Name: GFP - 태그 TMEM184A를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 배우세요 GFP-태그 TMEM184A를 이용한 헤파린 수용체 신원 확인 방법입니다. 전자기전법과 형광 현미경을 활용하여 고아 유전자의 기능적 식별을 수행하는 이 기법은 혈관 세포에서 단백질 역할을 규명하는 데 활용됩니다.

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Lowe-Krentz 실험실의 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 LLK에 HL54269 연구 보조금의 지원을 받습니다.

<ol><li>Pugh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+Protein+184A+Is+a+Receptor+Required+for+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Responses+to+Heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin.</a> J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).</li>
<li>Daher, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27063980">Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P.</a> Mol Biochem Parasitol. , (2016).</li>
<li>Vit, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+membrane+proteins+based+on+analysis+of+trypsin-protected+transmembrane+segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments.</a> J Proteomics. , (2016).</li>
<li>Attwood, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+based+identification+and+comprehensive+classification+of+four-transmembrane+helix+containing+proteins+%284TMs%29+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome.</a> BMC genomics. 17, 268(2016).</li>
<li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Identification+of+Jatropha+curcas+Aquaporin+Genes+and+the+Comparative+Analysis+Provides+Insights+into+the+Gene+Family+Expansion+and+Evolution+in+Hevea+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis.</a> Front Plant Sci. 7, 395(2016).</li>
<li>Gilotti, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+responses+in+vascular+smooth+muscle+cells+involve+cGMP-dependent+protein+kinase+%28PKG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG).</a> J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).</li>
<li>Farwell, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+Decreases+in+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+%28TNFalpha%29-induced+Endothelial+Stress+Responses+Require+Transmembrane+Protein+184A+and+Induction+of+Dual+Specificity+Phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1.</a> J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).</li>
<li>Xu, D., Esko, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demystifying+heparan+sulfate-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Demystifying heparan sulfate-protein interactions.</a> Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).</li>
<li>Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin%2FHeparan+sulfate+proteoglycans+glycomic+interactome+in+angiogenesis%3A+biological+implications+and+therapeutical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use.</a> Molecules. 20, 6342-6388 (2015).</li>
<li>Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+realignment+and+cofilin+regulation+are+essential+for+barrier+integrity+during+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress.</a> J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).</li>
<li>Patton, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+heparin-binding+protein+using+monoclonal+antibodies+that+block+heparin+binding+to+porcine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells.</a> The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Skalamera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+genome+scale+lentiviral+vector+library+for+EF1alpha+promoter-driven+expression+of+human+ORFs+and+identification+of+human+genes+affecting+viral+titer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer.</a> PloS one. 7, 51733(2012).</li>
<li>Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn-on+switch+in+parathyroid+hormone+receptor+by+a+two-step+parathyroid+hormone+binding+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).</li>
<li>Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+with+the+EGFP-mCherry+fluorescent+protein+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair.</a> Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+the+ATP-sensitive+potassium+channel+complex+examined+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer.</a> J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).</li>
<li>Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Potent+Free+Fatty+Acid+Receptor+1+%28FFA1%29+Fluorescent+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer.</a> J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).</li>
<li>Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+rendered+susceptible+to+proteolysis%3A+positions+for+protease-sensitive+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions.</a> Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에보고 된 프로토콜은 혈관 세포 1 헤파린 수용체로서 TMEM184A의 식별 확증 증거를 제공하도록 설계되었다. 최저 기술은 정기적으로 신규 단백질의 식별을 확인하기 위해 하나의기구로 사용된다. 그러나, 최저 후 일부 기능적 손실 후보 단백질 실제로 정확한 수용체 충분한 증거 (또는 다른 기능성 단백질)은 일반적 아니다. 이는 후보 단백질이 실제로 기능을 발휘한다는 증거를 갖는 것이 중요하다. GFP 태그 새로운 유전자에 대한 구조를 채용하는 기능 실험의 이득을 가능하게하고 GFP 선호도에 따라 태그 단백질의 분리를 용이하게한다. 이 프로토콜에서 사용되는 전기가 (셀의 80 % 이상이 구조를 나타냄) 구조체의 매우 높은 형질 전환 효율을 용이. 일렉트로 사용할 여부를 원하지 않는 경우에는, 다른 형질 전환 메커니즘이 사용될 수있다. 신규 단백질의 기능을 확인하는 GFP 태깅 구조를 선택하는 여러 가지 이점이있다. 우선, GFP는 형질 전환 유전자 발현에 대한 리포터로서 작용하며, ...

새로운 기능에 대한 후보 단백질의 식별은 종종 부분 서열 결정 하였다 선호도 기반 격리 프로토콜에 따라 달라집니다. 새로 확인 된 단백질의 최근 사례는 횡단 단백질 184A (TMEM184A), 헤파린 친 화성 상호 작용 1 일 이후에 확인 된 헤파린 수용체 및 TgPH1, 포스의 PI (3,5) P (2) (2)를 결합하는 플렉스 트린 상동 도메인 단백질을 포함한다. 다른 신규 한 단백질의 식별은, 등 비타 의한 것과 펩티드의 직접적인 서열 분석을 포함한다. 누가 미리지지 않은 유전자에서 3 단백질 제품을 식별하는 트랜스 펩티드를 사용했다. 이와 유사하게, 신규 한 단백질 서열의 확인은 새로운 4TM 단백질 (4)의 식별 앞서있어서 단백질 패밀리의 검색 생물 정보학을 이용하여 달성 될 수있다. 아쿠아 포린 가족 유전자 서열의 검사 등이있다그래서 새로운 기능 5 새로운 회원의 식별을 얻었다. 식별 한 후, 단백질의 기능 분석은 종종 예컨대 아쿠아 포린 마찬가지로 단백질 기능에 대한 구체적인 분석을 이용하여 조사 할 수있는 다음 단계는 전형적이다. 가능하면, 새로 확인 된 단백질의 기능은 특정 효소 또는 유사한 생체 외 기능 분석으로 관찰 할 수있다. 새로운 단백질의 많은 기능은 체외 분석에서 만 그대로 세포 또는 유기체에서 발생하는 복잡한 상호 작용에 의존하기 때문에 항상 적용되지 않습니다. 그러나, 생체 내 분석은 그들이 유전자 서열에 의존하는 방식으로 설계되어야한다. 세포 배양 및 / 또는 간단한 모델 생물에서 최저 단백질 / 기능 식별 6 뒷받침하는 근거를 제공 할 수 있습니다. 전술 한 바와 같이 식별 된 신규 단백질,이 기능을 확인하기 위해 단순히 단백질 노크 종종 불충분D 유전자 서열에 의존 생체 기능 분석의 디자인은 신규 한 단백질의 특성에 중요해진다. 최저의 식별과 일치하는 결과를 얻었다 후 헤파린 수용체로서 TMEM184A 최근 식별은 친 화성 크로마토 그래피와 MALDI MS 1을 사용하는 (즉, 혈관 평활근 및 내피 세포에서 염증 반응에서 확산 변조), 7은 분석의 컬렉션을 개발할 수있는 기회를 제공 . 최근의 검토 헤파린은 다양한 성장 인자, 이들의 수용체, 세포 외 매트릭스 성분, 세포 부착 수용체와 다른 단백질 8 구체적으로 작용 함을 확인 하였다. 혈관계, 헤파린 및 헤파 란 설페이트 프로테오글리칸에 수백 9 단백질과 상호 작용 (헤파린 유사한 구조 헤파 란 황산 사슬 함유). 기능적으로 그쪽을 확인하려면t TMEM184A는 헤파린 흡수 및 결합에 관여하고, TMEM184A의 유전자 구조를 이용 기술이 개발되었다. 본 보고서는 GFP-TMEM184A에 기초 분석법 모음 헤파린 수용체 TMEM184A 등의 신원 확인에 사용하기 위해 구성 포함한다.

<table><tbody><tr><td>GFP-TMEM184A 구조</td><td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-204</td><td>Light Sensitive</td></tr><tr><td>Fluorescein-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-201</td><td>Light Sensitive</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>EMD Millipore</td><td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, methanol free)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, Fisher Scientific</td><td>PI28908</td> 통해 <td>사용 Fume Hood</td></tr><tr><td>Reacti-bind neutravidin 플레이트(Avidin 코팅된 검은색 96웰 플레이트)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, Fisher Scientific</td><td>PI15510</td> 통해 <td>유통 기한이 있는</td></tr> 검은색 96웰 플레이트에 주의 Fisher <tr><td></td><td></td><td></td> A7r5 혈관 평활근 세포에서 <td>Fisher Scientific 064432를 통해 구매한 Corning Life Sciences Plastic</td></tr>에 사용 <tr><td> line</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>MEM medium1</td></tr><tr><td>BAOEC 소 대동맥 내피 세포</td>로 교환 가능 Cell <td>Applications, Inc.</td><td>B304-05</td><td>배양액은 초기에 권장되는대로 지속적인 배양을 위해 MEM 배지로 교환 할 수 있습니다1,7</td></tr><tr><td>BAOSMC 소 대동맥 평활근 세포</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B354-05</td><td>배양액은 초기에 권장하는 대로 지속적인 배양을 위해 MEM 배지로 교환할 수 있습니다1</td></tr><tr><td>RAOEC 쥐 대동맥 내피 세포</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>R304-05a</td> 배양액은 처음에 권장되는 바와 같이 Fisher Scientific MA5-15256-BTIN Streptavidin-coated beads Sigma S1638 <td>HeBS를 통해 배양을 계속하기 위해 MEM 배지로 교환할 수 있습니다7</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-GFP</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech</td><td></td>는 Bio-Rad에서 사용할 수 있습니다.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> pH는</td></tr><tr><td>N-말단</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006</td>에 대한 항체 6.8 <td>TMEM184A N-말단 영역에 대한 항체TMEM184A 알려져 있습니다.</td></tr><tr><td>C-말단에 대한 TMEM184A 항체</td><td>ProSci Inc, Poway, CA&nbsp에서 획득</td>;<td></td><td>Figure 1</td></tr><tr><td>GFP 항체</td>에 사용되는 <td>Pro Sci Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc9996</td><td>Figure 5</td></tr><tr><td>Secondary antibodies, TRITC 또는 Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152 (당나귀 안티 마우스, TRITC) 715 165 150 (당나귀 안티 마우스, Cy3)</td> <td>비특이적 염색을 최소화하기 위해 교차 반응성이 최소화됩니다.</td></tr><tr><td>CHAPS</td> Sigma <td>C5849</td><td>에서 구매</td> 이 <td>특정 카탈로그 번호는 중단되었음을 유의하십시오.&nbsp; 공급업체는 교체에 관한 정보를 제공합니다.</td></tr><tr><td>라이브 이미징 35mm 접시</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 &ndash; 20mm - C</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens</td><td>Figure 1, 2 and 3</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens <</td><td>strong>Figure 5</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 880, 63X 오일 이멀젼 렌즈 포함</td><td><강한>Figure 2C</강한></td></tr><tr><td>Electroporation 장비의</td> 이미지에 사용 <td>Bio-Rad</td><td>Gene Pulser X-Cell System</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳</td> MidSci <td>EC2L</td><td>에서 구할</td> 수 있습니다. 장비 공급업체인 Plate reader TECAN TECAN Infinite&reg; m200 Pro<td>에서도 구할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td> 플레이트 리더</td><td>표면이 아닌 우물 중앙에서 판독합니다.</td></tr><tr><td>염색 강도를 측정하기 위한 컴퓨터 프로그램</td><td>Image J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ 온라인에서 사용할 수 있는 프로그램 및 정보</td><td>적절한 프로그램을 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html 참조하십시오&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>세포 배양 트립신 용액</td><td>Sigma</td><td>T4174</td>를 <td>10x 용액으로 구매</td></tr></tbody></table>

gfp - 태그 tmem184a를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

새로운 단백질 선호도 기반 격리 및 생물 정보학 분석을 통해 확인하면, 그들은 종종 크게지지 않은 있습니다. 예측 된 시퀀스 내의 특정 펩타이드에 대한 항체는 일부 현지화 실험을 할 수 있습니다. 그러나, 다른 항체와의 상호 작용에 종종 배제 할 수 없다. 이러한 상황은 단백질 서열 분석에 의존 세트를 개발하기위한 기회를 제공했다. 특히, 단백질의 C 말단에 GFP 코딩 서열에 연결된 유전자 서열을 함유하는 작 제물을 수득하고 이러한 목적으로 사용 하였다. 실험 지역화 리간드 친 화성을 특징, 기능 및 이득은 원래 설계 헤파린 수용체 1과 TMEM184A의 식별을 확인하기 위해 수행되었다. 또한, 막 구조는 토폴로지 질문 상세한 단백질 - 리간드 상호 작용을 어드레싱 연구에 사용될 수있다. 본 보고서는 아칸소를 제공합니다쉽게 다른 새로운 단백질을 위해 적용 할 수있는 혈관 세포에서 발현되는 GFP-TMEM184A 구조를 기반으로 실험 프로토콜의 플랜지.

이론적으로, 어떤 DNA의 형질 전환은 친 유성 형질 전환 시약으로 수행 할 수있는 세포로 구성,하지만, 이전 보고서는 GFP의보다 효과적인 형질은 전기 (12)를 사용하여 내피 세포로 구성한다 나타냅니다. 여기서 제공되는 프로토콜은 통상적으로 사용되는 주 유래 내피 세포 및 평활근 세포의 80 % 이상에서 발현은 GFP-구성하였습니다. 고용 구조의 디자인은 빠른 속도로이 구조를 제공 할 수있는 상업적으로 사용할 수있는 시스템을 사용했다. 주요 용도는 최적의 진핵 세포 단백질 발현 및 주요 고려 사항이었다 계속 구조물 생산과 함께 위치 문제, 멤브레인에 따라서 정확한 전달에 집중했다. 포함 할 수 있습니다 기타 고려 사항 : 접힌 영역의 일부인 C 말단, 둘다 특별한 능력이있다 구내의 가능성과 다르게 지역화 된 단백질 또는 단백질에 대한 GFP의 다른 위치NG가 GFP (프로테아제 절단 부위를 추가) 및 2 친 화성 부위를 제...

진핵 세포 발현을 위해 디자인 된 카르복시 말단에 GFP 태그 컨스 부호화 TMEM184A는 혈관 세포에서 헤파린 수용체로서 TMEM184A의 식별을 확인하기위한 분석에 사용 하였다.

GFP - 태그 TMEM184A를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

GFP 표기된 구조물 사용의 전반적인 목표는 GFP를 핸들로 사용하여 이전에 알려지지 않은 단백질의 신원을 확인하는 것입니다. 이 방법은 특정 효소 활성을 확인할 수 없는 경우 희귀 유전자의 기능적 식별에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 GPF 태그를 사용하면 여러 유형의 실험에 동일한 구조를 사용할 수 있다는 것입니다.일반적으로, 이 방법을 처음 사용하는 개인은 transfection이 항상 strong-construct 발현을 초래하는 것은 아니며 세포가 항상 재생되는 것은 아니기 때문에 문제가 발생할 수 있습니다. 우리는 단백질에 대해 생성된 항체만을 사용하여 단백질을 식별하는 것의 어려움을 인식하기 시작했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 먼저 1ml의 HEPES 완충 식염수 전기천공 완충액에 관심 세포를 재현탁시키고 즉시 세포를 얼음 위에 놓습니다.DNA 밀리리터당 20마이크로그램의 최종 농도를 달성하기 위해 충분한 부피의 GFP-TMEM184A 표지된 혈장을 세포에 추가하고 약 0.4밀리리터의 세포를 사전 냉각된 전기천공법 큐벳으로 이동합니다. 세포를 전기천공하십시오. 그런 다음 형질 주입된 세포를 조직 배양 접시에 놓고 접시를 세포 배양 인큐베이터에 24-72시간 동안 놓습니다.transfection 단계는 세포가 생존할 수 없고 GFP-표지된 구조체의 상당한 수준을 발현하지 않는 경우 나머지 실험 작업의 대부분을 효과적으로 완료할 수 없기 때문에 절차의 가장 중요한 단계입니다. 적절한 실험 시점에서, GFP-플라스미드 발현 세포 배양 배지에 로다민 헤파린(Rhodamine Heparin) 100마이크로그램을 첨가하고, 형광 현미경 검사에서 관찰된 바와 같이 원하는 염색 수준에 도달할 때까지 빛으로부터 보호되는 세포를 배양합니다. 다음으로, PBS로 세포를 헹구고 빛으로부터 보호하여 몇 초 동안 부드럽게 흔든 다음 4 % 파라 포름 알데히드로 실내 온도에서 15 분 동안 부드럽게 흔들어 고정합니다.GFP 태그가 지정된 로다민 헤파린 공동 국소화를 평가하려면 적절한 GFP 및 로다민 여기 및 감소된 레이저와 함께 컨포칼 현미경을 사용하여 각 개별 라벨링 실험에서 최소 50개의 세포를 이미지화합니다. 적절한 이미지 분석 프로그램에서 이미지를 검사하여 각 세포에서 상대적인 로다민 발견 및 흡수를 결정하고, 자유형 도구를 사용하여 각 형광 이미지 내의 세포에 동그라미를 그리십시오. 측정 도구를 사용하여 원으로 표시된 각 공간 내의 강도를 결정한 다음 형광 강도 데이터를 스프레드시트로 내보내 강도를 곱한 면적을 계산하고 각 셀에 대해 동일한 양의 영역에 대한 배경을 뺍니다.그런 다음 모든 세포에 대한 세포당 형광의 평균을 구하여 통계적으로 유의미한 데이터를 얻을 수 있습니다. GFP TMEM184A에서 로다민 헤파린으로의 형광 공명 에너지 전달을 용이하게 하기 위해 먼저 고정 GFP TMEM184A 로다민 헤파린 표지 세포를 유리 현미경 슬라이드에 형질 주입했습니다. 로다민(Rhodamine) 방출을 이미징하기 위해 405나노미터에서 세포를 여기(excitation)한 다음 488나노미터를 여기(excitation)하여 GFP 방출을 이미징합니다.그런 다음 두 번째 로다민 방출 이미징을 위해 561나노미터에서 세포를 여기시킵니다. 로다민 헤파린 흡수의 라이브 셀 이미징을 위해 GFP TMEM184A 트랜스펙션된 세포의 100ml 합류 접시 배양을 635mm 라이브 세포 이미징 접시에 파종하여 합류 부근의 세포를 얻습니다. 48시간 후, 상등액을 페놀 레드가 없는 배양 배지로 교체하고 세포 접시를 섭씨 37도로 설정된 가온 현미경으로 컨포칼 현미경으로 옮깁니다.현미경의 초점을 맞추고 로다민 헤파린(Rhodamine Heparin) 100마이크로그램을 세포에 부드럽게 섞어 넣습니다. 그런 다음 즉시 라이브 이미지 녹화를 시작하십시오. 시야 내에서 헤파린 흡수가 발생하지 않으면 접시를 약간 움직여 로다민 라벨을 포함하는 하나 이상의 녹색 소포가 있는 세포를 식별합니다.체외 헤파린 결합 평가를 위해 검은색 아티반 코팅된 96웰 플레이트 1개와 검은색 비코팅된 96웰 플레이트 1개를 200마이크로리터의 0.2%CHAPS PBS 프로웰로 헹구어 5분 동안 3회 흔들어 세척합니다. 마지막 세척 후, 각 GFP 발견 그룹에 대해 아티반 코팅 플레이트에 3배로 비오틴화된 항-GFP를 웰당 100마이크로리터의 60피코몰을 추가합니다. 다음으로, 제어 웰에만 완충액을 추가하고 모든 웰을 플레이트 커버로 밀봉하여 흔들면서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.배양이 끝나면 방금 설명한 것처럼 모든 웰을 CHAPS PBS에서 세 번 세척하고 GFP TMEM184A 웰당 5나노몰 100마이크로리터 또는 GFP만 ativan 코팅된 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 진탕하여 배양한 후 모든 웰을 새로운 CHAPS PBS로 세척하고 각 실험용 플루오레세인-헤파린 농도의 100마이크로리터를 적절한 테스트 웰에 3중으로 아티반 코팅된 플레이트에 추가합니다. ativan-coated 및 non-coated plates에 농도 표준물질을 추가하고, 두 plates를 빛으로부터 보호하여 실온에서 10분 동안 incubation합니다.이제 플레이트 리더를 사용하여 두 플레이트의 제어 웰에서 초기 헤파린 형광 방출을 기록하고, 아티반 코팅 플레이트에서 고정된 GFP 또는 GFP TMEM184A이 있는 웰에서 초기 총 형광 방출을 기록합니다. 그런 다음 고정된 GFP TMEM184A 또는 GFP가 있는 웰에서 결합되지 않은 형광 헤파린을 코팅되지 않은 블랙 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 코팅되지 않은 블랙 플레이트에서 형광 방출을 즉시 판독한 후, 플루오레세인-헤파린이 제거된 웰에 100마이크로리터의 새로운 CHAPS PBS를 다시 추가하고 이러한 웰에 대한 형광 방출을 판독하여 코팅되지 않은 플레이트에서 제거되고 결합되지 않은 샘플에서 형광 방출을 얻습니다.모든 언바운드 판독값을 얻었으면 총 헤파린 방출 값을 사용하여 값에서 평균 백그라운드 판독값을 빼서 각 웰에 올바른 수준의 헤파린이 추가되었는지 확인합니다. 그런 다음 추가된 총 플루오레세인-헤파린 대비 방출 플롯을 생성하여 헤파린의 양 대비 방출 규모를 결정하고, GFP 및 GFP TMEM184A 웰 모두에서 삼중체에 대해 추가된 헤파린과 비교하여 수정된 결합 헤파린을 플롯합니다. 형질주입 후의 시간은 GFP TMEM184A의 분포에 영향을 미치며, 이는 최소 72시간 동안 축적되는 것으로 보이며, 시간이 지남에 따라 준핵 영역에서 더 많은 GFP가 명백합니다.이 대표적인 혈관 세포 배양에서 GFP의 염색 패턴은 GFP가 단백질의 C-말단에 있다는 점을 감안할 때 C 단자 펩티드에 대해 제기된 항체의 염색 패턴과 가장 유사한 것으로 보입니다. fluorescein-Rhodamine-Heparin 리간드의 사용은 시간 경과에 따른 리간드 수용체 공동 국소화의 실시간 평가에도 사용할 수 있습니다. GFP에서 헤파린 흡수를 증가시켜 transfection된 안정적인 녹다운 세포를 구축TMEM184A, 그 결과 야생형 세포 수준 이상에서 로다민 헤파린을 내재화할 수 있는 능력을 회복할 수 있는 세포가 생성됩니다.입증된 플라스미드 인코딩 GFP 택트 시스템을 사용하여 anti-GFP 항체 분리 GFP TMEM184A 구조는 특정 사트리플 헤파린 결합을 입증하는 반면, 대조군 GFP는 헤파린에 결합하지 않습니다. 항체를 다시 이용한 간단한 면역형광 염색GFP는 비투과성 세포의 항체 접근을 기반으로 GFP 위치에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 원형질막에서 발현된 GFP가 세포 외라는 예비 증거를 제공할 수 있습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 배양의 24 48 시간 후에 우수한 GFP 구조물 표정, 귀착될 수 있습니다.라이브 이미징 프로토콜을 시도하는 동안 일부 세포는 공동 국소화 흡수를 나타내지 않을 수 있으므로 다른 세포를 검사해야 하는 경우가 많다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. GFP 리간드를 사용한 결합 분석은 특히 세제 미셀에 있는 경우 GFP 단백질의 이량체 또는 고차 응집체에 의해 복잡할 수 있습니다. 전반적으로, GFP 표지된 단백질의 발현은 이전에 알려지지 않은 단백질의 정체성을 확인하기 위해 다양한 실험을 촉진할 수 있습니다.

using-gfp-tagged-tmem184a-construct-for-confirmation-heparin-receptor

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

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