Name: Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la In Vitro Effetto profilattico di interferoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Impara a stabilire un sistema di coltura cellulare infettiva per lo studio della replicazione del virus Zika utilizzando cellule Vero. Questo metodo supporta lo sviluppo di farmaci e vaccini contro le malattie virali.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Aaron Brault e il Dr. Brandy Russell dei Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA per aver fornito PRVABC59 del ceppo virale Zika. Ringraziamo Nicholas Ten dell'Università di Yale per il copy-editing di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award a V.A.

Nota: Un profilo schematico del flusso di lavoro è presentato in Figura 1. 1. cellule <ol><li> Utilizzare cellule Vero per la produzione di virus Zika e l&#39;analisi del ciclo di replicazione virale. </li><li> Preparare mezzi completi crescita contenente 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 unità / ml), e 10 mM HEPES. </li><li> Cellule Vero coltura con terreno di coltura completo specificato a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> 2. Zika Virus Produzione <ol><li> Raccogliere le cellule Vero a densità cellulare 80% con 0,25% tripsina in T-75 pallone e contare le cellule. <ol><li> Aspirare il supporto dal pallone di coltura T-75 e sciacquare le cellule con 2 ml di tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina e incubare il matraccio a 37 ° C per 5 min. </li><li> Aggiungere 8 ml di siero contenenti terreno di coltura per inattivare la tripsina. Pipettare su e giù per suscellule pend e trasferire le cellule ad una provetta da 15 ml. </li><li> Rimuovere 10 ml di cellule e mescolare con la stessa quantità di 0,4% trypan blu. Caricare il mix preparato alla diapositiva camera di conteggio delle cellule e di ottenere cellule vitali conteggi si utilizza un contatore di cellule automatizzato. </li></ol></li><li> Seme un totale di 7 milioni di cellule in un volume di 30 ml in un pallone T-160. </li><li> Il giorno successivo, preparare una molteplicità appropriata di infezione (0,01-0,1 MOI) di Zika inoculo virus in un terreno di coltura libero 10 ml di siero per bombola. </li><li> Rimuovere il supporto trascorso dal pallone T-160 e quindi aggiungere l&#39;inoculo virale appena preparato (10 ml). </li><li> Incubare i flaconi inoculati nel 37 ° C con 5% di CO 2 per 4-6 ore. Stendere l&#39;inoculo inclinando leggermente i fiaschi di traverso ad ogni ora. </li><li> Al termine dell&#39;incubazione, sostituire l&#39;inoculo con mezzi calda siero integrato crescita (30 ml) in ciascun contenitore. Poi continuare la coltura virale per il prossimo 96 ore. </li><li> Verificare la progressione infection osservando la comparsa di placche virali sul monostrato cellulare utilizzando un microscopio a contrasto di fase e prendere immagini (Figura 2) come necessario al 40X e 200X ingrandimenti. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" /> Figura 2:. Placche formate da virus Zika su un monostrato di cellule Vero immagini in campo chiaro di vari ingrandimenti mostrano Zika placche virali a 48 HPI. Si noti la presenza di foci di cellule arrotondate sul monostrato. (Scala bar = 50 micron) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="8"><li> Harvest supernatanti di coltura cellulare al punto di tempo a 96 ore e centrifugare il surnatante a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. </li><li> rimuovere con attenzione il surnatante, senza detriti pellet inquietante e trasferimento to provette da 15 ml. Ultracentrifugazione a 24.000 xg può essere eseguita per concentrare le particelle virali (opzionali). </li><li> Conservare i sovranatanti virali in più aliquote a -80 ° C. </li></ol> 3. Misurazione Zika Virus Titer dalla placca Assay <ol><li> Cellule Vero naive Seed a 1 x 10 5 cellule per pozzetto a 2 ml di volume, con un 12-pozzetti. </li><li> Il giorno seguente, preparare 10-diluizioni seriali di surnatanti virali raccolti dai pallone T-160 utilizzando supporti privo di siero. Rimuovere i supporti spesi da ciascun pozzetto e aggiungere 400 ml di inoculo preparato su cellule Vero in triplice copia. </li><li> Incubare i flaconi inoculati a 37 ° C con 5% di CO 2 per 4-6 ore. Stendere l&#39;inoculo inclinando leggermente la piastra di traverso ad ogni ora. </li><li> Al termine dell&#39;incubazione, sostituire l&#39;inoculo con mezzi di siero integrato (2 ml per pozzetto). </li><li> A 48 ore post-inoculazione, contare i fuochi virale utilizzando un contr fase diMicroscopio ast. Calcolare il titolo virale come unità formando la placca (PFU) per ml. Vedi Figura 3 per il saggio di placca. </li><li> Fissare e macchiare le cellule del 4% di formaldeide e la soluzione al cristalvioletto 0,1% preparate in etanolo al 20% per una chiara visualizzazione delle placche. </li></ol> Assay 4. Zika virale Genome replica <ol><li> Cellule Vero naive Seed a 1 x 10 5 cellule per pozzetto in 2 volumi ml con un 12-pozzetti. Il giorno seguente, preparare inoculi virali (MOI di 0,01 e 0,1; 400 ml / pozzetto) di basso e alto titolo utilizzando siero media liberi in triplice copia. Per l&#39;infezione finto, utilizzare il siero media liberi (400 ml / pozzetto) solo. </li><li> Ripetere i passaggi 3,2-3,4. </li><li> Nei punti di tempo 48 e 96 ore, raccogliere i campioni di RNA e immunocitochimica (ICC). <ol><li> Per i campioni di raccolta di RNA, rimuovere il supporto e poi aggiungere 400 ml di soluzione di lisi direttamente a ciascun bene e raccogliere i lisati. </li><li> Per ICC, rimuovere il supporto e tgallina fissare le cellule aggiungendo 1 ml di metanolo a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 4 ° C per 30 min. </li><li> Dal lisato cellulare, isolare l&#39;RNA totale utilizzando un kit di isolamento di RNA secondo le istruzioni del produttore. Quantificare l&#39;RNA utilizzando uno spettrofotometro. </li></ol></li><li> Eseguire due fasi di trascrizione inversa PCR quantitativa (RT-qPCR) per determinare il contenuto genoma ZIKV da RNA raccolto. <ol><li> Per invertire trascrivere l&#39;RNA, prima impostare un mix di reazione 13 ml composta da 5 mg di RNA isolato, 1 ml di dNTP (10 mm), e 1 ml esamero casuale (250 ng) in un tubo di 0,2 ml. Incubare la provetta a 65 ° C per 5 minuti e poi posto in ghiaccio per un minuto. Successivamente, aggiungere 1 ml di trascrittasi inversa, 4 ml di tampone di sintesi 5x filone, 1 ml di 0,1 M ditiotreitolo, e 1 ml di RNasi inibitore alla miscela di reazione. Incubare la provetta per altri 5 minuti a 25 ° C, seguita da 60 minuti a 50 ° C e inactivmangiato la reazione mediante riscaldamento a 70 ° C per 15 min. </li><li> Eseguire qPCR utilizzando 1 ml di cDNA risultante con 12,5 ml di colorante verde 2x eccellente mix contenenti DNA polimerasi e 1 ml di 10 mm singoli primer specifici per il virus Zika [Zika virus pan-genotipo primer (per: 5&#39;-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 &#39; ; Rev: 5&#39;-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 &#39;), virus Zika genotipo asiatico primer deformazione PRVABC59 (5&#39;-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3&#39;; Rev: 5&#39;-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 &#39;)], o il virus dell&#39;epatite C (JFH RTQ F: 5 &#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;), o cellulare GAPDH gene housekeeping (Per: 5&#39;-CCACCTTTGACGCTGGG-3 &#39;; Rev: 5&#39;-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3&#39;) in un volume di reazione di 25 microlitri. </li><li> Eseguire la PCR utilizzando la condizione di esercizio 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 30 sec (40 cicli) in un sistema PCR in tempo reale. </li><li> Utilizzare livello di espressione GAPDH sulla base di soglie ciclo value (Ct) per normalizzare la Zika misura genoma virale. Calcolare il valore delta Ct (ΔCt) di Zika genoma rispetto a quello della GAPDH e ottenere il valore 2 ΔCt. Quindi, calcolare la variazione volte prendendo il rapporto tra normalizzati Zika contenuti del genoma tra le cellule infetti e non infetti in punti all&#39;ora indicata. Si veda la Figura 4 per i risultati di replica ZIKV genoma. </li></ol></li><li> Eseguire ICC utilizzando le cellule metanolo fisso. <ol><li> Lavare le cellule fissate tre volte con PBS 1x e bloccare con ICC tampone bloccante (3% siero di capra, 3% BSA, 0,1% Triton-X 100 in PBS). </li><li> Usa il mouse monoclonale anti-dsRNA anticorpi J2 (1 mg / ml) alla diluizione di 1: 100 in tampone di bloccaggio e incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule con PBS 1x e aggiungere anticorpo secondario di capra anti-topo IgG-594 (1 mg / ml) ad una diluizione 1: 1.000 in tampone bloccante e incubare per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con PBS 1x e colorare per i nuclei con colorante Hoechst eosservare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ingrandimento 100X (Figura 4). </li></ol></li></ol> 5. Screening citochine Biblioteca contro Zika infezione da virus <ol><li> Seed cellule Vero naive a 1 x 10 5 cellule per pozzetto utilizzando un 12-pozzetti. Una volta che le cellule sono fissati (6 ore post-semina), aggiungere ciascuna citochina a concentrazioni indicate in duplicati biologici (2 ml di volume / pozzetto). Includi veicolo (PBS) il controllo da solo. </li><li> A 12 ore dopo il trattamento, effettuare infezione virale Zika (MOI di 0,1 a 400 ml per pozzetto). Includere pozzetti di controllo negativo senza infezione (finto). </li><li> A 4 ore dopo l&#39;infezione, sostituire l&#39;inoculo virale con i media di citochine trattati (2 ml). Incubare le cellule a 37 ° C per ulteriori 44 ore. </li><li> A 48 ore dopo l&#39;infezione, contare le placche virali utilizzando un microscopio a contrasto di fase e di acquisire immagini rappresentative di cellule infettate a 40X di ingrandimento (Figura 5). </li></ol>

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<li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li>
<li>Hiratsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+interferon-alpha+during+pregnancy%3A+effects+on+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Perinat+Med%22%5BJournal%5D)">Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus.</a> J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).</li>
<li>Ozaslan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+therapy+for+acute+hepatitis+C+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy.</a> Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, un protocollo semplificato per la coltura dei virus Zika in vitro è presentato. Passaggi critici tra cui, individuando punti finali ottimali per espandere la cultura del virus, la misurazione titolo, e quantificare replicazione del genoma sono stati forniti. virus Zika è un patogeno umano, così, durante la manipolazione di agenti infettivi, le procedure di biosicurezza devono essere seguite scrupolosamente. Una linea cellulare di rene di scimmia, Vero, è stato utilizzato per dimostrare vari saggi virologic...

Zika Virus (ZIKV) è un importante patogeno umano associato con microcefalia e poveri gravidanza esiti 1,4. ZIKV appartiene alla serie di flavivirus clinicamente rilevanti che possono causare difetti neurologici, come la dengue, West Nile, e virus encefalite di St. Louis. La modalità principale di trasmissione virale è dal vettore zanzara Aedes aegypti, e, inoltre, la trasmissione sessuale è stata riportata anche 5,6. ZIKV è diventata un importante problema di salute globale a causa della espansione della distribuzione geografica della zanzara vettore e la sua forte correlazione con difetti alla nascita. ZIKV è stato isolato nel 1947 da una scimmia Rhesus sentinella nel bosco Zika, l&#39;Uganda e il primo caso umano è stato segnalato nel 1952 7,8. Gli individui che si infettano con ZIKV presente con sintomi lievi come febbre, eruzioni cutanee, mal di testa, congiuntivite, dolori muscolari e / articolare. Le donne in gravidanza infettate possono trasmettere ZIKV al feto in via di sviluppo 1. ZInfezione IKV è stata anche legata alla sindrome di Guillain-Barre, un nervo periferico demielinizzazione autoimmune disturbo 9. Il genoma virale Zika consiste in un senso positivo, molecola a singolo filamento di RNA che è di circa 10,8 chilobasi di lunghezza. La struttura del genoma è organizzato come 5&#39;NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3&#39;NCR, con le regioni non codificanti (NCR) che fiancheggia una regione codificante 6. Una singola poliproteico (3.419 bis) è tradotto cioè co- e post-traduzionali spaccati in 10 piccoli peptidi. Sia il 5&#39;NCR e strutture stem-loop 3&#39;NCR RNA svolgono un ruolo critico nella inizio della traduzione del genoma virale e la replica. I componenti strutturali del genoma sono costituiti da proteine ​​capside, membrana, e la busta. Le proteine ​​non strutturali sono fondamentali per replicazione del genoma. Attualmente, i ceppi virali Zika sono raggruppati in tre genotipi principali: West African, Dell&#39;Africa orientale e asiatico 6,10-13. E &#39;stato proposto che l&#39;Oriente lignaggio africano diffuso in Africa occidentale e in Asia, dove poi ulteriormente evoluto 12. Il genotipo asiatico è responsabile per le epidemie in corso in America. virus Zika può essere coltivato sia in zanzare e cellule di mammifero. Fibroblasti dermici primarie, cellule dendritiche immature, cellule progenitrici neurali corticali, e le cellule Vero sono suscettibili alle infezioni virali Zika 10,14,15. Sia di tipo I e tipo II interferoni hanno dimostrato di limitare la crescita ZIKV nei fibroblasti cutanei 15. Gli obiettivi di questo studio sono quelli di fornire un graduale, protocollo dettagliato per la produzione e il saggio del genotipo asiatico ZIKA ceppo virale PRVABC59 in un sistema di coltura cellulare di mammifero e per dimostrare l&#39;utilità di questo sistema di coltura infettiva come piattaforma di sviluppo di droga. Questa risorsa ha il potenziale per beneficiare notevolmente la comunità di ricerca virale e neurologica Zika di chiarire ulteriormente imeccanismi di patogenesi ts virale e l&#39;evoluzione della virulenza del virus.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' (DMEM)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>2,5% di tripsina, 10x [-] Fenolo rosso&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Contessa - ndash; Contatore di cellule automatizzato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Countess-cell countess&nbsp; vetrini della camera</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>monoclonale di topo anti-dsRNA anticorpo J2&nbsp;</td><td>Italiano & Consulenza Scientifica Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>capra anti-coniglio IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fischer</td><td>4471088</td><td></td></tr><tr><td>senza RNasi DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Vero Cell Line&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>Ceppo virale Zika PRVABC59</td><td>Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 alfa&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>200-01A &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa</td><td>Peprotech</td><td>300-01A&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Interferone alfa A &nbsp;</td><td>R & D Systems</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>Interferone beta</td><td>Peprotech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>Interferone gamma</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti Microscopio a immunofluorescenza con Nikon Intenselight C-HGFI</td><td>Nikon</td><td>Visita Nikon su richiesta</td><td></td></tr></tbody></table>

zika virus system infettiva coltura cellulare e la<em&gt; in vitro</em&gt; effetto profilattico di interferoni

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) è un patogeno emergente che è collegato a anomalie dello sviluppo fetale, come la microcefalia, difetti dell&#39;occhio, e la crescita compromessa. ZIKV è un virus a RNA della famiglia Flaviviridae. ZIKV è trasmesso principalmente dalle zanzare, ma può anche essere diffuso da materna a trasmissione verticale del feto, così come il contatto sessuale. Fino ad oggi, non ci sono trattamenti o vaccini opzioni affidabili per proteggere quelli infettati dal virus. Lo sviluppo di un sistema di coltura cellulare riproducibile, efficace virus Zika infettiva è critico per studiare i meccanismi molecolari di replicazione ZIKV così come farmaci e vaccini sviluppo. A questo proposito, un protocollo che descrive una in vitro Zika sistema di coltura di cellule di mammifero basata virus per virale analisi produzione e la crescita è riportata qui. Dettagli sulla formazione di placche da virus Zika su un monostrato di cellule e saggio di placca per misurare titolo virale sono presentati. cinetica replica genoma viralee doppio filamento di RNA genomici intermedi replicatory sono determinati. Questa piattaforma coltura è stata utilizzata per lo schermo da una libreria di un piccolo gruppo di citochine conseguente identificazione di interferone-α (IFN-α), IFN-β e IFN-γ come inibitori potenti del Zika crescita virale. In sintesi, un infettiva sistema di coltura in vitro Zika virale e vari saggi virologici sono dimostrati in questo studio, che ha il potenziale per beneficiare notevolmente la comunità di ricerca nel chiarire ulteriormente i meccanismi di patogenesi virale e l&#39;evoluzione della virulenza del virus. Antivirale IFN-alfa può essere ulteriormente valutata come un profilattico, profilattico post-esposizione, e opzione di trattamento per le infezioni da virus Zika in popolazioni ad alto rischio, comprese le donne in gravidanza infettate.

Un ceppo virale Zika (PRVABC59; GenBank numero di accesso KU501215) del genotipo asiatico è stato utilizzato in questo studio 12. Cellule Vero a 80% di confluenza sono stati usati per indagare de novo Zika infezione virale. Per la produzione virale e la successiva caratterizzazione virologica, un passaggio precoce del virus (P3) Zika è stato impiegato. Sono state rilevate le placche virali il secondo giorno di infezione. Zika progenie virali rilasciate dalla cellula i...

Il virus Zika (ZIKV), un patogeno emergente, è collegato ad anomalie dello sviluppo fetale e microcefalia. La creazione di un efficace sistema di coltura cellulare infettiva è fondamentale per gli studi sulla replicazione di ZIKV e per lo sviluppo di vaccini e farmaci. In questo studio, vengono illustrati e discussi vari saggi virologici relativi alla ZIKV.

Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la<em&gt; In Vitro</em&gt; Effetto profilattico di interferoni

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

L'obiettivo generale di questo studio è quello di stabilire un sistema di coltura infettiva in vitro basato su cellule di mammifero per lo studio della replicazione del virus Zika, nonché l'utilizzo della piattaforma in vitro per lo sviluppo di farmaci. Questo protocollo dettagliato passo dopo passo del sistema di coltura cellulare infettiva per il virus Zika può contribuire a chiarire il meccanismo di patogenesi delle malattie indotte dal virus Zika e l'evoluzione della virulenza virale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la produzione su larga scala del virus Zika per lo sviluppo di farmaci e vaccini.Iniziare raccogliendo le cellule Vero a una densità cellulare dell'80% in un fiasco colturale T75, aspirando il mezzo dal fiasco e lavando le cellule con due millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato. Aggiungere due millilitri di tripsina allo 0,25% e incubare il fiasco a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere otto millilitri di mezzo di crescita contenente siero per inattivare la tripsina. Successivamente, trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri. Prelevare quindi 10 microlitri di cellule e mescolarli con una quantità uguale di blu di tripano allo 0,4%. Caricare la miscela preparata nella camera per il conteggio cellulare e determinare il numero di cellule vitali mediante un contatore cellulare automatico. Seminare un totale di sette milioni di cellule in un fiasco T160 in un volume di 30 millilitri. Il giorno successivo, preparare un'adeguata molteplicità di infezione dell'inoculo del virus Zika in 10 millilitri di mezzo di coltura privo di siero per ogni fiasco. La manipolazione sicura del virus è fondamentale per prevenire la diffusione dell'infezione.Rimuovere il mezzo usato dal fiasco T160 e quindi aggiungere tutti i 10 millilitri di inocolo virale appena preparato. Incubare i fiaschi inoculati a 37 gradi Celsius con 5%CO2 per quattro-sei ore. Distribuire l'inoculo inclinando delicatamente il fiasco lateralmente ogni ora durante l'incubazione. Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con 30 millilitri di mezzo di crescita tiepido integrato con siero. Proseguire quindi la coltura virale per le successive 96 ore. Dopo quattro giorni, verificare l'andamento dell'infezione osservando l'aspetto delle placche virali sul monolayer cellulare, utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Acquisire immagini secondo necessità a 40x e 200x di ingrandimento. Raccogliere i supernatanti della coltura cellulare al tempo di 96 ore e centrifugare il supernatante a 300 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione i supernatanti senza disturbare il pellet di detriti e trasferirli in provette da 15 millilitri.Conservare i supernatanti della coltura virale in aliquote multiple a meno 80 gradi Celsius. Per titolare il virus, seminare innanzitutto cellule Vero naive in una piastra a 12 pozzetti a una densità di uno per dieci alla quinta cellule per pozzetto, in un volume di due millilitri. Il giorno seguente, preparare diluizioni seriali decrescenti di dieci volte dei supernatanti della coltura virale, raccolti dal flask T160 utilizzando mezzo privo di siero.Quando si preparano diluizioni seriali del supernatante della coltura virale per la titolazione degli acidi, assicurarsi di manipolare il virus in modo sicuro per prevenire infezioni. Successivamente, rimuovere il mezzo usato da ogni pozzetto della piastra a 12 pozzetti contenente cellule Vero e aggiungere 400 microlitri dell'inoculo diluito sulle cellule Vero in triplice replicato. Incubare le piastre inoculate nell'incubatore per colture cellulari per quattro-sei ore.Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con due millilitri di mezzo supplementato con siero per pozzetto. A 48 ore dall'inoculo, contare le placche virali alle diluizioni appropriate, utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Calcolare il titolo virale in unità formanti placca per millilitro.Dopo aver inoculato cellule Vero in una piastra a 12 pozzetti con titoli elevati e bassi del virus Zika, e averle incubate per 48 e 96 ore, la replicazione del genoma viene valutata mediante PCR quantitativa per l'espressione del genoma virale Zika e mediante immunocitochimica per l'RNA a doppio filamento. Per l'immunocitochimica, rimuovere il mezzo dalle pozzette della piastra a 12 pozzette e aggiungere un millilitro di metanolo in ciascuna pozzetta. Lasciare fissare le cellule a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, lavare le cellule fissate tre volte con PBS 1x. Poi aggiungere il buffer di blocco e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Diluire l'anticorpo monoclonale murino anti-RNA a doppio filamento J2 nel buffer di blocco in rapporto 1:100, aggiungerlo alle cellule e incubare le cellule in questa soluzione tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, diluire l'anticorpo secondario caprino anti-mouse IgG-594 nel buffer di blocco in rapporto 1:1.000 e, dopo aver lavato le cellule con PBS 1x, aggiungerlo alle cellule e incubarle per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le cellule con PBS 1x, colorare i nuclei utilizzando il colorante Hoechst e osservare le cellule mediante microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 100x.Six ore dopo aver seminato una piastra a 12 pozzetti con cellule Vero naive, come in precedenza, aggiungere le citochine di interesse alle concentrazioni indicate in duplicati biologici. Dodici ore dopo il trattamento, effettuare l'infezione con il virus Zika e includere pozzetti di controllo negativo senza infezione. Quattro ore dopo l'infezione, sostituire l'inoculo virale con mezzo trattato con citochine, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per ulteriori 44 ore. A 48 ore dall'infezione, contare le placche virali utilizzando un microscopio a contrasto di fase e acquisire immagini rappresentative delle cellule infette a un ingrandimento di 40x.Questo grafico mostra il contenuto genomico del virus Zika misurato mediante RT-qPCR. I primer per il genotipo Pan e per la ceppa PRVABC-59 hanno mostrato uguale sensibilità e specificità. Come previsto, i primer virali per l'epatite C non hanno amplificato alcun prodotto.Cinetiche di crescita virale del Zika nei punti temporali indicati in cellule infette con titolo basso e alto, confrontate con quelle del controllo non infetto (mock), sono mostrate qui. I risultati del saggio di immunocitochimica mostrano che a 48 ore post-infezione le cellule infette sono presenti in pochi aggregati, mentre a 96 ore post-infezione la maggior parte delle cellule è infetta. Questo grafico mostra la modulazione della crescita virale del Zika da parte di diverse citochine, confrontata con quella del controllo veicolo.Queste immagini a contrasto di fase mostrano cellule infettate dal virus Zika con o senza trattamento con citochine. Le placche virali formate dalle cellule infettate sono visibili come foci. Si noti che le pozzette trattate con interferone non presentano placche virali.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la mappatura ad alta risoluzione di dominii del virus Zika per la localizzazione delle proteine virali e la replicazione nelle cellule di zanzara e umane, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio chiarire il meccanismo di patogenesi della malattia e l'evoluzione della virulenza virale. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come stabilire un sistema di coltura infettiva in vitro basato su cellule di mammifero per lo studio della replicazione del virus Zika, nonché dell'utilizzo della piattaforma in vitro per lo sviluppo di farmaci e vaccini.

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Impara a stabilire un sistema di coltura cellulare infettiva per lo studio della replicazione del virus Zika utilizzando cellule Vero. Questo metodo supporta lo sviluppo di farmaci e vaccini contro le malattie virali.

Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la

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