞の機能をエクスビボでの基底値を得るために使用することができ、それはまた、以前に8記載の他の方法と相補的なこのような方法であること、さらにNK培養および拡大を可能にします。それにもかかわらず、いくつかの重要なステップは、考慮しなければなりません。アッセイは、細胞外および細胞内抗体染色に基づいているので、woは最適に決定するために重要です最初の各抗体について濃度をrking。特に、細胞内染色のために、使用された抗体の慎重な評価を強くお勧めします。良い方法が使用される抗体の希釈系列テストすることである（ 例えば、1：1</em...

先天性免疫系ナチュラルキラー（NK）の一部として、細胞はウイルス感染や悪性形質転換した細胞に対する防御の第一線に寄与する。抑制と活性化受容体のシステムは、T細胞とは対照的に、前の抗原プライミングすることなく、健康で形質転換された細胞を区別できるようにします。標的細胞に遭遇すると、NK細胞は、それらの標的を殺すために免疫シナプスに自分の細胞傷害性顆粒（ 例えば、パーフォリン、グランザイム）の内容物を放出します。また、NK細胞が生産し、異なるサイトカインの種類（ 例えば、インターフェロンγ：;：TNF-α、IFN-γ、腫瘍壊死因子α）を分泌：標的細胞上に及びケモカイン（MIP-1β 例えば、マクロファージ炎症性タンパク質1βを）相互作用またはサイトカイン刺激1。 このような細胞毒性、ケモカインおよびサイトカイン産生として十分なNK細胞の機能は、多様なDISの運命に重要な影響を持っています容易になります。それらは減少IFN-γ産生およびNK細胞受容体2の活性化の低下した発現からなる診断で不良NK細胞プロフィールを示す場合、白血病患者は、再発率の増加を示します。標的細胞の相互作用の際にサイトカイン産生などNK細胞の数および機能の早期回復は、同種幹細胞移植3を受けている患者において減少再発および生存率の改善率と関連しています。また、C型肝炎ウイルスに感染した患者におけるインターフェロン療法の開始時に、末梢NK細胞の脱顆粒の容量は、非応答者4よりも早い応答における強いです。リンパ腫または多発性骨髄腫を患っている患者における自家幹細胞移植（autoSCT）後15日目のNK細胞数（&gt; 80 /μl）を改善された無増悪および全生存5を予測しています。メラノーマ患者におけるT細胞免疫グロブリンの発現およびムチンドメインcontaininG分子3（TIM-3）、NK細胞上の免疫調節タンパク質は、病期および予後6と相関します。 科学者たちは、過去数十年間を通じてNK細胞の機能を監視しています。事前のプライミングなしの腫瘍細胞に対するNK細胞の細胞毒性の最初の分析は、51 Cr放出アッセイ7を使用して対処しました。より最近では、科学者は、拡張NK細胞8の細胞毒性を評価するために、非放射性の方法を開発しました。サイトカインおよびケモカイン産生は、しばしば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）技術9,10を用いて評価されています。過去数十年の間、これらの方法は、フローサイトメトリーに基づくアッセイによって補完されています。従来の表面染色プロトコルとの組み合わせでタンパク質輸送阻害剤（ 例えば、ブレフェルジンAおよびモネンシン）と細胞透過法の使用は、異なる特定のリンパにおけるケモカインおよびサイトカイン産生を研究する科学者を有効にしていますocyteサブセット（ 例えば 、T、BまたはNK細胞）11。また、別のフローサイトメトリーベースのアッセイは、T及びNK細胞の細胞毒性をモニターするために開発されてきました。 2004年アルターらは 、細胞傷害性顆粒12の脱顆粒のマーカーとして標的細胞の遭遇時にNK細胞のリソソーム関連タンパク質のCD107a（LAMP1）の表面発現を記載しました。異なる蛍光色素及びマルチチャネルフローサイトメーターの広い範囲は、私たちの日に利用可能であるので、同時に異なるNK細胞サブセットに多様なNK細胞機能（細胞毒性、サイトカインおよびケモカイン産生）を監視することが可能となりました。これは、生検または白血球減少症を患っている患者の血液サンプル中、 例えば、サンプルサイズが制限される状況において特に重要となります。 グローバルNK細胞の機能をテストするために、別のフローサイトメトリーに基づくアッセイを効率的に組み合わせることができます。テオレルらは HEAからNK細胞を刺激し腫瘍細胞株K562とlthyドナーと13、フローサイトメトリーを介して、NK細胞の脱顆粒、インサイドアウト信号およびケモカイン産生を分析しました。最近autoSCT中の腫瘍患者におけるNK細胞のサブグループ、表現型および機能はフローサイトメトリーに基づくアッセイを流す用いて分析しました。これは、NK細胞はautoSCT 11後の非常に早い時点での腫瘍細胞の認識の際に、サイトカイン/ケモカインの脱顆粒及び生成することができたことが示されました。 ここでプロトコルが同時に異なるサブセット内のNK細胞の機能を監視することを可能にするフローサイトメトリーに基づくアッセイを使用して脱顆粒の容量、ケモカインおよびサイトカイン産生を含む、腫瘍細胞との相互作用にNK細胞の機能を評価するために記載されています。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 + グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>6187-044</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>BD ファルコン丸底チューブ</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>使用前に熱不活性化</td></tr><tr><td>T-フラスコ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690195</td><td></td></tr><tr><td>K562 腫瘍細胞株</td><td>DSMZ GmbH</td><td>ACC 10</td><td></td></tr><tr><td>ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer</td><td>made in house</td><td>/</td><td>components are listed in the text</td></tr><tr><td>蒸留水: Ampuwa Sp&uuml;ll&ouml;sung 1,000 ml Plastipur</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1088813</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 40R Centrifuge</td><td>Heraeus</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>EDTA blood collector tubes</td><td>Sarstedt</td><td>386453</td><td>S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>造血培地 (XVIVO)</td><td>Lonza Group Ltd</td><td>BE04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清DRK</td><td>Blutspendedienst、フランクフルト/M&nbsp;</td><td>/</td><td>血液型ABの健康なドナー;使用前に熱を不活性化し</td></tr><tr><td>、ノイバウアー改良された計数室、明るい線</td><td>マリエンフェルト・スーペリア/ LO-Laboroptik Ltd.</td><td>0640030/ 1110000</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 (0.4%)</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>3% 酢酸とメチレンブルー</td><td>Stemcell Technologies&nbsp;</td><td>07060</td><td></td></tr><tr><td>コーニング 96 ウェルクリア V底TC処理マイクロプレート</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96 Well 丸底未処理マイクロプレート</td><td>コーニング&nbsp;</td><td></td><td></td>351177</tr><tr><td>DPBS (Ca2+- and Mg2+-free)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&nbsp;</td><td>メルク</td><td>524400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>イオノマイシン&nbsp;</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1566-5</td><td></td></tr><tr><td>インターロイキン 15 (IL-15)</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (IL-2)&nbsp;</td><td>ノバルティスファーマ</td><td>730523</td><td></td></tr><tr><td>ゴルジストップ、タンパク質輸送阻害剤(モネンシン含有)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>この製品は、ゴルジプラグと組み合わせて使用することも、ゴルジプラグの代わりに使用することもできます。希望する実験環境に最適な組み合わせをテストする必要があります。</td></tr><tr><td>ゴルジプラグ タンパク質輸送阻害剤(ブレフェルジンA含有)</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>AppliChem</td><td>UN2209</td><td></td></tr><tr><td>saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター Canto10C</td><td>BD Biosciences</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>グラフパッド</td><td>グラフパッド株式会社</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>MACSxpressセパレーター</td><td>ミルテニーバイオテック&nbsp;</td><td>130-098-308</td><td></td></tr><tr><td>MACSxpress NKアイソレーションキット</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-098-185</td><td></td></tr><tr><td>MACSxpress赤血球枯渇キット、ヒト</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-098-196</td><td></td></tr><tr><td>MACSmixチューブローテーター&nbsp;</td><td>ミルテニーバイオテック&nbsp;</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD3 APC</td><td>バイオレジェンド</td><td>300412</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD3 V450</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>560366</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD14 PerCP</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-094-969</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD14 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD16 PE</td><td>バイオレジェンド</td><td>302008</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD16 PerCP</td><td>バイオレジェン</td>ド <td>302029</td><td></td></tr><tr><td>反ヒト CD19 PE-Cy7</td><td>バイオレジェンド</td><td>302216</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD19 V450</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>560353</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD45 BV510</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>563204</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD56 FITC</td><td>バイオレジェンド</td><td>345811</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD107a PE</td><td>バイオレジェンド</td><td>328608</td><td></td></tr><tr><td>反ヒト IFN-&γ;AF-647</td><td>BDバイオサイエンス557729</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトMIP-1&β;APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>561280</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biolegend</td><td>422801</td><td></td></tr><tr><td>ゾンビバイオレット 固定可能生存キット</td><td>Biolegend</td><td>423113</td><td>固定可能な死細胞マーカー</td></tr></tbody></table>

nk細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

ナチュラルキラー(NK)細胞は、ヒト腫瘍の免疫監視システムの重要な部分です。NK細胞は、生殖細胞系にコードされた抑制性および活性化性受容体のセットにより、健康な細胞とウイルス感染細胞または悪性形質転換細胞を区別することができます。ウイルスや腫瘍細胞が認識されると、標的細胞に対する細胞毒性、サイトカインやケモカインの産生など、さまざまなNK細胞機能が開始され、他の免疫細胞が活性化されます。正確なNK細胞の機能は、さまざまなウイルス感染症や悪性疾患の治療結果にとって重要であることが実証されています。ここでは、フローサイトメトリーベースのアッセイを使用してさまざまなNK細胞機能を解析するためのシンプルで信頼性の高い方法について説明します。NK細胞の機能は、NK細胞集団全体だけでなく、さまざまなNK細胞サブセットについても評価できます。この技術により、科学者は健康なドナーや患者のNK細胞機能を簡単に研究し、さまざまな悪性腫瘍への影響を明らかにし、新しい治療戦略をさらに発見することができます。

<html>全NK細胞集団と三つの異なるNK細胞サブセットの脱顆粒、サイトカインおよびケモカイン産生を分析するためのゲーティング戦略は、図1に示されています。 1健康なドナーの代表的な結果を図2に示されている。任意の刺激のないNK細胞はいずれもIFN-γもMIP-1βを生産し、その表面上のCD107a（ 図2A）を発現しませんでした。対照的に、腫瘍細胞およびサイトカインで刺激したNK細胞は、細胞内IFN-γおよびMIP-1βの有意な量を生じました。また、それらの20％以上は、その表面（ 図2C）上のCD107aを発現することによって示された腫瘍細胞の相互作用によって脱顆粒。 PMAおよびイオノマイシン刺激はコントロール（ 図2B）として使用しました。 <p class="jo...

簡単かつ信頼性のある方法は、異なるNK細胞サブセット内の脱顆粒、サイトカインおよびケモカインの産生などNK細胞機能のセットを分析するために、ここで説明されています。

NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

本手順の全体的な目的は、フローサイトメトリーベースのアッセイを用いてNK細胞の機能をモニターすることです。ナチュラルキラー細胞は、さまざまなウイルス感染症や悪性疾患の転帰において極めて重要です。NK細胞の機能をより適切にモニターするため、当研究室では、科学研究および臨床評価の両方に使用可能なフローサイトメトリーベースのアッセイをさらに発展させました。小児科や免疫不全患者への適用に不可欠な、少量のNK細胞サンプルでの解析を可能にするためにプロトコルを最適化しました。この手法のさらなる利点は、NK細胞集団全体だけでなく、異なるNK細胞サブセットにおけるNK細胞機能を測定できることです。NK細胞を単離するには、まず適切な量のNK細胞単離カクテル溶液と、患者から採取した6～10 mLのEDTA末梢血全血を混合し、数回反転混和させます。次に、チューブローテーターを用いて、室温で5分間サンプルをさらに均質化します。その後、チューブを磁気セパレーターに設置し、無菌条件下で15分間静置します。この際、分離線の視認性を高めるため、チューブのラベルが磁石の背面側を向くように注意してください。分離完了後、上清を新しい15 milliliterチューブに注意深く移し、完全培地を加えて最終容量を15 millilitersに調整します。遠心分離によって細胞を洗浄し、ペレットを1 mLの新鮮な完全培地で再懸濁します。次に細胞数を計測し、完全培地中での濃度が100 µLあたり少なくとも2 × 10⁴個のNK細胞になるように液量を調整します。単離したNK細胞を刺激するために、まずピペッティングで5回以上緩やかに混ぜ合わせ、96ウェルV底プレートの適切なウェルに細胞懸濁液を100 µLずつ分注します。消灯し、NK細胞が入った各ウェルにanti-CD107a抗体を添加します。次に、2 × 10⁴ cells/100 µLの濃度のK562腫瘍細胞分注液を、ピペッティングで少なくとも5回丁寧に混合し、刺激予定の各ウェルに腫瘍細胞を100 µLずつ移します。NK細胞機能を正確に評価するためには、精密なピペッティングとエフェクター細胞とターゲット細胞の比率を1:1に調製することが極めて重要です。次に、刺激ウェルにIL-2およびIL-15を加え、ピぺッティングを少なくとも5回行い、すべてのウェルを混合します。プレートを遮光し、37°C、5% carbon dioxideの条件下で3時間インキュベートします。消灯して1時間が経過した後、調製したばかりのタンパク質輸送阻害剤溶液を各ウェルに注意深く混ぜながら加え、プレートをインキュベーターに戻します。インキュベーション終了後、共培養物を注意深く混合し、対応するフローサイトメトリー用チューブに移します。各チューブに洗浄バッファーを1 mL加え、遠心分離を行いま

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、蛍光染色された標的細胞に対するナチュラルキラー細胞の溶解活性を示しています。この手法では、死細胞を染色し、フローサイトメーターを使用して生細胞と死細胞の標的細胞を定量することにより、NK細胞による細胞毒性の測定が可能になります。...

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Flow Cytometric Analysis 用サンプル調製

このビデオでは、2つの蛍光色素を使用して、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)のCD4+およびCD8+...

末梢血単核細胞中の免疫細胞サブセットを同定するためのフローサイトメトリーアッセイ

このプロトコルは、高感度の細胞ベースの細胞毒性アッセイについて説明しています。このアッセイは、エフェクターCD8+ T細胞の数が増加している場合の生標的CD4+ T細胞の頻度の減少を列挙することにより、抗原特異的CD8+...

細胞毒性活性を測定するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ

この研究は、ヒトの血液サンプル中のNK(Natural...

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

流れ cytometry ベースの人間のナチュラル...

ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

ここでは、CD4 を識別するためにフロー フローサイトメトリーによるプロトコルを提案+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、7 つではなく 2 つだけ螢を用いたひと末梢血単球。このアプローチでは、5 つの追加のマーカーはほとんど流れの cytometers...

7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー

がん細胞によるナチュラルキラー(NK)細胞介在の根絶の回避は、がんの開始と進行に重要です。ここでは、肝腫瘍細胞に対するNK細胞媒介性細胞毒性を評価するための非放射活性ベースの2つのプロトコルを紹介する。さらに、NK細胞の移動を分析するための第3のプロトコルが提示されます。...

肝腫瘍細胞の文脈における自然キラー細胞媒介性細胞毒性と遊性の測定

ヒトナチュラルキラー細胞における治療抗体によるFcγRIIIA駆動事象を研究するためのプロトコルをここに説明する。この人工刺激プラットフォームは、脱顆粒、ケモカイン/サイトカイン産生、および結合に関与する抗体のFcγRIIIaおよびFc部分によって媒介されるシグナル伝達経路などの下流エフェクター機能の尋問を可能にする。...

治療抗体の存在下におけるFcγRIIIa関与によるヒトナチュラルキラー細胞事象の評価

ヒトの原発性急性骨髄性白血病(AML)サンプルにおけるNKG2Dリガンド(NKG2DL)検出用の2つの異なる染色プロトコルを提示する。最初のアプローチは融合タンパク質に基づいており、既知であり、潜在的に未知のリガンドをすべて認識することができ、第2のプロトコルは複数の抗NKG2DL抗体の添加に依存する。...

急性骨髄性白血病におけるバルク亜集団と幹細胞を区別するNKG2Dリガンド表面検出の2つのフローサイトメトリックアプローチ

このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro.

キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

学ぶフローサイトメトリーに基づくNK細胞機能アッセイ。小サンプルサイズに最適化され、小児科や免疫不全患者の臨床評価に適用可能。脱顆粒とサイトカイン産生を測定し、NK細胞サブセットの役割を解明する。

NK細胞の機能を監視するためのサイトメトリーに基づくアッセイを流します

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