Name: בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: למדו פרוטוקול לבידול מהיר של תאי גזע pluripotent מושרי אדם לנוירונים קורטיקליים מעוררים באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרודה. שיטה זו מאפשרת מדידת פעילות רשתית לחקר מנגנונים נוירוביולוגיים ומחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לג'סיקה קלאסן על ביצוע ניסויי מהדק התיקון של התא השלם. ה-hiPSCs ששימשו בניסויים שלנו סופקו באדיבות על ידי Huiqing Zhou ו-Willem van den Akker מאוניברסיטת Radboud Nijmegen. וקטורי ההעברה המשמשים בפרוטוקול זה סופקו באדיבות על ידי אוליבר ברוסטל, פיליפ קוך וג'וליה לדוויג מהמרכז הרפואי של אוניברסיטת בון.

<ol><li>Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+human+disease+using+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Studying human disease using human neurons.</a> Brain Res. , (2016).</li>
<li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li>
<li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+and+functional+analyses+reveal+neuronal+subtype+differentiation+bias+in+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).</li>
<li>Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+neural+development+from+human+embryonic+stem+cells%3A+accelerated+synaptic+activity+via+astrocyte+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture.</a> J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).</li>
<li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+electrophysiological+activity+and+pharmacological+response+of+a+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neuron+and+astrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).</li>
<li>Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+maturation+and+drug+responses+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture.</a> Sci Rep. 6, 26181(2016).</li>
<li>Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Responses+and+Spontaneous+Activity+of+Human+iPS-Derived+Neuronal+Networks+Characterized+for+3-month+Culture+with+4096-Electrode+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays.</a> Front Neurosci. 10, (2016).</li>
<li>Heikkila, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neuronal+cells+form+spontaneously+active+neuronal+networks+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro.</a> Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).</li>
<li>Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-program+approach+for+simulating+recorded+extracellular+signals+generated+by+neurons+coupled+to+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocomputing%22%5BJournal%5D)">Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays.</a> Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).</li>
<li>Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tinturé, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+of+microchannel-enabled+neuron-electrode+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces.</a> J Neural Eng. 9 (2), (2012).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J. Vis. Exp. (71), e50079(2013).</li>
<li>Pacifici, M., Peruzzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+embryonic+neural+cells%3A+a+quick+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol.</a> J Vis Exp. (63), e3965(2012).</li>
<li>Ba, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARHGAP12+functions+as+a+developmental+brake+on+excitatory+synapse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function.</a> Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).</li>
<li>Bologna, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+neuronal+activity+by+SPYCODE+multi-channel+data+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Netw%22%5BJournal%5D)">Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer.</a> Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).</li>
<li>Ba, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIO+loss+of+function+is+associated+with+mild+intellectual+disability+and+affects+dendritic+branching+and+synapse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function.</a> Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).</li>
<li>Benevento, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+by+the+Kleefstra+syndrome+protein+EHMT1+mediates+homeostatic+synaptic+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling.</a> Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).</li>
<li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li>
<li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures%3A+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Sci Rep. 4, 5489(2014).</li>
<li>Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacing+3D+engineered+neuronal+cultures+to+micro-electrode+arrays%3A+an+innovative+in+vitro+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model.</a> J Vis Exp. (104), e53080(2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הנה יישמנו פרוטוקול בידול-hiPSC יעיל בהוצאת ג&#39;אנג et al. (2013) 12 למדידת פעילות הרשת של רשתות נוירונים הנגזרות hiPSC על MEAs. התאמנו הפרוטוקול המקורי על ידי יצירת קו hiPSC -positive rtTA / Ngn2 לפני גרימת והבחנה עצבית. צעד נוסף זה מאפשר לנו לשלוט על צפיפות תאים העצבית על MEA. שליטה על הצפיפות העצבית הייתה תנאי מוקדם חשוב להתאמת פרוטוקול MEAs ולהבטחת עקביות. כדי למדוד את הפעילות של רשתות נוירונים באמצעות MEAs, הנוירונים צריכים ליצור רשתות צפופות ישירות על גבי האלקטרודות MEA 17,18. זה בהכרח מחייב פיקוח הדוק על צפיפות הציפוי של נוירונים. שורת hiPSC rtTA / Ngn2 -positive מאפשרת שליטה של צפיפות נוירון כי טקטיקה זו אינה מסתמכת על transductions lentiviral החריף של hiPSCs לפני הבידול;הקו -positive hiPSC rtTA / Ngn2 ולכן כמעט מבטלת כל וריאציה התשואה הסופית עקב, למשל, רעילות lentiviral ויעילות זיהום משתנה. עוד שלב קריטי של הליך הניסוי הוא מספר האסטרוציטים עכברוש כי הם cocultured עם hiPSCs הבחנה. האסטרוציטים פעילים לתרום העידון לפתח מעגלים עצביים על ידי שליטת סינפסה היווצרות, תחזוקה, וביטול, כל אלה הם תהליכים חשובים לתפקוד עצבי. הפרוטוקול המובא במאמר זה הוא מאוד astrocyte תלוי: מלא בוגרת ויוצרי סינפסות תפקודית, הנוירונים מחייבים תמיכה מן האסטרוציטים. חווינו שמספר האסטרוציטים צריך להיות פחות או יותר שווה למספר הנוירונים הנגזרות hiPSC לתמוך ההבשלה של נוירונים לבין היווצרות של רשתות נוירונים מפגין פעילות ספונטנית. בשל כך שהתשואות פרוטוקול astrocyte שלנו מבוי סתום תא ראשוניטורס עם תוחלת חיים מוגבלת, בידודה של האסטרוציטים עכברוש צריך להתבצע על בסיס קבוע. ההסתגלות שלנו של הפרוטוקול בהוצאת ג&#39;אנג et al. (2013) 12 לשימוש עם טכנולוגיית MEA צפויה לשפר משמעותית את יכולתנו לחקור את פעילות הרשת של רשתות נגזרות hiPSC. בעבר, פרוטוקולים המשמשים ללימוד רשתות נוירונים נגזרות hiPSC עם MEAs הסתמכו על נהלי בידול גוזל זמן 13-16. פרוטוקול מאל et ג&#39;אנג. (2013) מספק אלטרנטיבה מהירה, והשינוי שלנו מסיר מקור ההשתנות, מה שהופך את זה עכשיו יותר ריאלי להשתמש נוירונים נגזרים hiPSC בשילוב עם טכנולוגית MEA, במיוחד תפוקה גבוהה או מחקרים פרמקולוגיים. בנוסף, כיוון שאמצעי בהוצאת ג&#39;אנג et al. (2013) 12 מניב אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים בקליפת המוח העליון שכבתי, הפרוטוקול המותאם שלנו עושה מחקרים ממוקדים ההאפשר לתוך הרשתctivity של משנה העצבית המסוים הזה. עם זאת, גישה זו יש גם כמה מגבלות. ראשית, את ההומוגניות של התרבויות יכולה להיחשב גם חסרון, כי התרבויות נוטות פחות להידמות ברשתות vivo, שבו סוגים שונים של נוירונים (כלומר נוירונים מעכבים ו מעוררים) מהווים רשת הטרוגנית. כדי לשפר עוד יותר את השימוש של נוירונים נגזרים hiPSC עם טכנולוגית MEA, זה יהיה חשוב לפתח פרוטוקולי בידול מהירים (transgene המבוסס) עבור אוכלוסיות תאים עצביות אחרות. אם הפרוטוקולים מתפרסמים, הרשתות במבחנה היו לחקות ברשתות vivo הדוקות יותר. שנית, האסטרוציטים עכברוש נוכחיים יש להוסיף לתאי עצב hiPSC הנגזר לתמיכה בצמיחה, ולכן הרשת העצבית וכתוצאה מכך אינה במובן סנסו רשת עצבי אנושי. פרוטוקולים אמין להבחנה hiPSCs לתוך האסטרוציטים מאי סול בעתידve זו בעיה 26. שלישית, דו מימדי רשתות נוירונים, כפי שמתואר כאן, הם מודל מוגבל ללימוד מורכבות תלת ממדי in vivo רשתות נוירונים. למרבה המזל, פרוטוקולים המתאר תלת מימדי תרבויות של נוירונים העיקרי עכברוש בשילוב עם הטכנולוגיה MEA כבר זמינים 27,28. מכאן ולהבא, השילוב של פרוטוקולי בידול מהירים לקבלת נוירונים hiPSC נגזרות האסטרוציטים עם טכניקות תרבות תלת ממדים וטכנולוגיית MEA אמור לספק תובנה רומן לתוך הפרעות נוירולוגיות בסיסיות מנגנונים ביולוגיים.

התפתחות תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) פרוטוקולי בידול לייצר נוירונים אדם במבחנה ספק כלי חדש רב עצמה לחקר הפרעות נוירולוגיות. עד לאחרונה, המחקר של הפרעות אלה הכביד קשות על ידי היעדר מערכות מודל באמצעות נוירונים אדם. למרות שניתן להשתמש בהם מכרסמים ללמוד הפרעות נוירולוגיות, התוצאות של מחקרים כאלה לא יכול להיות מתורגם בקלות לבני אדם 1. ההגבלות שניתנו, נוירונים הנגזרות hiPSC הם מודל חלופה מבטיחה שניתן להשתמש בהם כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפרעות נוירולוגיות ו להקרנה סמים חוץ גופית. בעשור האחרון, מספר פרוטוקולים להמיר hiPSCs לתוך הנוירונים פותח 2-8. עם זאת, הפרוטוקולים הללו עדיין מוגבלים במובנים רבים. ראשית, הפרוטוקולים הם בדרך כלל זמן רב: נוירונים שהניבו עם התבגרות נאותה (כלומר synapse היווצרות) ופעילות פונקציונלית דורשות חודשים של נהלי culturing, אשר הופכים מחקרים בקנה מידה גדולה 9 קשים. בנוסף, hiPSC אל נוירון יעיל המרה הוא נמוך. פרוטוקולים לעתים קרובות להניב אוכלוסייה הטרוגנית של נוירונים, ובכך לא לאפשר מחקרים של תת-מערכות ספציפיות של תאים עצביים. יתר על כן, הפרוטוקולים אינם לשחזור, מניב תוצאות שונות עבור קווי iPSC שונים 10,11. לבסוף, בשלב התבגרות תכונות פעילות של נוירונים וכתוצאה מכך הם גם משתנים 10. כדי לטפל בבעיות אלה, ואח ג&#39;אנג. (2013) 12 פיתח פרוטוקול במהירות reproducibly מייצר נוירונים האדם מן hiPSCs ידי overexpressing גורם שעתוק neurogenin-2. כפי שדווח על ידי המחברים, בידול מתרחש במהירות יחסית (רק 2 - 3 שבועות לאחר גרימת ביטוי של neurogenin-2), הפרוטוקול ניתן לשחזור (נכסים נוירונים הם עצמאיים של היםtarting קו hiPSC), ואת המרת hiPSC אל נוירון היא יעילה ביותר (כמעט 100%). אוכלוסיית נוירונים שנוצרו עם הפרוטוקול שלהם הומוגנית (דומת נוירונים עליונה שכבת קליפת המוח), המאפשרת החקירה של תרומות ספציפיות תא מסוג להפרעות עצביות. יתר על כן, הנוירונים hiPSC הנגזרות שלהם הציגו תכונות בוגרות (למשל, את היכולת ליצור סינפסות ופעילות פונקציונלית חזקה) רק לאחר 20 ד. אפיון תכונות אלקטרו של נוירונים הנגזרות hiPSC ברמת הרשת היא תנאי חשוב לפני הטכנולוגיה hiPSC ניתן לנצל לחקר מחלות אנושיות. מסיבה זו, קבוצות מחקר רבות החלו לאחרונה לחקור נוירונים הנגזרים בתאי גזע ברמת הרשת באמצעות מערך מיקרו-אלקטרודות (MEA) מכשירים (מערכות רבות ערוציות, Reutlingen, גרמניה) 13-16. האלקטרודות של MEA מוטבעי מצע שעליו תאים עצביים יכולים להיות מתורבתים.MEAs יכול לשמש כדי לחקור את תכונות אלקטרו של רשתות נוירונים והתפתחות חוץ גופית של פעילותם. נכון לעכשיו, MEAs משמש רק בשילוב עם פרוטוקולי בידול כי לקחת כמה חודשים כדי להניב רשתות בוגרות. לפיכך, שילוב MEAs עם פרוטוקול התמיינות מהיר אמורה להקל על השימוש בטכנולוגיה זו במחקרים רחב היקף של הפרעות נוירולוגיות. כאן, אנו מציגים שינוי ואח &#39;ג&#39;אנג. (2013) פרוטוקול 12 ולהתאימה לשימוש על MEAs. בפרט, ולא להסתמך על התמרה lentiviral חריפה, במקום יצרנו קווי hiPSC להביע ביציבות rtTA / Ngn2 לפני גרימת בידול. עשינו את זה בעיקר כדי לקבל שליטה לשחזור על צפיפות תאים העצבית, מאז צפיפות התאים העצבית היא קריטית ליצירת רשת עצבית, ועל קשר טוב בין הנוירונים ואת אלקטרודות של MEA 17,18. Althougח ואח &#39;ג&#39;אנג. פרוטוקול יעיל מאוד ביחס המרה של hiPSCs transduced, זה משתנה באופן אינהרנטי ביחס לתשואה הסופי של נוירונים ממספר hiPSCs מצופה בתחילה (ראה איור 2E ב ג&#39;אנג et al.) 12. עם קו יציב, אנו למנוע בעיות רבות גורם השתנות, כגון רעילות lentiviral ויעילות זיהום. לאחר מכן, אנו אופטימיזציה הפרמטרים באופן מהימן לייצר רשתות נוירונים הנגזרות hiPSC על MEAs, קבלת התבגרות רשת (למשל, אירועים סינכרוני מעורבים ברוב הערוצים) על ידי בשבוע השלישי. פרוטוקול מהיר ואמין זה אמור לאפשר השוואה ישירה בין הנוירונים נגזרו קווי hiPSC (מטופל ספציפי כלומר) שונים, כמו גם לספק עקביות חזקות ללימודים תרופתיים.

<table><tbody><tr><td>תוסף L-15 בינוני</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td> של Lebovitz <td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+-free HBSS&nbsp;</td><td>גיבקו</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>2.5% טריפסין</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DMEM עתיר גלוקוז</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (סרום בקר עוברי)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>70 ומיקרו; מסננת תאים</td><td>m BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 וקטור אריזה lentiviral Addgene</td><td></td><td>Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G וקטור אריזה lentiviral Addgene</td><td></td><td>Plasmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת קרום מרתף</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>פתרון ניתוק תאים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>E8 בינוני</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>מעכב ROCK</td><td>Gibco</td><td>A2644501&nbsp;</td><td>לחלופין, ניתן להשתמש במעכבי ROCK כמו תיאזוביבין.</td></tr><tr><td>פוליברנה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8168-10ML</td><td></td></tr><tr><td>פורומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ויטרונקטין</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>6 בארות MEAs</td><td>מערכות רב ערוציות</td><td>60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>VWR</td><td>631-0899</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין (PLO)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3655-10MG</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9891-5G</td><td></td></tr><tr><td>N-2 תוסף</td><td>תזונה Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>NT-3, רקומביננטי</td> <td>אנושיPromokine</td><td>C66425</td><td></td></tr><tr><td>BDNF, רקומביננטי אנושי</td><td>Promokine</td><td>C66212</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>L-alanyl-L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>ציטוזין ובטא;-D-arabinofuranoside&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים ישרים עם קצה עדין</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים עדינים &nbsp;</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

נוירונים שמקורם בתאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) לספק כלי חדש ומבטיח ללימוד הפרעות נוירולוגיות. בעשור האחרון, פרוטוקולים רבים להבחנה hiPSCs לתוך הנוירונים פותחו. עם זאת, הפרוטוקולים הללו הם לעתים קרובות איטיים עם שונות גבוהות, שחזור נמוך, יעילות נמוכה. בנוסף, הנוירונים שהושגו עם פרוטוקולים אלה הם בדרך כלל לא בשלה וחסרי פעילות תפקודית נאותה היא ברמות התא בודד ורשת אלא אם הנוירונים הם מתורבתים במשך כמה חודשים. חלקי בשל המגבלות הללו, תכונות הפעילות של רשתות נוירונים נגזרות hiPSC עדיין לא היטב מאופיינות. כאן, אנו להתאים פרוטוקול שפורסם לאחרונה המתאר ייצור של נוירונים אדם מן hiPSCs ידי ביטוי הכפוי של גורם שעתוק neurogenin-2 12. פרוטוקול זה הוא מהיר (מניב נוירונים בוגרים תוך 3 שבועות) ויעיל, עם יעילות ההמרה כמעט 100% של אנקודריםתאי ed (&gt; 95% של תאי DAPI חיובי הם MAP2 חיובי). יתר על כן, פרוטוקול מניב אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים מעוררים שתאפשר חקירת תרומות ספציפיות תא מסוג להפרעות נוירולוגיות. שינה הפרוטוקול המקורי על ידי יצירת תאי hiPSC transduced ביציבות, נותנת לנו שליטה מפורשת על המספר הכולל של נוירונים. תאים אלה משמשים לאחר מכן ליצור רשתות נוירונים נגזרות hiPSC על מערכי אלקטרודה מיקרו. בדרך זו, פעילות אלקטרו הספונטנית של רשתות נוירונים נגזרות hiPSC ניתן למדוד ומאופיין, תוך שמירה על עקביות interexperimental מבחינת צפיפות תאים. הפרוטוקול המובא הוא החלים רחב, במיוחד עבור מחקרים מכניסטית תרופתיים על רשתות נוירונים אדם.

כאן יש לנו שונה בהצלחה פרוטוקול שבו hiPSCs הם מובחנים ישירות לתוך נוירונים בקליפת המוח על ידי יתר המבטא את גורם שעתוק neurogenin-2 12 ואנחנו צריכים להתאים אותו לשימוש MEAs. גישה זו היא מהירה ויעילה המאפשר לנו להשיג נוירונים פונקציונלי פעילות רשת כבר בשבוע השלישי לאחר האינדוקציה של בידול. במהלך פרוטוקול הבידול, התאים נכתבו מורפולוגית להידמות נוירונים: תהליכים קטנים נוצרו נוירונים נכתבו חיבור לכל (איור 1 א) אחר. הקמנו פרופיל הנוירופיזיולוגי של נוירונים נגזרו קו hiPSC בריא שליטה, על ידי מדידת המורפולוגיה העצבית שלהם ומאפיינים הסינפטי במהלך פיתוח. נוירונים hiPSC הנגזרות היו מוכתמים עבור MAP2 ו synapsin-1/2 בימים שונים לאחר תחילתשל (איור 2 א) בידול. הנוירונים נגזרים להראות מורפולוגיה עצבית בוגרת כבר 3 שבועות לאחר האינדוקציה של בידול. מספר synapsin-1/2 puncta (מדד למספר סינפסות) היה לכמת מבוסס על synapsin-1/2 stainings immunocytochemistry. מספר synapsin-1/2 puncta גדל לאורך זמן, דבר המצביע על כך את רמת הקישוריות עצבית גדלה גם (2B איור). מספר synapsin-1/2 puncta 23 ימים לאחר אינדוקציה של בידול היה דומה בשתי שורות שב"ס עצמאית (איור 2 ג). בגיל 23 DIV ביותר synapsin1 / 2 puncta היו בצמוד PSD-95 puncta, אשר מעיד על סינפסות תפקודית (איור 2 ד). עולה בקנה אחד עם התוצאות שתוארו על ידי ג'אנג et al., שעוררנו אוכלוסיית נוירונים בקליפת מוח שכבה מעוררת העליונה, אושר על ידי הפאן עצבי ו-ספציפי תת סוג קליפת מוח מ arkers כגון BRN2 ו SATB2 (שכבה II / III). אנחנו לא שמרו נוירונים שהיו חיוביות עבור הנוירונים בשכבה עמוקה CTIP2 (שכבה V) או FOXP2 (VI שכבה) (איור 2E ו- F) כדי לאפיין את הפעילות אלקטרו של נוירונים hiPSC הנגזרות, השתמשנו נוכחי כל תא והקלטות מהדק מתח, כלומר תכונות פנימיות קלט מעורר על נוירונים אלה נמדדו במהלך פיתוח. הנוירונים הצליחו ליצור פוטנציאל פעולה כבר שבוע לאחר הבידול ואחוז spiking תאים גברה לאורך זמן (איור 2G ו- H). יתר על כן, הנוירונים קבלו גירוי סינפטיים מעורר כבר שבוע לאחר האינדוקציה של בידול: הוא תדיר אמפליטודה של קלט סינפטיים המעורר גדלו במהלך פיתוח (האיור 2I - K). NT "FO: keep-together.within-page =" 1 "&gt; כדי להבין טוב יותר כיצד פעילות-תא בודד משלב כדי ליצור פונקציות ברמת רשת, זה הכרחי כדי ללמוד כיצד נוירונים הפועלים בתיאום במבחנת רשתות נוירונים בתרבית על MEAs. מהווים מודל ניסיוני ערך ללימוד הדינמיקה העצבית. הקלטנו 20 דקות של פעילות הרשת אלקטרו של נוירונים נגזר קו hiPSC בריא שליטה בתרבית על MEAs 6-היטב (איור 2M). שבועות מעטים לאחר אינדוקציה של בידול, הנוירונים נגזר hiPSCs שליטה בריאה נוצר רשתות נוירונים פעילות מבחינה תפקודית, מוקרן אירועים ספונטניים (0.62 ± 0.05 ספייק / s; 2N האיור). בשלב זה של התפתחות (כלומר 16 ד לאחר תחילת ההתמיינות) נקבע אירועים סינכרוני מעורבים כל הערוצים . של MEAs מזוהה (איור 2 טו) רמת פעילות ברשת עלתה במהלך הפיתוח: במהלך השבוע הרביעי אחרי t אינדוקציה של בידול הוא, רשתות נוירונים הראה רמה גבוהה של פעילות ספונטנית (2.5 ± 0.1 ספייק / s; איור 2N) בכל הבארות של המכשיר. פרצי רשת סינכרוני גם רשתות הציג (4.1 ± 0.1 פרץ / min, איור 2 טו) עם משך ארוך (2,100 ± 500 ms). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg"> איור 1: hiPSC בידול לתוך נוירונים. נקודות א שלושה זמן של בידול hiPSCs לתוך הנוירונים על coverslips. ציפוי ב של hiPSCs על MEAs. ג האסטרוציטים ב 100% confluency ב בבקבוק T75 (לציין כי תאי יוצרי monolayer פסיפס). ברי סולם: 150 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> e_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg"> איור 2. hiPSC הנגזרים אפיון נוירונים. א hiPSC הנגזרות נוירונים היו מוכתמים עבור MAP2 (ירוק) synapsin-1/2 (אדום) בימים שונים לאחר תחילת בידול. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. ב כימות puncta synapsin בשני ניסויים בלתי תלויים. בכל ניסויים לפחות 10 תאים נותחו. ג כימות puncta synapsin ב DIV23 בנוירונים נגזר משני קווי שב"ס עצמאיים. ד hiPSC הנגזרות נוירונים היו מוכתמים עבור PSD-95 (ירוק) synapsin-1/2 (אדום) 23 ימים לאחר תחילת בידול. puncta synapsin מונחים זה לצד זה כדי PSD-95 puncta. א hiPSC הנגזרות נוירונים היו מוכתמים עבור MAP2 (ירוק) BRN2 (אדום) או SATB2 (אדום) 23 ד לאחר תחילת בידול. אחוז פ התאים החיוביים MAP2 כיהיו חיוביים עבור סמנים מצוינים. נציג G. הקלטות מהדק הנוכחי מראה פוטנציאל פעולה שיכולה להיווצר מוקדם ככל 7 ד לאחר תחילת בידול. ח אחוז התאים בימים שונים לאחר האינדוקציה של בידול המראים אחד או יותר פוטנציאל פעולה. I. עקבות נציג של זרמים סינפתטי (EPSCs) שקבלו נוירונים נגזרים hiPSC בימים שונים לאחר בידול. תדירות J. של זרמים סינפתטי במהלך הפיתוח. ק משרעת של זרמים סינפתטי במהלך הפיתוח. ל נציג עקבות של הקלטות EPSC ללא (שליטה) ועם CNQX (CNQX). מ נוירונים נגזרו שורה אחת hiPSC היו בתרבית על MEA 6-היטב פעילות רשת מוצגת עבור רשתות נוירונים נגזרות hiPSC 16 ו -23 ד לאחר האינדוקציה של בידול. הפעילות רשמהכל (קצב דגימה של 10 קילוהרץ) גם מסומן בצבע שונה (5 דק 'של 20 דקות של הקלטה מוצגת). נ ירי שיעור 16 ו -23 ד לאחר האינדוקציה של בידול. O. מתפרץ שיעור 16 ו -23 ד לאחר האינדוקציה של בידול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> לאור התוצאות, איכות hiPSC נגזרות הנוירונים וכתוצאה מכך ניתן להעריך על ידי יצירת פרופיל הנוירופיזיולוגי של התאים. כלומר, שלושה עד ארבעה שבועות לאחר תחילת בידול, מורפולוגיה, synapsin-1/2 הביטוי אלקטרופיזיולוגיה של נוירונים ניתן להעריך. באותו נקודת זמן, הנוירונים הנגזרות hiPSC צפויים להראות מורפולוגיה העצבית דמוי, להיות MAP2, synapsin / PSD-95 חיובי כאשר immunocytochemistry ביצוע, וכדי תערוכהt פעילות אלקטרו ספונטנית (הן ברמה-התא הבודד ורשת).

אנו לשנות וליישם פרוטוקול שפורסם בעבר המתאר את הבידול מהירה, לשחזור, ויעיל של תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) לתוך נוירונים בקליפת המוח מעוררים 12. באופן ספציפי, השינוי שלנו מאפשר שליטה של ​​צפיפות תאים עצבית ושימוש על מערכים מיקרו-אלקטרודות למדוד תכונות אלקטרו ברמת הרשת.

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול התמיינות עצבית זה היא ליצור רשתות עצביות מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם הגדלים על מערכי מיקרואלקטרודות בצורה מהירה ומבוקרת. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחומי מדעי המוח. ניתן להשתמש בו כדי לחקור מנגנונים ביולוגיים העומדים בבסיס הפרעות נוירולוגיות, אך ניתן להשתמש בו גם כדי לטפל בשאלות נוירוביולוגיות בסיסיות יותר.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא התמיינות מהירה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לתאי עצב בצורה מבוקרת. ביום הראשון, יש לחמם DMEM/F12, CDS ו-E8 בינוני עם 1% סטרפטומיצין פניצילין לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף דוקסיציקלין למדיום E8 כדי ליצור ריכוז סופי של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר ולאחר מכן הוסף מעכב סלעים לתערובת.שאפו את המדיום המושקע של RTTANGN2 ה-hiPSCs החיוביים והוסיפו CDS מיליליטר אחד לתאים. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך שלוש עד חמש דקות באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס. תחת המיקרוסקופ, בדוק אם התאים מתנתקים זה מזה.לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר DMEM/F12 לבאר. תלו בעדינות את התאים בעזרת פיפטה של 1,000 מיקרוליטר, והעבירו אותם לצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף שבעה מיליליטר של DMEM/F12 לתרחיף התאים, וסובב את התאים ב-200 x g למשך חמש דקות.לאחר חמש דקות, שאפו את הסופרנטנט והוסיפו שני מיליליטר ממדיום ה- E8 המוכן. נתק את ה-hiPSCs על ידי הנחת קצה של פיפטה של 1,000 מיקרוליטר לצד הצינור של 15 מיליליטר והשעיית התאים בעדינות. תחת המיקרוסקופ, בדוק אם התאים מנותקים.לאחר מכן, קבע את מספר התאים למיליליטר באמצעות המוציטומטר. עבור שש הבארות MEAs, יש לדלל את התאים כדי לקבל תרחיף תאים של 7.5 כפול 10 עד החמישי תאים למיליליטר. עבור החלקות הכיסוי, יש לדלל את התאים לקבלת תרחיף תאים של ארבע פעמים 10 לתאים הרביעיים למיליליטר.שאפו את הלמינין המדולל מהחלקות הכיסוי וששת הבאר MEAs. עבור שש הבארות MEAs, צלחת התאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לאזור האלקטרודה הפעילה בכל באר. לאחר מכן צלחת את התאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת 24 הבארות.לאחר מכן, הניחו את ששת ה-MEAs או את צלחת 24 הבארות באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שעתיים, הוסף בזהירות 500 מיקרוליטר ממדיום E8 המוכן לכל באר משש הבאר MEAs. לאחר מכן, הנח את ששת הבאר MEAs למשך הלילה באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס.ביום השלישי, יש לחמם 0.05% טריפסין-EDTA לטמפרטורת החדר. DPBS חם ו-DMEM/F12 עם 1% פטרפטומיצין פניצילין עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את המדיום המושקע של תרבות אסטרוציטים של חולדות.שטפו את התרבית על ידי הוספת חמישה מיליליטר DPBS וסובבו אותה בעדינות. לאחר מכן, שאפו DPBS והוסיפו חמישה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA. סובב את הטריפסין-EDTA בעדינות.לאחר מכן דגרו את התאים באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, בדוק תחת המיקרוסקופ כדי לבחון אם התאים מנותקים. נתק את התאים האחרונים על ידי פגיעה בבקבוק מספר פעמים.לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של DMEM/F12 לבקבוק. נסה לדרג את התאים בעדינות בתוך הבקבוק בעזרת פיפטה של 10 מיליליטר. לאחר מכן, אסוף את תרחיף התאים בצינור של 15 מיליליטר.סובב את הצינור ב -200 x גרם למשך שמונה דקות. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של DMEM/F12. קבע את מספר התאים למיליליטר באמצעות המוציטומטר.לאחר מכן, הוסיפו 7.5 כפול 10 לאסטרוציטים הרביעיים לכל באר מתוך שש הבארות MEAs. והוסף פעמיים כפול 10 לאסטרוציטים הרביעיים לכל באר של צלחת 24 הבארות. דגרו את התאים למשך הלילה באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס.רכוש את הנתונים בהגברה של פי 1, 200 ודגום את האות ב-10 קילו-הרץ באמצעות כרטיס רכישת הנתונים MCS. רשום 20 דקות של פעילות אלקטרופיזיולוגית של נוירונים שמקורם ב-hiPSC שגודלו ב-MEAs. במהלך ההקלטה, שמור על הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס, ומנע אידוי בינוני ושינויי pH על ידי אספקת זרימה איטית קבועה של גז לח ל-MEAs.לאחר מכן, נתח את הנתונים באמצעות חבילת תוכנה מותאמת אישית. איור זה מציג את שינויי הביטוי של סמנים עצביים MAP2 בסינפסין במהלך תהליך ההתמיינות, המעיד על התבגרות עצבית. גרף זה מראה כי ביטוי סינפסין נמדד עבור תאים בודדים שגדלו במהלך תהליך ההתמיינות.הסינפסין המתבטא בתאים לאחר שלושה שבועות של התמיינות התמקם במשותף עם PSD-95, מה שמעיד על נוכחות של סינפסות תפקודיות. כאן, מהדק תיקון תא שלם בוצע בנקודות זמן שונות במהלך תהליך ההתמיינות כדי למדוד את הפעילות האלקטרופיזיולוגית של התאים. התאים הצליחו לייצר פוטנציאל פעולה בנקודות הזמן השונות.ואחוז התאים המזנקים שגדל עם הזמן מראה שרוב התאים מסוגלים לייצר פוטנציאל פעולה, אפילו בשלב המוקדם של ההתמיינות. מהדק טלאי שימש גם למדידת הזרמים הפוסט-סינפטיים המעוררים שהתקבלו על ידי התאים. מספר הכניסות שהתאים מקבלים גדל במהלך תהליך ההתמיינות.גם התדירות וגם המשרעת של הזרמים הפוסט-סינפטיים המעוררים גדלו במהלך תהליך ההתמיינות. הפעילות האלקטרופיזיולוגית של התאים המומיינים על מערכי מיקרו-אלקטרודות נמדדה במהלך תהליך ההתמיינות. כאן, פעילות הרשת העצבית גדלה במהלך תהליך ההתמיינות, והראתה אירועים סינכרוניים לאחר 23 ימים.לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לרשתות עצביות פונקציונליות תוך שלושה עד ארבעה שבועות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד סטרילי ולטפל בתאים בעדינות. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו בדיקות פרמקולוגיות כדי להציל את הפנוטיפ, שנצפה בשורות התאים של המטופלים.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור באופן רשמי פגמים בפעילות הרשת בהפרעות נוירולוגיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להתמיין, לגרום לתאי גזע פלוריפוטנטיים לתאי עצב בצורה מהירה ומבוקרת.

rapid-neuronal-differentiation-induced-pluripotent-stem-cells-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מדגים את התפתחותה של תרבית עצבית תלת-ממדית המשולבת למערך מיקרואלקטרודות מישורי עם נוירונים בהיפוקמפוס. תאי העצב המבודדים יוצרים רשת דו-ממדית על האזור הפעיל של מערך המיקרואלקטרודות ונצמדים למיקרו-כדוריות זכוכית בצלחת מרובת בארות עם החדרת קרום. כאשר מעבירים את המיקרו-כדוריות מצופות הנוירונים האלה לאלקטרודה, הן מתארגנות לרשת עצבית תלת-ממדית מקושרת.

בניית רשתות נוירונים תלת-ממדיות המצומדות למערכי מיקרו-אלקטרודות

הסרטון מדגים שיטה ליצירת נוירונים קורטיקליים מעוררים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). עם השראת דוקסיציקלין, hiPSCs מבטאים יתר על המידה נוירוגנין-2, גורם שעתוק ספציפי לעצב. על ידי שימוש במדיה ספציפית ותרבית משותפת עם אסטרוציטים, תהליך זה מקל על התמיינות hiPSCs לנוירונים עם קשרים סינפטיים.

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי עצב במערכי מיקרו-אלקטרודות

הסרטון מדגים כיצד להשתמש במערך מיקרואלקטרודות (MEA) כדי להקליט את הפעילות האלקטרופיזיולוגית של תאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). פעילות אלקטרופיזיולוגית מ-MEA רב-באר המכיל תרבית משותפת של נוירון-אסטרוציטים נרשמת כדי לזהות פוטנציאלי פעולה מתאי עצב מרובים ברשת, מה שמאשר את ההתמיינות המוצלחת של hiPSCs לנוירונים.

מדידת הפעילות האלקטרופיזיולוגית של רשתות נוירונים באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרודות

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לגדול ברשתות מודולרי מבחנה המורכבת של מעגלים עצביים, מבחינה תפקודית בין מחוברים-מוגבלים במרחב. מסכת פולימרים משמשת לדפוס שכבת חלבון לקדם הידבקות סלולרית על מצע culturing. נוירונים מצופים לגדול באזורים מצופים יצירת קשרים ספונטניים ומציג פעילות אלקטרו.

עיצוב, משטח טיפול, סלולרי ציפוי, וCulturing של רשתות עצבי מודולרי מורכב ממעגלי קשרים בין פונקציונלי

האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs) נחשבים כלי רב עוצמה עבור סריקה וכימיים ההקרנה ופיתוח של מודלים חדשים במבחנה לבדיקת רעילות, כולל נוירוטוקסיטי. הנה, פרוטוקול מפורט עבור ההבחנה של hiPSCs לתוך נוירונים וגליה מתואר.

Protocol עבור הבחנה של תאים גזעיים Pluripotent Indoced האדם לתוך תרבויות מעורבות של נוירונים וגליה עבור בדיקה נוירוטוקסיות

תאים עצביים עכבר מתורבת על מערכים אלקטרודה רב להציג עלייה בתגובה בעקבות גירוי חשמלי. פרוטוקול זה מדגים כיצד נוירונים תרבות, כיצד להקליט פעילות, וכיצד להקים פרוטוקול להכשיר את הרשתות להגיב על דפוסי גירוי.

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

פרוטוקול זה מדגים את השימוש של שבבי microflu, ממדר מיקרופלואידים, הזרקה מחזורית אולפין קופולימר לנוירונים מתורבתים הבדיל מתאי גזע אנושיים. שבבים אלה מורכבים וקלים לשימוש מאשר התקנים ממוזגים פולי (diמתיל siloxane) מסורתיים. מספר תפיסות נסיוניות נפוצות מתוארות כאן, כולל תיוג נגיפי, בידוד פלואידיג, הוספת פיום וכתמים חיסוני.

מידור של תאי גזע האדם הנגזרים בתוך שבבי מיקרופלואידיג פלסטיק מורכבים מראש

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט עבור השעיית מחדש ו culturing תא גזע אנושי נגזר שהיו הבדיל בעבר מושלתי עצביים בתוך מבחנה במשך שבועות מרובים. ההליך מאפשר הדמיה מבוססי מבוסס על neurites, סינפסות, וסמנים מאוחר ביטוי עצבי בפורמט תואם עם מיקרוסקופ אור והקרנת תוכן גבוה.

לאחר בידול מחדש של תא גזע האדם Pluriפוטנטי-הנוירונים הנגזרים עבור הקרנת תוכן גבוה של Neuritogenesis והתבגרות סינפסה

מאמר זה מכיל קבוצה של פרוטוקולים לפיתוח של האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע (היפנוsc-CM) רשתות המתורבתות על לוחות בעלי השפעה מרובת המידות כדי electroporate הפיך קרום התא עבור מדידות פוטנציאליות פעולה. הקלטות תפוקה גבוהה מתקבלות מאותם אתרי תא במשך ימים ברציפות.

האדם הנגזר iPSC האנטי נטוורקס רשתות על Multiwell מיקרו מערכים אלקטרודה לפעולה ונשנים הקלטות פוטנציאליות

אנו מתארים שיטה להבדיל בין אסטרוציטים ונוירונים שמקורם בחוט השדרה לבין אסטרוציטים ותאי עצב שמקורם בחוט השדרה, ואת התרבות המשותפת שלהם לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי.

הקמת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית למידול ALS עם אסטרוציטים ונוירונים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים אנושיים ספציפיים לאזור

פרוטוקול זה נועד להרכיב ביציבות מכלולים מאוחים גביים-גחונים על מערכים מרובי אלקטרודות לצורך מידול אפילפסיה במבחנה.

פלטפורמה מרובת אלקטרודות למידול אפילפסיה באמצעות מכלולי מוח פלוריפוטנטיים אנושיים שמקורם בתאי גזע

למדו פרוטוקול לבידול מהיר של תאי גזע pluripotent מושרי אדם לנוירונים קורטיקליים מעוררים באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרודה. שיטה זו מאפשרת מדידת פעילות רשתית לחקר מנגנונים נוירוביולוגיים ומחלות נוירולוגיות.

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

גלה סרטונים נוספים