Name: את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An במבחנה הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: למד את שיטת התרבות המשותף העקיף של נוירונים ואסטרוציטים לחקירת ההשפעה של תאי גליה על התפתחות הסינפסות במערכת העצבים המרכזית. מודל מבחנה זה מאפשר ניטור ארוך טווח של אינטראקציות תאיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה הנוכחית נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; בית הספר למחקר של אוניברסיטת הרוהר בבוכום (GSC98/1) ותוכנית העדיפות SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

<ol><li>Volterra, A., Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%2C+from+brain+glue+to+communication+elements%3A+the+revolution+continues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).</li>
<li>Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic-neuronal+crosstalk%3A+implications+for+neuroprotection+from+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury.</a> Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).</li>
<li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signaling+between+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic signaling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li>
<li>Dityatev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+formation+and+functions+of+chondroitin+sulfate-rich+extracellular+matrix+of+perineuronal+nets%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets.</a> Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).</li>
<li>Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+developmental+neurotoxicity%3A+use+of+microelectrode+arrays+to+measure+functional+changes+in+neuronal+network+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroeng%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny.</a> Front Neuroeng. 4, 1(2011).</li>
<li>Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+Oscillatory+Activity+in+Immature+Cortical+Network+Is+Driven+by+GABAergic+Preplate+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons.</a> J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).</li>
<li>Geissler, M., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+indirect+co-culture+set+up+of+mouse+hippocampal+neurons+and+cortical+astrocytes+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays.</a> J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).</li>
<li>Yu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+astroglial+TGFbeta-Smad3+signaling+pathways+differentially+regulate+dendrite+growth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Med%22%5BJournal%5D)">Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis.</a> Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).</li>
<li>Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+reactive+astrogliosis+and+its+effect+on+neuronal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth.</a> Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).</li>
<li>Kucukdereli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+excitatory+CNS+synaptogenesis+by+astrocyte-secreted+proteins+Hevin+and+SPARC%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC.</a> PNAS. 108, E440-E449 (2011).</li>
<li>Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+crucial+for+survival+and+maturation+of+embryonic+hippocampal+neurons+in+a+neuron-glia+cell-insert+coculture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay.</a> Synapse. 65, 41-53 (2011).</li>
<li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+synaptic+transmission%3A+astrocytes+rule%21%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basal synaptic transmission: astrocytes rule!</a> Cell. 146, 675-677 (2011).</li>
<li>Christopherson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+hippocampal+neurons%2C+which+lack+four+crucial+extracellular+matrix+molecules%2C+display+abnormalities+of+synaptic+structure+and+function+and+severe+deficits+in+perineuronal+net+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation.</a> J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).</li>
<li>Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-Glia+Interactions+in+Neural+Plasticity%3A+Contributions+of+Neural+Extracellular+Matrix+and+Perineuronal+Nets%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets.</a> Neural Plast. 2016, 5214961(2016).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Pyka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+astrocyte-dependent+synaptogenesis+and+modulate+synaptic+activity+in+primary+embryonic+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons.</a> Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+astrocyte-secreted+matricellular+proteins+in+central+nervous+system+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function.</a> J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).</li>
<li>Ethell, I. M., Ethell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+in+brain+development+and+remodeling%3A+synaptic+functions+and+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets.</a> J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).</li>
<li>Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheocharidis%2C+U+%22Prog+Brain+Res%22">Prog Brain Res</a>. Dityatev, A. lexander, Wehrle-Haller, B. ernhard, Asla, P. itkänen 214, Elsevier. 3-28 (2014).</li>
<li>Dityatev, A., Rusakov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signals+of+plasticity+at+the+tetrapartite+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse.</a> Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).</li>
<li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+synapses%3A+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22JoVe%22%5BJournal%5D)">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse.</a> JoVe. , (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

המטרה העיקרית של הפרוטוקול הנוכחי היא תרבויות עצביות ו astrocytic נפרדים לחלוטין, תוך שמירה על אותם במדיום משותף. מסיבה זו, את הטוהר של תרבויות המתקבל צריך להיות מאומת בתחילת ההליך. אנו ממליצים על שימוש של טובולין נוירון ספציפי, neurofilaments או חלבון NeuN כמו סמנים עצביים, GFAP כסמן astrocytic, אנטיגן O4 כסמן מבשר oligodendrocyte ו Iba1 חלבון לזהות microglia. שים לב מיוחד בעת ביצוע שלב קריטי של הפרוטוקול, כפי ש...

במהלך העשורים האחרונים, הפרשנות הכללית של תפקוד תאי גלייה התפתחה מן הייחוס של תומכת רק לקראת תפקיד רגולציה פעיל בדבר עצבי פונקציה 1. בגלל ההשפעה הבולטת שלהם על הומאוסטזיס המוח בבריאות ובחולי 2, האסטרוציטים הם בעלי עניין מיוחד עבור הקהילה המדעית. בשנים האחרונות, מגוון של המחקרים התמקדו נוירון, גליה אינטראקציות in vivo ו במבחנה 3. עם זאת, רוב מערכות התרבות אינו מאפשרים הניתוח הנפרד של שני סוגי התאים ושל secretomes שלהם. גישות מספר לנצל את cocultivation הישיר של נוירונים גליה להשיג הישרדות לאורך זמן ופיתוח רשת עצבית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית 4-6. הפרוטוקול הנוכחי מגיע את אותן מטרות, תוך שמירה על סוגי תאים הן מופרדות 7 פיזית. לעומת conditioneבינוני ד גישות 8,9, המערכת שלנו מאפשרת ללמוד את בתקשורת דו-כיוונית בין הנוירונים האסטרוציטים. הביטוי של מולקולות איתות מופרשים ניתן לנטר תוך התאים לְהַבשִׁיל במדיום המשותף. הזדמנות זה רלוונטית במיוחד, כמו האסטרוציטים לשחרר גורמים מסיסים, כגון ציטוקינים, גורמי גדילה ומולקולות מטריקס 10,11, ובכך ויסות צמיחה עצבית ולתפקד 7,12. לפיכך, הוכח כי תוספת של thrombospondin לתאי הגנגליון ברשתית במבחנה גורם להיווצרות של סינפסות 13. עם זאת, אחרים עדיין גורמים לא ידועים נחוצים כדי להבהיר סינפסות 13 פונקציונלית. יתר על כן, מולקולות שפורסמו על ידי האסטרוציטים צריכות להיות מזוהות כדי להבין את הבסיס של נוירון, גליה אינטראקציות. הטיפוח של נוירונים עיקרי האסטרוציטים מעכבר והחולדה תואר בעבר 14-16. הנה אנחנולהציג כלי אלגנטים צדדי לשלב בין שני סוגי התאים בגישת coculture עקיפה. מאז שתי התרבויות מופרדים פיזית עדיין חולקים את אותו בינוני, ההשפעה של נוירונים, האסטרוציטים ומולקולות מסיסים, ניתן לנתח בנפרד, ובכך ליצור כלי רב עוצמה עבור מחקרים אינטראקציה נוירון, גליה.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>מים בדרגת תרבית תאים</td><td>MilliQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytosine-&#946;-D-arabinofuranoside (AraC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>זהירות: H317, H361</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)&nbsp;</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>זהירות: H317-334</td></tr><tr><td></td><td>Glucose Serva</td><td>22700</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>סרום</td><td>סוסים Biochrom AG</td><td>S9135</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2529</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7641</td><td>זהירות: H334</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>מתוצרת</td><td></td><td></td>עצמית</tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA</td><td>Gibco (Life Technologies)</td> <td>25300054</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 בארות צלחות</td><td>תרמו-מדעיות/Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>24 בארות-צלחת (לתרבית משותפת עקיפה)</td> <td>BD Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>משקפת</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>מוסיף תרבית תאים</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Heraeus</td><td>Multifuge 3S-R</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld</td><td>650010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>FST Dumont</td> <td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>פתקי כיסוי זכוכית (12&nbsp; מ"מ)</td><td>קארל רות' (מנזל-גל-אומל; ser)</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 240i</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-שפופרת (2 מ"ל)</td><td>Sarstedt</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>Millex יחידת מסנן מונעת מזרק</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Orbital</td><td>Shaker ניו ברונסוויק Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי (10 ס"מ)</td><td>Sarstedt</td><td>833,902</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה (1 מ"ל)</td><td>Gilson</td><td>Pipetman 1000</td><td></td></tr><tr><td>ספסל עבודה סטרילי</td><td>The Baker Company</td><td>Laminar Flow SterilGARD III</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיות</td><td>FST Dumont</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>מזרק</td><td>הנרי שיין</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק T75</td><td>Sarstedt</td><td>833,911,002</td><td></td></tr><tr><td>צינור (15 מ"ל)</td><td>Sarstedt</td><td>64,554,502</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>GFL</td><td>אמבט מים סוג 1004</td><td></td></tr></tbody></table>

את assay coculture neuron-astrocyte העקיפה: an<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

התפתחות עצבית תקינה ותפקוד הוא התנאי ההכרחי של הפיתוח ו במוח הבוגר. עם זאת, המנגנונים להיווצרות מאוד מבוקר ותחזוקה של רשתות נוירונים מורכבות אינם מובנים לחלוטין עד כה. השאלות הפתוחות בנוגע נוירונים בבריאות ובחולי מגווני לכת להבנת ההתפתחות הבסיסית לחקירת פתולוגיות הקשורות אדם, למשל, מחלת אלצהיימר וסכיזופרניה. הניתוח המפורט ביותר של נוירונים יכול להתבצע במבחנה. עם זאת, נוירונים דורשים תאים זקוקים לתמיכה נוספת של האסטרוציטים להישרדות ארוכת הטווח. ההטרוגניות הסלולר זהו בסכסוך במטרה לנתח את הניתוח של נוירונים האסטרוציטים. אנו מציגים כאן assay תא-תרבות המאפשר cocultivation ארוכת הטווח של הנוירונים העיקריים טהור האסטרוציטים, אשר חולקים את אותה בינוני הגדרה כימית, בעת היותו פיזיתמופרד. במצב זה, התרבויות לשרוד במשך עד ארבעה שבועות assay הוא מתאים למגוון של חקירות לגבי האינטראקציה נוירון, גליה.

הניתוח של התרבויות העצביות באמצעות מערכת coculture העקיפה מגוון וניתן לבצעו בשלבים שונים של התבגרות התרבות. בשל העובדה כי התאים יכולים להישמר לתקופה של עד 4 שבועות, חקירות ארוכות טווח של התרבויות אפשריות. סכמטית בלוח השמאלי באמצע איור 1 מדגים את ההתקנה cocultivation. עם השימוש במערכת זו, הדמיה תא חי של סוגי תאים שניהם יכולים להתבצע...

פרוטוקול זה מתאר את coculture נוירון astrocyte עקיפות ניתוח מידור של נוירון, גליה אינטראקציות.

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

המטרה הכללית של בדיקת השיתוף-תרבית (Coculture) העקיפה זו היא לחקור את השפעתם של אסטרוציטים על התפתחות נוירונים. המעבדה שלנו מתעניינת בתפקידם של אינטראקציות בין נוירונים לגליה. מקובל להאמין כי אסטרוציטים תורמים להיווצרות הסינפסים, מבני הקישור של מערכת העצבים המרכזית.כדי לחקור את תפקידם, תכננו מודל in vitro שבו ניתן לשלב אסטרוציטים ראשוניים ונוירונים עובריים ראשוניים, בתאים נפרדים. התאים מחוברים באמצעות ממברנה חדירה, המאפשרת ניתוח של חילופים בין שני סוגי התאים. באמצעות גישה זו, יכולנו לעקוב אחר היווצרות סינפסים לאורך תקופות של עד ארבעה שבועות.בנוסף, ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לבחון את התפקידים האינדיבידואליים של האסטרוציטים מצד אחד, ושל הנוירונים מהצד השני. ולבסוף, נוכל לחקור בפירוט רב יותר את הסקרטום (secretome) של מדורי התאים שלנו, המכיל מולקולות המתווכות את ההשפעה ההדדית של שני מדורי התאים במערכת זו. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי האינטראקציות בין נוירונים לאסטרוציטים.בנוסף, ניתן להחיל זאת על אורגניזמי מודל אחרים, כגון תאים מחולדה. בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בביצועה, שכן נדרש ניסיון כדי להשיג את פעולת ההבשלה האופטימלית של רקמת ההיפוקמפוס לאחר הניתוח. כדי לנתח את קליפת המוח (הקורטקס), הסירו את העור מהגולגולת לאורך קו האמצע, החל מהצוואר ובاتجד למעלה עד לגובה העיניים.בשלב הבא, החזיקו את הראש מהקצה הרוסטרלי בעזרת פינצטה ובצעו חתך לאורך קו האמצע של הגולגולת. לאחר מכן, גזרו את חצייה השמאלית והימנית של הגולגולת כדי לחשוף את המוח. לאחר מכן, הרימו את המוח מהגולגולת והעבירו אותו לפטרי dish בנפח 10 cm הממולא ב-HBSS.המשיכו באותו אופן עם שאר הדגימות עד שכל המוחות ייאספו בתוך הצלחת. כדי להפריד את קליפות המוח, תפרו את החלק האחורי בעזרת פינצטה. בצעו חתך בקו האמצע בין שני ההמיספרים.קבע את המוח בזהירות והסר את הגבלי והפחית השמירית באמצעות זוג פנסיים שני, כך שיישארו שני חצאים קורטיקליים. לאחר מכן, קבע חצי קורטיקלי אחד עם זוג פנסיים אחד וקלף את הקרומים על ידי ניתוקם מהדופן הלטראלית, ולאחר מכן משוך אותם מהמשטח הקורטיקלי באמצעות זוג פנסיים שני.הכוון את חציו הקורטיקלי כך שפניו פונים כלפי מטה. הסר בזהירות באמצעות דיסקציה את ההיפוקמפוס בעל צורת הסהר. לאחר מכן, העבר את הקורטקסים למבחנה קונית של 15 ml.הוסיפו 1 ml של denem ו-0.1%wv פפאין (papain) לפרוטוקול תגובה בנפח של 2ml. דגרו את התמיה באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C עד שהתמיסה תהיה שקופה. הוסיפו L-cysteine ו-DNAse לתערובת ונערה בעדינות.לאחר מכן סננו את התערובת כדי לקבל 1 ml של תמיסה סטרילית, ואז הוסיפו אותה לרקמה הקורטיקלית והדגירו למשך 30 דקות עד שעה ב-37 °C. כדי להפסיק את תגובת העיכול, הוסיפו 1 ml של מצע גידול לאסטרוציטים ובצעו טיטרציה 조慎ית לרקמה שעובדה. לאחר מכן, הוסיפו 5 ml של מצע גידול לאסטרוציטים לתליה התאית.לאחר שפירוק הרקמה לתליה של תאים בודדים הושלם, סובב אותה בצנטריפוגה למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאב בזהירות את העליון מהמשקע שהתקבל והשהה מחדש את התאים ב-1 ml של מצע אסטרוציטים. הוסף את תליית התאים לבקבוקי T75 שמולאו ב-9 ml של מצע אסטרוציטים.לאחר שבעת ימי תרבית, בדוק אם התאים יצרו שכבה חד-שכבתיות רצופה (confluent monolayer). ודא שהטמפרטורה מותאמת ל-37 degrees Celsius וכי המסנן של הבקבוק אטום בנייר דביק למעבדה כדי למנוע התאיידות של הפחמן הדו-חמצני. כדי להיפטר מתאי המוצא ולהשיג תרבית טהורה של אסטרוציטים, הנח את בקבוקי ה-T75 על מנער אורביטלי ונער את התרביות למשך הלילה במהירות של 250 rotations per minute.ביום למחרת, שאבו את המצע והוסיפו 10 ml של מצע גידול טרי המועשר ב-20 micromolar RSE כדי לסלק תאים מתחלקים שנותרו. בהליך זה, הניחו מספר המכניסים (inserts) הדרוש בפלטת 24 הבארים. צפו כל מכניס ב-10 micrograms per ml של poly d'lysine והדגירו למשך שעה אחת.לאחר שעה, שטפו את התאים (inserts) פעמיים עם PBS. במקביל, שאבו את מצע האסטרוציטים ושטפו את התרבית פעם אחת עם 10 ml של PBS כדי להבטיח שסרום שארי הוא הוסר. לאחר מכן, הוסיפו שלושה ml של 0.05%trypsin edta לבקבוקי השקיעה (flasks) והדגירו את התאים לטריפסינציה למשך כ-10 דקות.לאחר מכן, השביו בעדינות את התאים ב-7 ml של מצע אסטרוציטים. העבירו את תרחיף התאים לפספורה של 15 ml וסבבו במסנטריפוגה למשך חמש דקות ב-216 x g. לאחר מכן, שאבו בזהירות את העלון והשביו את משקע התאים ב-1 ml של מצע אסטרוציטים.ספרו את התאים באמצעות תא ספירה. לאחר מכן, מלאו את פלטת 24 הבארים ב-500 microliters של מצע אסטרוציטים לכל באר. שאבו את ה-PBS והעבירו 25,000 תאים ו-500 microliters של מצע אסטרוציטים לכל אינסרט בודד, והדגרימו את התרבית ב-37 degrees Celsius.כדי להוציא את ההיפוקמפוסים, הכינו שלוש צלחונות בקוטר 10 cm מלאים במדיום הכנה ופחית אחת של 2 ml עם 1 ml של מדיום הכנה. הוציאו את ההיפוקמפוסים מהקורטקס ואספו אותם לפחית של 2 ml מלאה במדיום הכנה. קריטי לבודד את ההיפוקמפוסים ללא רקמה סמוכה מאזורים אחרים של ה-CNS.לפיכך, לאחר הוצאת ההיפוקמפוס, יש להסיר בנוסף רקמות זרות המהוות זיהום. לאחר הדיסקציה, העבירו את המבחנה למCביית זרימה למינרית סטרילית. הסירו בזהירות את תמיסת ההכנה ועכלו את רקמת ההיפוקמפוס ב-1 ml של תמיסת עיכול המכילה papain.לאחר 15 דקות של עיכול, הוצא בזהירות את תמיסת העיכול באמצעות שאיבה עדינה עם פיפטה. בשל הרגישות הגבוהה של הנוירונים, קריטי לבצע טיטרציה של ההיפוקמפוס בזהירות כדי למנוע היווצרות בועות ולהשיג את עוצמת הטיטרציה האופטימלית. שטוף את ההיפוקמפוסים שלוש פעמים עם מצע נוירונים על ידי הוספה ושאיבה זהירה של 1 ml של מצע תרבית טרי בכל מחזור שטיפה.לאחר שלב השטיפה האחרון, בצעו טיטרציה זהירה של הרקמה ב-1 ml של מצע גידול לנוירונים. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות תא ספירה. זרעו 35,000 תאים ב-500 µL של מצע גידול לנוירונים לכל באר בלוח 24 בארות, והדגרימו את הנוירונים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.כעת הוציאו מהאינקובטור את ההשבחים (inserts) המוכנים, שבהם נזרעו שכבות רצופות (confluent) של אסטרוציטים. החליפו את המצע על ידי שאיבת מצע האסטרוציטים והחלפתו ב-500 µL של מצע נוירונים טרי. לאחר מכן, הניחו בזהירות את ההשבחים עם האסטרוציטים לתוך הבארים המכילות את תרביות הנוירונים באמצעות פינצטה סטרילית.לאחר מכן, החזיר את תרבית השיתוף (coculture) העקיפה של נוירונים ואסטרוसाइटים לדגירה באינקובטור עד לביצוע הניסויים. תמונה זו מראה את השכבות החד-שכבתיות (monolayers) שנוצרו על ידי אסטרוसाइटים על ממברנת המאסף לתרבית תאים. האסטרוसाइटים נצבעו בשיטת אימונו-סטינינג עבור GFAP ו-MMP2.הסכימה כאן ממחישה את מערך התרביות המשותפות העקיף. למרות ששתי התרביות מופרדות פיזית, הן חולקות את אותו מצע. שני מתווכים מולקולריים מופרשים של אינטראקציות בין נוירונים לגליות נחשפו במצע הגידול המשותף באמצעות western blot עם מספר איזופורמות של TNC, רגולטור גדילה ישיר, ו-MMP2, משנה של המטריקס החוץ-תאי.תמונה זו מראה כי נוירונים ראשוניים מפתחים רשתות בעלות קישוריות גבוהה עד ליום ה-14 של התרבית. השיתוף במיקום (co-localization) של הסמן הפרסינפטי bassoon עם פיגום ה-PSD95 הפוסטסינפטי מעיד עלהיווצרות סינפטית שלמה מבחינה מבנית. לסיכום, באמצעות מערכת הבדיקה שלנו הראינו כי ניתן לשלב אסטרוציטים ראשוניים ונוירונים ראשוניים במודל של תרבית משותפת (coculture).שני סוגי התאי העזר (surtypes) מופרדים אך חולקים את אותו המצע. לפיכך, נוכל לחקור במודל שלנו גם את הסקרטום (secretome) של שני סוגי התאים. במודל זה סינפסות מתפתחות ומבשילות.בנוסף לכך, אנו יכולים להראות הופעה של מבנים ספציפיים נוספים, כגון רשתות פרי-נוירונליות (perineuronal nets). לפיכך, מערכת המודל שלנו מתאימה היטב לחקירת השפעתם של אסטרוציטים על היווצרות סינפסות, על פלסטיות ועל תפקוד.

the-indirect-neuron-astrocyte-coculture-assay-an-vitro-set-up-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מתאר פרוטוקול מגיב רומן ולהגדיר מיועד מדידה רגישה של ההשפעות הנוירו של תרכובות וטיפולים על שיתוף תרבויות של נוירונים האסטרוציטים באמצעות ניתוח תוכן גבוהה. תוצאות מראים כי ניתוח תוכן גבוהה מהווה טכנולוגיה חדשנית מרגש להערכה neurotoxicity.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

בפרוטוקול זה, אנו תיאר שיטה חדשה ללמוד את השפעת ההטרוגניות תא גליה על צמיחת האקסון...

תא גלייה לימוד הטרוגניות השפעה על הצמיחה אקסון בשיטה Coculture חדש

כאן אנו מספקים פרוטוקול עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing בנוכחות שכבה מזין גליה. נוירונים בתרבית להקים הקוטביות וליצור סינפסות, והוא יכול להיות מופרד גליה לשימוש ביישומים שונים, כגון electrophysiology, הדמיה סידן, מבחני הישרדות התא, immunocytochemistry, ו-RNA / DNA / בידוד החלבון.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

סרטון זה מדגים שיטה לביסוס תרבית משותפת עקיפה של נוירון-אסטרוציטים באמצעות גישה ממודרת. במערך זה, נוירונים ואסטרוציטים מופרדים מרחבית אך חולקים תווך מותנה. גורמים נוירוטרופיים המשוחררים על ידי אסטרוציטים מקדמים התמיינות נוירונים ויצירת קשרים סינפטיים, דבר המצביע על אינטראקציות נוירון-גליה.

טכניקה עקיפה של תרבית נוירון-אסטרוציטים לחקר אינטראקציות נוירון-גליה

סרטון זה מדגים את הקמתה של תרבית משותפת של תאי עצב המושרים על ידי בני אדם (iNs) ותאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים מושרים (iOPCs). iNs מעורבבים עם iOPCs בתרבית משותפת ולאחר מכן מודגרים כדי לתמוך בהבשלה של iNs לנוירונים ו- iOPCs לאוליגודנדרוציטים. תאי עצב יוצרים קשרים סינפטיים עם תאי עצב ואוליגודנדרוציטים אחרים, בעוד שאוליגודנדרוציטים מפתחים מעטה מיאלין סביב אקסוני הנוירונים.

שיטת תרבית משותפת למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

סרטון זה מדגים הקמת תרבית משותפת של נוירון-אסטרוציטים להקלטת פעילות הרשת העצבית. עם ביסוס התרבות המשותפת של נוירונים מוטוריים ואסטרוציטים על לוח MEA (Multi-electrode Array – Multi-Electrode Array – MEA), הפעילות החשמלית הקצבית הסינכרונית של הרשת העצבית נרשמה באופן חוץ-תאי באמצעות MEA.

רישום הפעילות האלקטרופיזיולוגית של הרשת העצבית בתרבית משותפת של נוירון-אסטרוציטים

סרטון זה מדגים את הערכת הפעילות החשמלית העצבית בתרבית משותפת של נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח שמקורם ב-hiPSC ותאי גליומה באמצעות מכשיר מיקרופלואידי עם מערכים מרובי אלקטרודות.

הערכת אינטראקציות בין נוירונים גלוטמטרגיים ותאי גליומה בתרבית משותפת

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

כאן, אנו מציגים גישה פשוטה באמצעות מדיה תרבותית ספציפית המאפשרת הקמת תרבויות מועשרות בנוירון ואסטרוקייט, או תרבויות נוירון-גליה מקליפת המוח העוברית, עם תשואה גבוהה ושחזור.

מודל תרבות תא לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה באיסכמיה

פרוטוקול זה מתאר תרבית מיקרוגליה-נוירונים שנוצרה מתאים עצביים ראשוניים שבודדו מעוברי עכברים בימים עובריים 15-16 ומתאי מיקרוגליה ראשוניים שנוצרו ממוחם של עכברים ילודים בימים 1-2 שלאחר הלידה.

יצירה וטיפוח משותף של תאי מיקרוגליה ראשוניים של מורין ונוירונים קורטיקליים

למד את שיטת התרבות המשותף העקיף של נוירונים ואסטרוציטים לחקירת ההשפעה של תאי גליה על התפתחות הסינפסות במערכת העצבים המרכזית. מודל מבחנה זה מאפשר ניטור ארוך טווח של אינטראקציות תאיות.

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An

גלה סרטונים נוספים