Name: Évaluation de la Fonction bioénergétique dans les cellules endothéliales vasculaires cérébraux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Découvrez l'évaluation de la fonction mitochondriale dans les cellules endothéliales vasculaires cérébrales pour étudier les troubles neurologiques. Cette méthode permet d'analyser en temps réel l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique.

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Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes : AHA 16SDG31170008 à X.R. et NIH P20 GM109098, P01 AG027956 et U54 GM104942 à J.W.S.

NOTE: Le régime du protocole est illustré à la figure 1, y compris un calendrier des procédures. 1. Culture et Passage des cellules CVE <ol><li> Culture des cellules CVE (cellules bEnd.3) en milieu de croissance complet (milieu de Eagle modifié de glucose élevé Dulbecco, DMEM) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine dans un T75 cm 2 flacon de culture tissulaire. Croissance à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Retirer et jeter le milieu de culture cellulaire. Rincer la couche cellulaire avec 0,25% de solution d&#39;EDTA-trypsine à 0,03%, puis ajouter 1 - 2 ml de solution de trypsine-EDTA dans le ballon et maintenir le ballon à 37 ° C pendant 3 à 5 min. Observer les cellules sous un microscope inversé jusqu&#39;à ce que la couche de cellules est détaché. Ajouter 10 ml de milieu de croissance complet et aspirer les cellules par pipetage. </li><li> Décanter le liquide et les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et centrifuger à 700 g pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires. </li&gt; <li> Jeter le surnageant du tube de centrifugation. Ajouter 10 ml de milieu de croissance complet et remettre en suspension le culot cellulaire. Faites tourner les cellules à 700 g pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant du tube de centrifugation. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu de croissance complet à une concentration de 2,0 x 10 5 cellules / ml (déterminée par comptage en utilisant un hémocytomètre, d&#39; exclure les cellules mortes par une coloration au bleu trypan). REMARQUE: les cellules fraîchement décongelés sont sous-cultivés pendant au moins 3 passages pour les expériences. </li></ol> 2. Seed et traiter les cellules sur des plaques de culture cellulaire <ol><li> cellules de semences sur un flux plaque extracellulaire 96 puits de culture cellulaire: 80 pl / puits. Placer la plaque de culture cellulaire à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Note: 16 × 10 3 cellules par puits atteindra 60-80% de confluence dans les 24 h. </li><li> Si les cellules sont exposées à un produit chimique, ajouter les traitements une fois que les cellules sont fixées au fond de la plaque (8 - 24 h après voirding). NOTE: Pour les expériences de transfection, ne pas ajouter d&#39;antibiotiques dans le milieu de croissance complet. </li></ol> 3. Évaluation des mitochondrial Fonction Utilisation du Bioanalyseur <ol><li> Avant le début de l&#39;essai, un hydrate d&#39; une cartouche de capteur de flux extracellulaire calibrant par addition de 150 ul de solution extracellulaire du flux calibrant à la plaque et l&#39; incubation O / N à 37 ° C sans CO 2. </li><li> Utilisation de la station de lavage de plaques, de changer le milieu de culture cellulaire dans un pH de 7,0 extracellulaire flux de milieu d&#39;essai. Incuber les cellules à 37 ° C sans CO2 pendant 30-60 min. </li><li> Préparer des solutions de travail de 8 uM oligomycine, 4,5 uM FCCP, 10 uM roténone, et 10 uM antimycine A dans DMEM. Charge 25 uL des solutions mères dans les ports d&#39;injection de cartouche: Port A, oligomycine; Port B, FCCP; Port C, roténone et antimycine A avec un milieu de dosage flux extracellulaire. Mettre en oeuvre le protocole d&#39;essai décrit dans le tableau 1. </li><li> Chargez la cartouche hydratée dans le Bioanalyseur et effectuer l&#39;étalonnage en cliquant sur le bouton &quot;Démarrer&quot;. Après la calibration est terminée, retirez la plaque de fond de la cartouche et charger la plaque de cellule en cliquant sur l&#39;invite &quot;Unload Cartridge&quot;. Poursuivre l&#39;essai jusqu&#39;à la fin de toutes les mesures. </li><li> Ouvrez le fichier de données et obtenir les valeurs de taux de la Bioanalyseur. Exporter les données dans un fichier de feuille de calcul. </li></ol> 4. Analyses de données NOTE: Les calculs pour les analyses de données sont formulées ci-dessous. Les valeurs sont obtenues à partir de l&#39;instrument de bioanalyser comme OCR présenté dans la figure 2. <ol><li> Pour calculer la respiration basale, soustraire la respiration non-mitochondrial (mesures 10 - 12) à partir de la valeur basale (mesure 3). REMARQUE: la respiration basale = Basal - respiration non-mitochondrial = Taux ③ - Taux ⑩ ~ ⑫. </li><li> Pour calculer producti ATPsur, soustraire la respiration ATP lié (mesures 4 - 6) de la valeur basale (mesure 3). NOTE: la production d&#39;ATP = Basal - respiration ATP lié = Taux ③ - Taux ④ ~ ⑥. </li><li> Pour calculer la respiration Maximal, soustraire la respiration non-mitochondrial (mesures 10 - 12) à partir de la respiration maximale (mesures 7 - 9). REMARQUE: la respiration Maximal = respiration maximale - non-mitochondrial respiration = Taux ⑦ ~ ⑨ - Taux ⑩ ~ ⑫. </li><li> Pour calculer la capacité de rechange, soustraire la valeur basale (mesure 3) de la respiration maximale (mesures 7 - 9). NOTE: La capacité de réserve = respiration maximale - Basal = Taux ⑦ ~ ⑨ - Taux ③. </li><li> Pour calculer Proton fuite, soustraire la respiration non-mitochondrial (mesure 10-12) de la respiration ATP liée (mesure 4). NOTE: Proton fuite = respiration ATP lié - non-mitochondriesl respiration = Taux ④ - Taux ⑩ ~ ⑫. </li></ol>

<ol><li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+mitochondrial+clustering+creates+an+oxidant-rich+nuclear+domain+required+for+hypoxia-induced+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription.</a> Sci Signal. 5, ra47(2012).</li>
<li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCa2%2B%5Di+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).</li>
<li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55(2011).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).</li>
<li>Doll, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+crisis+in+cerebrovascular+endothelial+cells+opens+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier.</a> Stroke. 46, 1681-1689 (2015).</li>
<li>Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Blood-Brain+Barrier+Damage+in+Stroke%3A+Mitochondrial+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinfect+Dis%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism.</a> J Neuroinfect Dis. S2, e002(2015).</li>
<li>Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ROS+in+BBB+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of ROS in BBB dysfunction.</a> Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).</li>
<li>Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tert-butylhydroquinone+compromises+survival+in+murine+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke.</a> Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).</li>
<li>Modis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bioenergetics+is+regulated+by+PARP1+under+resting+conditions+and+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress.</a> Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).</li>
<li>Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+protein+expression+and+barrier+properties+of+immortalized+mouse+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells.</a> Brain Res. 1130, 17-30 (2007).</li>
<li>Bukeirat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+regulates+blood-brain+barrier+permeability+and+mitochondrial+function+by+targeting+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Impairment+in+Cerebrovascular+Endothelial+Cells+is+Involved+in+the+Correlation+between+Body+Temperature+and+Stroke+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity.</a> Aging Dis. 7, 14-27 (2016).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+large+apparent+work+capability+of+the+blood-brain+barrier%3A+a+study+of+the+mitochondrial+content+of+capillary+endothelial+cells+in+brain+and+other+tissues+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.</a> Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li>
<li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells%3A+A+role+for+mitoBKCa+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li>
<li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350(2015).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts potentiel en ce qui concerne la recherche, la paternité et/ou la publication de cet article. Les frais d’accès ouvert pour cet article ont été fournis par Agilent Technologies.

Ce protocole représente un procédé d&#39;évaluation du phénotype bioénergétique dans les cellules endothéliales vasculaires cérébraux. Il sert de test de base pour l&#39;évaluation des mitochondries des cellules endothéliales, et il est optimal pour des expériences conçues pour étudier les mécanismes de stimuli qui peuvent influer sur la voie de signalisation mitochondriale dans les cellules CVE. Elle fournit également un procédé de test d&#39;agents thérapeutiques potentiels pour des maladies BBB perturbations associées. Étapes critiques dans le Protocole bioanalyzers flux extracellulaires ont la capacité de mesurer OCR en temps réel. Dans cet essai, l&#39;identification de la densité de cellules appropriée est critique. Si la densité cellulaire est inférieure à 8 × 10 3 cellules par puits, l&#39;OCR basale est trop faible pour être analysés (Figure 2 et Figure 3); si la densité des cellules est supérieure à 32 x 10 3 cellules par puits, les cellules ne répondent pas à l&#39; oligomycine ou FCCP Treatments (figure 2 et figure 3). La densité cellulaire optimale pour cette lignée cellulaire dans notre modèle expérimental est de 16 × 10 3 cellules par puits, ce qui démontre des résultats reproductibles et la sensibilité aux stimuli 7 et traitements 10,14. Si un Bioanalyseur 24 puits est utilisé, les nouveaux titrages de la densité cellulaire seraient nécessaires pour le dosage. Il est établi que CVEs ont un grand volume de mitochondries par rapport aux autres cellules endothéliales ou des types de tissus 15,16, ce qui suggère la nécessité d&#39; une plus grande production d&#39;énergie et moins de cellules pour mesurer le métabolisme bioénergétique. Nous avons testé plusieurs types de cellules endotheliales du cerveau, telles que la première et immortalisé des cellules endothéliales vasculaires cérébraux de souris immortalisée 7 et les cellules endothéliales vasculaires cérébrales humaines (données non publiées). Ces cellules doivent densités cellulaires similaires pour atteindre l&#39;OCR acceptable (respiration basale OCR dans les 40-160 pmol / min pourdes plaques à 96 puits et 50-400 pmol / min pour des plaques à 24 puits) lorsque le test a été effectué bioénergétique. Kaczara et al. Rapporté mesurer le métabolisme bioénergétique dans la veine des cellules endothéliales ombilicales humaines (HUVEC), qui a utilisé une densité cellulaire plus élevée 17. Notre groupe n&#39;a pas évalué les cellules des vaisseaux provenant d&#39;autres tissus ou d&#39;organes. Théoriquement, le Bioanalyseur pourrait être utilisé sur tout type de cellule, mais il nécessite l&#39;optimisation de l&#39;essai pour la densité cellulaire, le milieu de culture cellulaire, et les conditions de culture (certaines cellules spécifiques peuvent nécessiter des plaques revêtues pour bien grandir). Il est nécessaire que les expériences sont effectuées pour s&#39;assurer que le taux d&#39;OCR se situe dans la plage acceptable. Si l&#39;OCR dans les cellules endothéliales des autres organes est inférieur à CVEs de cerveaux, l&#39;augmentation de la densité cellulaire peut aider à obtenir dans une plage OCR acceptable. Par ailleurs, si les cellules ne sont pas utilisent la phosphorylation oxydative comme leur principale source d&#39;énergie, l&#39;Bioanalyseur ne serait pas un optimal essai. Bioanalyseur permet l&#39;interruption séquentielle de la chaîne de transport d&#39;électrons, en fonction de l&#39;ordre dans lequel les réactifs sont appliqués. Tout d&#39;abord, oligomycine est appliqué, ce qui inhibe mitochondrial complexe V (ATP synthase). En second lieu, FCCP, un découpleur d&#39;électrons, est appliqué, ce qui conduit à la rupture du gradient de proton. Enfin, la roténone et antimycine A, qui inhibent mitochondrial Complexes I et III, respectivement, sont appliquées à conduire à une inhibition totale du flux d&#39;électrons. L&#39;ordre de l&#39;exposition au médicament est essentiel parce que les médicaments bloquent la réaction spécifique de la chaîne de transport d&#39;électrons, et les changements séquentiels peut être mesurée afin de refléter la fonction mitochondriale. Modifications et dépannage Afin d&#39;évaluer la réponse à des stimuli mitochondriale dans les cellules CVE, il est recommandé que les stimuli sont appliqués à des cellules après que les cellules adhèrent au fond de la plaque de culture cellulaire (voir la chronologiereprésenté sur la figure 1; il faut habituellement au moins 6 h). Pour obtenir des résultats reproductibles par des traitements, il est extrêmement important de maintenir la densité cellulaire compatible. Si prétraitements sont conçus avant l&#39;ensemencement des cellules, la densité cellulaire pour chaque pré-traitement doit être soigneusement mesuré, à l&#39;exclusion des cellules mortes pour l&#39;ensemencement. Si transfection est inclus dans le plan expérimental, reportez-vous au protocole de transfection du fabricant. Démontrée dans les données présentées dans la figure 4, miR-34a a été transfecté dans les cellules CVE en utilisant un kit lipofectamine de transfection, ce qui nécessite un milieu de culture cellulaire exempt d&#39;antibiotiques et un test mito-stress pour évaluer les changements dans la fonction métabolique avec surexpression de miR-34a . Les doses de plasmide peuvent également être optimisés, comme précédemment publiée 13. Un autre changement qui peut être fait pour le protocole est en train de changer les concentrations des réactifs. Une courbe de titrage de l&#39;oligomycine, FCCP, et / ou la roténone et antimycine A peut être completed. En outre, si ce test est utilisé pour un débit élevé des analyses de divers médicaments, il est suggéré d&#39;inclure un essai parallèle pour mesurer la viabilité cellulaire et la prolifération cellulaire, qui a été décrit dans nos publications antérieures 7,13. Les valeurs OCR sont affectés de façon significative par le nombre de cellules (figures 2 et 3), ainsi que les essais de prolifération cellulaire et de viabilité profitent à la normalisation des données. Cependant, la réalisation de ces essais sont à la discrétion de chaque laboratoire. Limites de la technique La principale limite de ce protocole est que nous avons seulement utilisé un modèle in vitro de culture cellulaire dans l&#39;étude. À l&#39; heure actuelle, il n&#39;y a pas d&#39; anciens modèles disponibles in vivo ou des modèles animaux qui peuvent répondre à des cellules endothéliales de la fonction mitochondriale. De nouveaux modèles devraient être mis au point pour l&#39;évaluation de la fonction bioénergétique in vivo et <em&gt; ex vivo dans des études futures. Une autre limitation est l&#39;extension des évaluations de la barrière à la suite des mesures bioénergétiques. Les expériences ne peuvent être exécutées parce que, d&#39;abord, après l&#39;achèvement des mesures bioénergétiques, la viabilité cellulaire est diminuée après la rupture complète de la chaîne de transport d&#39;électrons; deuxièmement, des plaques et des inserts de culture cellulaire spécifiques sont nécessaires pour détecter les valeurs bioénergétiques et ne correspondent pas à des inserts pour les évaluations de barrière. Par conséquent, il n&#39;y a pas beaucoup de tests fonctionnels qui peuvent être complétés après le test bioénergétique. Cependant, il est prévu que des dispositifs spéciaux peuvent être développés pour effectuer des tests fonctionnels avant le dosage bioénergétique. Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives Les techniques antérieures pour évaluer la fonction mitochondriale ont nécessité l&#39;isolement des mitochondries des cellules 18. Ce netechnique w utilisant le Bioanalyseur permet de mesurer l&#39;activité mitochondriale dans des cellules intactes, qui conserve plus de l&#39;environnement cellulaire que d&#39;évaluer les mitochondries isolées. Applications futures ou les directions après la maîtrise de cette technique Ce protocole a été conçu et développé pour la lignée cellulaire bEnd.3, mais il est également compatible avec endothéliales vasculaires cérébrales primaires (PCVE) 7 cellules ou autres endothélium, et nous avons démontré dans notre publication précédente en utilisant des cellules PCVE 7. Lorsque d&#39;autres types d&#39;endothélium sont utilisés, le revêtement de la plaque de culture et l&#39;utilisation de facteurs de croissance peuvent être nécessaires. Toutefois, l&#39;analyse de titrage est recommandée pour les autres types cellulaires aussi bien. Ce protocole offre une méthode générale à adopter dans l&#39;évaluation de la bioénergétique de cellules CVE, et il peut en outre être appliquée à des études de mécanisme ou de réponses thérapeutiques de cette manière.

Il est largement reconnu que le sang-cerveau-barrière (BBB) ​​formé par endothéliales vasculaire cérébral (CVE), les cellules a des fonctions très distinctes et uniques primordiaux à la biologie vasculaire. Ces cellules endotheliales utilisent mitochondries pour générer la majeure partie de l&#39;approvisionnement cellulaire de l&#39;adénosine triphosphate (ATP) comme source d&#39;énergie chimique. En plus de fournir de l&#39; ATP pour les cellules CVE, les mitochondries régulent divers processus cellulaires dans les cellules endothéliales vasculaires, telles que les cellules de signalisation 4/1, de l&#39; apoptose 5, et le contrôle du cycle cellulaire et la croissance cellulaire 6. De dysrégulation de la fonction de bio - énergétique mitochondrial dans des cellules CVE peut affecter la biogenèse mitochondriale, ce qui conduit à l&#39; activité de l&#39; endothélium vasculaire avec facultés affaiblies, et exacerber les maladies cérébro - vasculaires et les maladies neurodégénératives, par exemple, accident vasculaire cérébral 7,8 et la maladie d&#39;Alzheimer (AD) 9. Nous avons démontré que les propos injurieux à cellules CVE après une exposition à lipopolysaccharide (LPS) altère la fonction mitochondriale dans les cellules CVE et aggraver AVC résultats 7. Tert-butylhydroquinone (tBHQ) augmente la mortalité par AVC en interférant avec la phosphorylation oxydative dans les cellules CVE 10. Par conséquent, le modèle quantitatif de la fonction bioénergétique dans les cellules CVE non seulement les pilotes d&#39;une série d&#39;études relatives mécanisme-pour le système nerveux central (SNC), mais fournit également une percée dans le dépistage des drogues de thérapies ciblant la fonction mitochondriale en biologie vasculaire. mitochondries isolées ont été utilisées pour mesurer la fonction bioénergétique. Nous 7 et d&#39; autres 11 ont rapporté des évaluations de bioénergétique cellulaire dans les cellules intactes CVE en utilisant un Bioanalyseur flux extracellulaire. L&#39;analyseur offre l&#39;avantage de l&#39;évaluation bioénergétique cellulaire endogène. Cet essai sensible et cohérente mesure le métabolisme mitochondrial des cellules EVF et peut être utilisé pour évaluer la dépréciation bioénergétique par stimuli, enquêter sur les mécanismes de voies de signalisation mitochondriales, et le dépistage des drogues ou des traitements qui affectent la fonction mitochondriale dans les cellules CVE. Le taux de consommation d&#39;oxygène (OCR) est enregistrée par le Bioanalyseur en utilisant une approche de profilage pharmacologique en combinant l&#39;utilisation de quatre dérégulateurs mitochondriales: oligomycine, carbonyl cyanide-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), roténone et antimycine A. Dans ce protocole, nous détaillons une approche optimisée qui permet la mesure et le calcul des paramètres fonctionnels mitochondriales dans les cellules de CVE, y compris la respiration basale mitochondrial, la production d&#39;ATP, fuite de protons, la respiration maximale et la capacité respiratoire de secours, dans un seul essai.

<table><tbody><tr><td>bEnd.3 lignée cellulaire</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>25 - 30 passages</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>10 % concentration finale</td></tr><tr><td>Pénicilline/Steptomycine</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>1&fois ; 100 stockant</td></tr><tr><td>0,25 % de trypsine, 0,03 % de solution EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td>1.0 &micro ; Concentration finale</td></tr><tr><td>M Glucose</td><td>Sigma</td><td>CAS 50-99-7</td><td>25 mM concentration finale</td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>1.0 &micro ; M concentration finale</td></tr><tr><td>Carbonilcyanure 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>0,5 &micro ; Concentration finale M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>1.0 & micro ; Concentration finale M</td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma</td><td>CAS 1397-94-0</td><td>1.0 & micro ; M concentration finale</td></tr><tr><td>Station de lavage de plaques</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flux extracellulaire bioanayzer&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire de flux extracellulaire</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Cartouche de capteur de flux extracellulaire</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’étalonnage de flux extracellulaire</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Support d’essai de flux extracellulaire</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102365-100</td><td>PH tamponné avant le dosage</td></tr></tbody></table>

Évaluation de la fonction bioénergétique dans les cellules endothéliales vasculaires cérébraux

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

L&#39;intégrité du sang-cerveau-barrière (BBB) ​​est essentielle pour prévenir les lésions cérébrales. endothélial vasculaire cérébral (CVE), les cellules sont l&#39;un des types de cellules qui composent la BBB; ces cellules ont une demande très haute énergie, ce qui nécessite la fonction mitochondriale optimale. Dans le cas d&#39;une maladie ou d&#39;une blessure, la fonction mitochondriale dans ces cellules peuvent être modifiées, entraînant la maladie ou l&#39;ouverture de la BHE. Dans ce manuscrit, nous introduisons une méthode pour mesurer la fonction mitochondriale dans les cellules CVE en utilisant des cellules intactes, entières et un Bioanalyseur. Un essai mito-stress est utilisé pour contester les cellules qui ont été perturbés, physiquement ou chimiquement, et d&#39;évaluer leur fonction bioénergétique. En outre, cette méthode fournit également un moyen utile pour dépister de nouveaux traitements qui ont des effets directs sur la fonction mitochondriale. Nous avons optimisé la densité cellulaire nécessaire pour obtenir des taux de consommation d&#39;oxygène qui permettent le calcul d&#39;une variété de para mitochondrialemètres, y compris la production d&#39;ATP, la respiration maximale et la capacité de réserve. Nous montrons aussi la sensibilité de l&#39;essai en démontrant que l&#39;introduction du micro-ARN miR-34a, conduit à une diminution prononcée détectable et l&#39;activité mitochondriale. Bien que les données présentées dans le présent document est optimisé pour la lignée cellulaire bEnd.3, nous avons également optimisé le protocole pour les cellules CVE primaires, ce qui suggère davantage l&#39;utilité dans des modèles précliniques et cliniques.

Pour évaluer la fonction bioénergétique de cellules CVE en réponse au stress oxydatif, nous avons choisi le cerveau microvasculaire lignée cellulaire endothélium murin bEnd.3, qui affiche les mêmes caractéristiques de barrière comparatifs microvasculaires du cerveau primaire des cellules endothéliales 12. Étant donné que la cinétique et l&#39;intensité relative de la réponse varient entre les différents types de cellules, la première série d&#39;expériences a été conçue pour obtenir des niveaux mesurables de ROC en identifiant le nombre optimal de cellules bEnd.3 à utiliser dans le dosage pour le profilage métabolique, représenté sur la Figure 2. Suite à l&#39;évaluation, les données sont quantifiés et présentés à la figure 3. respiration basale, la respiration maximale et la capacité respiratoire de secours a montré une réponse proportionnelle à la densité cellulaire. Cependant, la production d&#39; ATP diminue lorsque 64 × 10 3 cellules par puits ont été sélectionnés, ce qui suggère que la culture sur-confluentes cellulaire estne convient pas pour cette expérience. Les densités cellulaires optimales se produisent entre 8-32 × 10 3 cellules par puits, en fonction de la réponse aux perturbateurs mitochondriales. Pour les expériences ultérieures, une densité d&#39;ensemencement de 16 × 10 3 cellules par puits a été utilisé pour permettre une détection optimale des changements dans l&#39; OCR. Utilisation de 16 × 10 3 cellules par puits, nous avons observé les réponses attendues en OCR et démontré que le microARN miR-34a réduit la fonction mitochondriale dans les cellules de CVE (Figure 4). Nous avons précédemment rapporté que miR-34a a réduit la phosphorylation oxydative dans ces cellules 13. Les expériences répétées ont également montré que la respiration maximale et la capacité de réserve ont été diminué de façon significative par la surexpression de miR-34a dans CVEs à 24 h post-transfection, même si la respiration basale, la production d&#39; ATP, et fuite de protons avait aucun changement significatif (Figure 4) . Ces donnéesdémontrer la sensibilité du Bioanalyseur pour détecter les changements dans la fonction mitochondriale dans CVEs. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> Figure 1. Planification stratégique pour l&#39;expérience. Le calendrier de la cellule, la plaque, et la préparation de la cartouche est indiquée. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> Figure 2. Représentant des données brutes de la fonction bioénergétique dans les cellules CVE avec différentes densités cellulaires. Les taux de consommation d&#39;oxygène ont été mesurés dans les cellules CVE avec différentes densités cellulaires. Les données représentent la moyenne ± écart-type (n = 5); OCR: Oxygène Taux de consommation; FCCP: carbonyl cyanide-4- (trifluorométhoxy) phénylhydrazone;<html> Rot / Anti-A: roténone et antimycine A. ①, ② et ③ indiquent la respiration basale; ④, ⑤, ⑥ et indiquer l&#39;ATP lié respiration; ⑦, ⑧ et ⑨ indiquer la respiration maximale; ⑩, ⑪ et ⑫ indiquer la respiration non-mitochondrial. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> Figure 3. Les résultats représentatifs de la fonction bioénergétique dans les cellules CVE avec différentes densités cellulaires. Respiration basale, la production d&#39; ATP, la respiration maximale et la capacité de secours sont calculées à partir des données brutes générées par la bioénergétique analyse fonctionnelle de la figure 2 en utilisant les formules indiquées dans la section 4 . Les données représentent moyenne ± écart type (n = 5); OCR: Oxygène Taux de consommation.<html> f = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> Figure 4: Résultats représentatifs de la fonction bioénergétique Diminué par miR-34a (A) Les données brutes de mitochondrial Fonction suivante surexpression de miR-34a à 24 h post-transfection.. (B) de la respiration basale, la production d&#39; ATP, la respiration maximale et la capacité de réserve sont calculées à partir des données brutes générées par les bioénergétique d&#39;analyse fonctionnelle de la figure 4A; les paramètres sont calculés selon les formules indiquées dans la section 4. La surexpression de miR-34a réduit la fonction mitochondriale dans les cellules de CVE à 24 h post-transfection. Les données représentent la moyenne ± écart-type (n = 5); OCR: Oxygène Taux de consommation. **** P &lt;0,0001.fichiers / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> Tableau 1. Le Protocole Run Instrument.

mitochondries des cellules endothéliales sont critiques pour maintenir l&#39;intégrité hémato-encéphalique barrière. Nous introduisons un protocole pour mesurer la fonction bioénergétique dans les cellules endothéliales vasculaires cérébraux.

Évaluation de la Fonction bioénergétique dans les cellules endothéliales vasculaires cérébraux

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Les objectifs généraux de cette procédure sont d'évaluer comment les altérations de la fonction mitochondriale affectent le développement des troubles neurologiques et de concevoir des thérapeutiques ayant un effet direct sur l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des troubles neurologiques, telles que : comment minimiser la mort cellulaire neuronale après un accident vasculaire cérébral ? Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une évaluation en temps réel de la fonction mitochondriale dans des cellules entières intactes.Après avoir cultivé les cellules endothéliales vasculaires cérébrales dans un milieu complet, dans un flacon de culture de 75 cm², à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu'à une confluence de 80 %, jeter le milieu de culture cellulaire et rincer les cellules avec de la trypsine-EDTA. Ajouter ensuite un à deux millilitres de trypsine-EDTA fraîche dans le flacon et détacher les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Après avoir confirmé au microscope inversé que les cellules se sont détachées, arrêter la réaction par l'ajout doux de 10 millilitres de milieu cellulaire complet frais et transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres pour centrifugation.Jetez le surnageant et lavez le culot avec 10 millilitres de milieu de croissance complet frais pour une autre centrifugation. Ensuite, resuspendez le culot dans le milieu de croissance complet à une concentration de deux fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre pour la sous-culture. Après le nombre approprié de sous-cultures, semez 1,6 fois 10 à la puissance quatre cellules dans 80 microlitres de milieu complet par puits, dans une plaque de culture cellulaire à flux extracellulaire à 96 puits, puis placez la plaque dans une étuve à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Lorsque les cellules se sont fixées sur la plaque, ajouter le traitement d'intérêt aux puits appropriés et replacer les cellules dans l'incubateur. La veille du test d'évaluation de la fonction mitochondriale, hydrater une cartouche de capteur à flux extracellulaire avec 150 microlitres de solution calibrante pour flux extracellulaire et incuber la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone. Le lendemain matin, utiliser la station de lavage de plaques pour remplacer le milieu de culture cellulaire par un milieu d'essai de flux extracellulaire de pH 7,0.Ensuite, incuber les cellules à 37 degrés Celsius, sans dioxyde de carbone, pendant 30 à 60 minutes. Une fois que les cellules sont équilibrées, insérez la cartouche hydratée dans le Bioanalyzer et cliquez sur le bouton Démarrer pour lancer l'étalonnage. À la fin de l'étalonnage, cliquez sur l'invite Déverrouiller la cartouche pour retirer la plaque inférieure de la cartouche et charger la plaque de cellules.Ensuite, ouvrez le fichier de données pour obtenir les valeurs de débit provenant du Bioanalyzer afin de les exporter vers le fichier de feuille de calcul. Étant donné que la cinétique et l'intensité relative des réponses varient selon les différents types de cellules endothéliales vasculaires cérébrales, une série de concentrations de cellules bEnd.3 a été utilisée dans ces expériences afin d'identifier le nombre optimal de cellules pour mesurer les niveaux de débit de consommation d'oxygène dans un dosage de profilage métabolique.Comme observé, les respirations basale et maximale ainsi que la capacité respiratoire de réserve montrent une réponse proportionnelle à la densité cellulaire. La production d'ATP, en revanche, diminue lorsque la concentration la plus élevée de cellules par puits est utilisée, ce qui suggère qu'une culture cellulaire sure-confluente n'est pas adaptée à l'expérience. Les densités cellulaires optimales semblent se situer dans la gamme intermédiaire du nombre de cellules par puits.Par conséquent, les niveaux attendus de consommation d'oxygène ont été évalués lors de cette expérience représentative en utilisant une concentration cellulaire intermédiaire, démontrant que les ARNm précurseurs non codants réduisent la fonction mitochondriale dans les cellules endothéliales vasculaires cérébrales. Ces expériences montrent également que la respiration maximale et la capacité de réserve sont significativement diminuées par la surexpression de ces molécules dans les cellules endothéliales vasculaires cérébrales à 24 heures post-transfection, même si la respiration basale, la production d'ATP et les fuites de protons n'affichent aucun changement significatif. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours.De la mise en place des cellules jusqu'à l'évaluation de la fonction mitochondriale, cette procédure peut être réalisée correctement. Lors de sa mise en œuvre, il est essentiel de garder à l'esprit que la détermination de la densité cellulaire optimale est extrêmement importante avant d'entamer toute autre manipulation. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que des tests de viabilité cellulaire ou des dosages glycolytiques, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur les modifications de la fonction mitochondriale résultant d'une diminution de la viabilité cellulaire ou de changements dans d'autres voies métaboliques.Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la fonction mitochondriale, leur permettant d'utiliser des cellules intactes plutôt que des mitochondries isolées pour étudier diverses maladies, notamment les maladies neurologiques, le cancer ou les troubles métaboliques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer la fonction mitochondriale dans les cellules endothéliales vasculaires cérébrales.

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Cette méthode décrit comment isoler et d'immortaliser les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de souris. Nous décrivons un protocole étape par étape à partir de l'homogénéisation du tissu cérébral, phases de digestion, l'ensemencement et l'immortalisation des cellules. Habituellement, cela prend environ cinq semaines pour obtenir un ensemble homogène, immortalisé ligne de cellules endothéliales microvasculaires.

Génération d&#39;une ligne Immortalisé microvasculaire murin des cellules endothéliales du cerveau comme un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle barrière hémato-encéphalique

Cette vidéo démontre l’évaluation du fonctionnement mitochondrial des cellules endothéliales vasculaires cérébrales (CVE) à l’aide d’un test de flux extracellulaire. Les cellules CVE sont plaquées dans une plaque de culture cellulaire à flux extracellulaire. Les capteurs de flux extracellulaire sont hydratés avant d’être chargés et étalonnés dans le bioanalyseur. La plaque contenant les cellules est ensuite chargée pour analyse.

Évaluation de la fonction mitochondriale dans les cellules endothéliales vasculaires cérébrales

La dysfonction endothéliale est associée à de nombreux états pathologiques et est un facteur prédictif d'événements cardiovasculaires indésirables chez les humains. Vasodilatation médiée par le flux (FMD) est une méthode à ultrasons non-invasive d'évaluation de la fonction endothéliale. Les choix méthodologiques et l'expérience de l'opérateur peuvent affecter les résultats. Une approche systématique de la fièvre aphteuse dans les études humaines est abordée ici.

Évaluation échographique de l&#39;endothélium-dépendante médiée par le flux vasodilatation de l&#39;artère brachiale en recherche clinique

Les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) sont interconnectées par des protéines jonctionnelles spécifiques formant une barrière hautement régulée séparant le sang et le système nerveux central (SNC), ce que l’on appelle la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’isolement des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales primaires murines, comme nous l’avons vu dans ce protocole, permet des études in vitro détaillées de la BHE.

Isolement de cellules primaires murins cerveau endothéliales microvasculaires

Le présent article décrit les considérations méthodologiques pour plusieurs évaluations non invasives de la fonction vasculaire et de la morphologie qui sont couramment utilisées dans la recherche médicale pour évaluer les différents stades de l’athérosclérose.

Une approche méthodologique pour les évaluations non invasifs de la fonction vasculaire et de morphologie

Nous décrivons un test biologique simple, basée sur des cellules pour la détection, la quantification et le suivi de l'activité des membres de la famille du facteur de croissance endothélial vasculaire des ligands. L'essai utilise des récepteurs chimères exprimés dans une lignée cellulaire dépendant du facteur de fournir une évaluation semi-quantitative ou quantitative de la liaison au récepteur et la réticulation par le ligand.

Un bioessai simple pour l&#39;évaluation des facteurs de croissance endothélial vasculaire

Montré ici sont des protocoles d’isolement (1) fraîchement endothélium cérébrales intacts « tubes » et des mesures (2) simultanées de calcium endothéliale et potentiel durant l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium de membrane. En outre, ces méthodes permettent d’avoir écouté pharmacologique du calcium des cellules endothéliales et signalisation électrique comme variables expérimentales individuels ou interactives.

Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Nous présentons trois essais in vitro simples -l'analyse de migration à longue distance, l'analyse de migration de co-culture, et l'analyse de chimio-attraction--qui évaluent collectivement les fonctions des cellules souches humaines dérivées des cellules périventriculaires endothéliales et de leur interaction avec les interneurons GABAergic.

Migrations, Chemo-Attraction et Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons (en anglais)

La préparation intensive de « tubes » endothéliaux cérébraux intacts de souris à partir d’artérioles parenchymateuses cérébrales est illustrée pour étudier la régulation du flux sanguin cérébral. De plus, nous démontrons les forces expérimentales de ce modèle d’étude endothéliale pour l’imagerie par fluorescence et la mesure électrophysiologique des principales voies de signalisation cellulaire, y compris les changements dans le potentiel intracellulaire [Ca2+] et membranaire.

Isolement et analyse fonctionnelle de l’endothélium artériolaire du parenchyme cérébral de souris

Ce protocole décrit un modèle in vitro fiable et efficace de la barrière hémato-encéphalique. La méthode utilise des cellules endothéliales vasculaires cérébrales de souris bEnd.3 et mesure la résistance électrique transmembranaire.

Enregistrement de l’intégrité fonctionnelle de la barrière sur les cellules endothéliales vasculaires bEnd.3 via la détection de résistance électrique transendothéliale

Nous démontrons ici la technique d’utilisation de biocapteurs basés sur l’impédance : ECIS et cellZscope, pour mesurer la force de la barrière endothéliale cérébrale. Nous détaillons la préparation et la technique d’ajout de divers stimuli à un modèle in vitro de l’endothélium cérébral. Nous mesurons, enregistrons et donnons une analyse représentative des résultats.

Mesure des changements dans l’intégrité de la barrière endothéliale cérébrale à l’aide de deux biocapteurs basés sur l’impédance en réponse aux cellules cancéreuses et aux cytokines

Découvrez l'évaluation de la fonction mitochondriale dans les cellules endothéliales vasculaires cérébrales pour étudier les troubles neurologiques. Cette méthode permet d'analyser en temps réel l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique.

Évaluation de la Fonction bioénergétique dans les cellules endothéliales vasculaires cérébraux

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