Name: リビジョン人工で新規診断: 超音波処理と多重ポリメラーゼの連鎖反応のインプラント (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学ぶ人工関節感染症の迅速診断法。超音波処理と多重PCRを用いて関節穿刺液から病原体を検出し、整形外科医が早期治療を開始できる正確な微生物学的結果を提供します。

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著者は、この研究を支援するため Curetis GmbH を感謝したいと思います。

本研究は倫理委員会 (046/09 牧師 3) によって承認されました。インフォームド コンセントおよびデータのプライバシーに関する声明は、含まれているすべての患者から得られました。
1. 関節穿刺
メモ: 手順は、手術劇場または匹敵する無菌条件で介入ルームで行わなければなりません。看護師による支援や医師の支援は役立ちますが、必須ではありません。
<ol><li>診察用ベッドに仰臥位で患者を置きます。関心の接合部は衣類の無料を確認します。電気バリカンを使用して密なまたは長い体毛を短きます。かみそりで体毛を削除しないでください。パンクする場合は股関節は、前後方向の透視装置を配置します。膝がパンクする場合、膝はわずかに屈曲位置13にかかっていることなど患者さんの膝の下で膝のロールを配置します。</li>
	<li>下記の滅菌機器の計測器表を準備: 滅菌綿棒、滅菌カバーの穴あきドレープ、使い捨て滅菌メス、尖った外科ブレード (#11 型)、および滅菌カニューレ (20 ゲージ, 80 mm) を 10 mL の滅菌注射器。アルコールの皮膚消毒、採血管、小児血液培養用フラスコを個別に設定します。</li>
	<li>手術ガウン、フード、マスク、ドレスし、滅菌手袋をつけます。</li>
	<li>皮膚の消毒剤と穿刺部位 (例えば優れた関節14股関節膝と前外側のポータル エリアに対して) で患者の皮膚を洗います。 メモ: 気に使用される消毒剤の必要な露光時間 (通常 90 膝、120 s アルコール消毒用ヒップで s)。</li>
	<li>
穴あき滅菌カバー ドレープで穿刺部位をカバーしてください。穿刺部位を特定します。 注: 膝の正しいサイト上部膝蓋骨ポールと横面に 2 cm 横 2 cm です。ヒップ、上前腸骨棘を見つけるし、上部の恥骨まで行尾側に移動します。サイトである (約 4 cm)、大腿動脈の外側15触診できる常にことを確認します。<ol>
<li>穿刺部位で先のとがったメス刃 (3-4 mm 幅と深さ) 皮膚切開小さな刺し傷を作る。局所麻酔薬は静菌効果により、微生物の培養の偽陰性を引き起こす可能性があります適用されません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
注射器の Luer のスリップにカニューレを接続します。刺し切開カニューレを挿入します。膝関節の優れた凹部で背側と内側、膝蓋骨の上部のポール下凹部に向けて 45 ° の角度で目指して、注射器のピストンを引いて関節液、奥行きの約 5 cm 吸引針を挿入します。
	<ol>
<li>股関節に穴をあけるときは、透視ガイドを使用してください。60 ° の角度で内側に向けて穿刺部位に針を挿入します。透視装置、人工首針の先端が指していることを確認します。関節液が達成されるまで、カニューレを吸引しながら深さ約 8 cm (脂肪の患者でより深い) に進みます。人工表面の摩擦を避けるために、吸引しながら、その位置に針を保持します。 メモ: 義足と針先との接触は、関節位置を確認します。股関節液 5 mL 以上が吸気のフォームをすることができます通常、膝継手は、10 mL 以上になります。</li>
		<li>カニューレを除去した後に、刺し切開する滅菌創傷包帯を適用します。血腫の形成を防ぐためには、わずかな圧縮と脚に包帯を適用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サンプル容器に集めた共同吸引を転送します。滅菌作業技能を確認します。
	<ol>
<li>吸気の関節液の小児血液培養用フラスコの接種、アルコール消毒剤と小児血液培養用フラスコの膜を消毒します。注射器に新鮮なカニューレを置くし、血液培養用フラスコに吸気の関節液の 1 に 3 mL を注入します。穏やかな動揺または回転16ミックスします。</li>
		<li>ネイティブ共同吸引試料の調製、注射器からカニューレを削除します。添加物なし、採血管を開き、このコレクション チューブに吸引の 1 mL を注入します。交換し、pcr のためのふたを留めます。 メモ: は、PCR 解析に遅れることがなく微生物学研究室にサンプルを同梱します。従来の微生物学的好気性と嫌気性の文化は、同じサンプルから17を設定できます。</li>
		<li>セル数と分化2EDTA を含む、採血管に共同の吸引の 1 に 4 mL を転送します。遅延なしの生化学研究室にサンプルを出荷します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PCR 診断
<ol><li>(、Lysator、アナライザー、およびコックピット; 材料の表を参照してください) すべての 3 つのデバイスが正しく起動していることを確認します。作業ベンチ (PCR カートリッジ、マスター ミックス チューブ、サンプル チューブとサンプル チューブ キャップ、0 - 200 μ L ピペットと滅菌ピペット チップ) のテストを実行するために必要なすべての物資を設定します。</li>
	<li>室温設定することにより、手順を開始する前にマスター ミックス チューブを解凍してください。(マスター ミックス チューブ、カートリッジ、およびサンプル チューブ) 全ての消耗品は、既にバーコード付き prelabeled します。</li>
	<li>サンプル チューブのキャップを取り外します。収集した標本 (共同吸引、セクション 1; を参照または超音波処理液、セクション 4 を参照) の 180 μ L を取るピペットと転送サンプルにはチューブします。プロテインキナーゼ K とワークフロー全体の品質管理のための内部統制遺伝子を含むサンプル チューブ キャップ付きサンプル チューブを閉じます。</li>
	<li>「新テスト」に触れることによりオペレーティング ソフトウェアを開き、コックピットを左下隅にあるボタン。タッチ スクリーンを介して患者のデータまたはサンプル ID を入力します。試料を選択するには、最初ドロップダウン リスト、アプリケーション モードとして、「整形」から「ITI カートリッジ」を選択、最後にサンプルの種類として「滑液」または「超音波流体」を選択。開始ボタンを押します。</li>
	<li>サンプル チューブの下部のバーコードをスキャンします。Lysator にサンプル チューブを挿入します。 注: 溶解プロセスが自動的に起動し、終了する約 30 分を取る。Lysator 画面にタイマーのカウント ダウンが、溶解したらわかります。</li>
	<li>サンプル チューブ、lysator からのロックを解除するコックピット画面でサンプルを選択します。Lysator からサンプル チューブを外し、lysator の上面カバーを閉じます。PCR カートリッジのサンプル チューブ スロットにサンプル チューブを転送します。PCR カートリッジのマスター ミックス スロットに吉濱マスター ミックス チューブを挿入します。</li>
	<li>コックピットのモニター、マスター ミックスとサンプル チューブと PCR カートリッジをスキャンの指示に従います。</li>
	<li>アナライザーの表示されたカートリッジ スロットに PCR のカートリッジを挿入します。終わったらにすると、アナライザーはカートリッジを解放します。 注: PCR 条件の製造元によって事前設定され、ユーザーが変更することはできません。詳細については、製造元のアプリケーション ガイドを参照してください。PCR プロセスは自動的に開始し、約 4 時間 10 分を取る。</li>
	<li>取り外してカートリッジを廃棄します。コックピットのタッチ スクリーンで左下隅で「現在のテスト」を選択し、テスト結果を表示する適切なサンプル ID を選択します。結果をコンピューターのメモリに保存し印刷またはさらに参考のため (USB ドライブ) 経由でエクスポートします。 注: は、病原体の同定と遅滞なく外科医への抵抗性マーカーの検出を含む PCR の結果を報告します。細菌や真菌性の病原体の 114 のデオキシリボ核酸 (DNA) ターゲットを持つパネルは通常インプラント感染症、軟部組織感染症に見られる最も一般的な抗生物質耐性マーカーと一緒に分析されます。</li>
</ol>3. 手術: 術中のサンプル コレクション
注: 人工関節置換術を専門家レベルの技術と専門的知識が必要です。外科手術の包括的な概要については、外科医の教科書18を参照してください。手術の完全かつ詳細な説明はこの記事の範囲をはるかに超えるでしょう。ここで、焦点はサンプルの収集、事前解析の詳細です。人工関節置換術、手術中に得られた微生物学的試料の結果を損なわないように、単一ショットの抗生の管理を控えます。このような行為は物議を醸す19、20、この規則を遵守することをお勧めします。可能な限り関節手術アプローチは既存を使用します。追加の外科的アプローチは、軟部組織を危険にさらす、瘢痕形成を増加します。
<ol><li>関節包がよく露出するまで組織を解剖します。切開を行う準備で注射器で注射の詳細な分析 (手順 1.7.1-1.7.3) 上記のように、さらに関節液を収集できます。 注: 消毒洗浄液する必要がありますないまで使用インプラントは削除され、組織サンプルがとられています。</li>
	<li>関節インプラントを削除します。除去した後すぐに空気と水タイトなふた付け滅菌プラスチック容器にインプラント部品を転送します。 注: インプラントの除去のための詳細な手順については、教科書の文学で見つけることが (例えば膝: ・ ウィルツら、章 16.421;ヒップ、例えば: クレスら、章 14.5.122)。特定の楽器製造業者の指示によって示されるように、必要がある可能性があります。インプラント除去技術は、異なるインプラントの種類と固定方法のかなり異なります。ノミ ・ ドリル、スライディング ハンマー普遍的な髄内ネイル除去セットのセットは骨統合インプラント23,24の除去に便利です。</li>
	<li>インプラント ・骨界面から膜組織を除去するのに滅菌鋭いキュレット、鉗子、rongeur を使用します。微生物学および組織学の標本としてのネジふた付け滅菌プラスチック容器に組織の代表的なサンプルを転送します。 注: すべての軟部組織の髄腔をオフにリーマを使用できます。また、滑膜組織を取り、検査のため関節のカプセルのサンプル、滅菌容器に保管します。合計では、少なくとも 4 つの標本を収集する必要があります。</li>
	<li>すべてのサンプルおよび器官培養切片部分を微生物学研究室に即座に送信します。 注: 抗生物質を与えすることができます。正しい抗生物質の選択が不可欠であると、個別決定25,26をする必要があります。治療の概念はの事前外科医と微生物学者の学際的なパネルによって決定する必要があります。</li>
	<li>破片の兆候を示して任意の組織を削除することにより元のインプラント サイトのデブリドマンを完了 (ポリエチレンの摩耗など金属やセメント粒子) 感染症や壊死 (化膿性, 無血管である, フィブリン被覆、膜または「ドロドロ」組織)。デッド ・ オア ・ osteitic 骨を削除します。ネジ、ワイヤー、cerclages、骨セメントの破片や非吸収性縫合糸 (クレスら、章 14.5.322参照) などすべての異物を除去します。</li>
	<li>50 mL の注射器を使用して好みの傷の消毒剤を使用して手術部位に水を引きます。リンゲル液パルス洗浄システムの十分な量 (少なくとも 3 L) の水を引きます。スペーサー ジョイント27を安定させる必要があります。</li>
	<li>カプセルまたは筋膜 (編みこみ polyglactin 縫合、トリクロサン コーティング、USP 2)、および皮下組織 (編みこみ polyglactin 縫合、トリクロサン コーティング、USP 0) 抗菌コーティング吸収性深部縫合糸を使用して傷を閉じます。非吸収縫合 (monofilic ポリプロピレン、USP 0 または USP 2-0) を使用して皮膚を閉じます。</li>
</ol>4. 超音波処理
注: 厳密に無菌動作するように気をつけてください。Explanted 材料のさらなる処理のため層流気流をクラス II バイオのベンチを使用します。
<ol><li>Explanted 義足手術室からを保持しているプラスチック製の容器を開く (3.2 を参照) 空気の層流流れ作業ベンチの下、滅菌 0.9% 塩化ナトリウム溶液 explanted 異物までカバーの少なくとも 80% (約 500 800 mL) を追加。</li>
	<li>プラスチックのコンテナーを閉じます。徹底的に振るか超音波風呂へ 30 s. 転写プラスチック容器のため高強度で渦のミキサーを使用してプラスチック容器を攪拌します。超音波風呂の流体のレベルをチェックします。 注: 超音波風呂流体レベルとプラスチック容器の内部と同じでなければなりません。プラスチックの容器が殺到することはできませんし、必要な追加または超音波風呂から液体を削除するかどうかを確認します。</li>
	<li>40 ± 2 kHz とパワー密度 0.22 ± 0.04 W/cm2の周波数と 5 分のための供試体の超音波照射します。手ふれや渦 30 の標本を徹底的に s。 注: 1-5 分間超音波処理時間の細菌生存率28の影響を受けず、バイオ フィルムを溶解に最適です。</li>
	<li>層流ベンチ内超音波処理液 50 mL を収集し、滅菌、堅く密封管にそれを転送します。</li>
	<li>集中された超音波処理液を作成するには、4,200 x g. 残して残留量 10 mL で 10 分間のチューブを遠心分離、ピペットと残りの上清を破棄します。ピペッティング、ボルテックスでペレットを再懸濁します。</li>
	<li>(例えば血液寒天培地、チョコレート寒天培地、サブロー寒天培地、Schaedler の寒天、カナマイシン バンコマイシン寒天またはチオグリコ レート培地) の適切な文化メディア集中超音波処理液各 0.5 ml を接種します。前述のように小児血液培養用フラスコ 2 ml を接種する (手順 1.7.1 参照)。PCR 分析のため添加物なし、採血管に集中超音波処理液 1 mL を移します。</li>
	<li>接種した培地を (35 ° C、5% CO2) インキュベーターに転送します。14 日間文化をインキュベートして毎日の成長をチェックします。</li>
	<li>14 日後の成長と負の値としてレポート文化を破棄します。成長が検出された場合は、標準的な識別技術と感受性試験を用いた病原体同定を行います。遅滞なく外科医に結果を報告します。 注: ここでは、病原体の同定を行ったマトリックス支援レーザー desorbtion/イオン化法を用いた分光法 (MALDI tof) の時間 -。半自動アナライザー29,30,31抗菌薬感受性試験を行った.</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

異物感染症は整形外科における新たな問題と高価な治療、長期入院、機能的欠損は、影響を受ける関節の外傷手術。差動診断は困難です。多くの研究者や臨床医はより正確を見つけるに努めてこのトピックに注意を与えているし、異物の診断に信頼性の高い方法は、感染症を関連付けられています。日には、さまざまな診断ツールがされている評価し、診断パス32で実装されています。
超音波処理の手順は、組織標本6から従来の文化よりも優れた感度を示す、貴重な方法です。本研究では超音波流体文化が 61.5% の特異性と 88.9% の感度を持っていることを示した。ティッシュの標本および共同吸引の両方からの従来の文化はそれぞれ 66.7% 82.3%、84.6% の特異性と感度を持っていた。他の研究者は、これら従来の微生物学的方法6,33,34,35に同様の結果を示します。超音波処理の手順は汚染しやすいので、特別な注意、試料の取り扱いにする必要があります、それはしばしば批判されます。
組織標本または流体の原因となる病原体の DNA を検出する可能性は興味をそそられます。NAT は、数時間のかかる微生物培養法と比較して、時間内に結果を提供できる迅速な手順です。疑いもなく、NAT は、病原体を検出するに良い感度が、検出特異性36を欠く、汚染物質の危険性を保持します。PJI の診断でこの PCR 技術の大きな利点は、特に手術に近い、または長い期間7,8抗生剤の投与を受けた患者で文書化されました。研究では、超音波処理液の NAT では感度と特異度の37を高める可能性がありますさらに示唆しています。残念ながら、この手法は、時間がかかるワークフローのための研究所では日常的に使用できません。
一般に PCR 法に一定の制限があります: NAT は、結果の解釈が難しく、現実的で実行可能な非細菌間の差別化の DNA を検出します。幅広い PCR はしかない病原体37区別 16S ribosomal リボ核酸 (16 s rRNA) を検出できません。特定のシステムは、日常的に、遺伝子でエンコードされた抗生物質耐性マーカーを検出しません。対象となる抗生物質療法したがって、さらに感受性テストせず限られるかもしれない。
特定の細菌間の差別化と抵抗性の遺伝子でエンコードされたマーカーを識別するこれらの制限の一部を克服するこの研究に適用されるシステム。全体的にみて、NAT の試金は PJI7,8,9,38を確認する高速かつ有用な補完として考慮されるかもしれない。
関節穿刺や手術を事前に計画する必要がある: サンプル容器は滅菌準備する必要があります、プロンプトのサンプル輸送ができる必要があります。外科医が計画の手順とその微生物の簡単なサンプルを期待する材料。とき関節穿刺、厳密に無菌状態の実行確保されなければならない、関節の医原性の感染を防止します。脂肪の患者における関節穿刺は、挑戦することができ、透視を参考にすることができます。人工関節置換術を専門知識の非常に高いレベルが必要です、熟練した外科医によってのみ実行する必要があります。Explanted 材料はもはや必要以上に手術室に保管してはいけませんが、微生物学をできるだけ早く送信します。このプロトコルでは非常に重要な部分は、汚染の潜在的な危険性です。だけでなく、サンプルを収集しながら、微生物学研究室のサンプルを処理しながら、職員関与 (整形外科の外科医、看護師、技術者、微生物学者) する必要があります迅速かつ正確に、動作、手順に適切な訓練があります。
超音波処理と NAT は、インプラント関連感染症の診断に貴重なツールです。それにもかかわらず、結果は、常に慎重に問われるべきです。個別の治療戦略に同意する整形外科医、微生物と感染症専門医と病理学者のラウンド テーブル ・ ディスカッションの結果を議論をお勧めします。
PJI のパスは診断でこの手法を実装するには、いくつかの利点を持つことができます。時間内で結果の急速な診断です。いくつか遺伝子抵抗性マーカーの解析のため、対象となる抗生物質療法は、臨床経過の非常に早い段階で起こることができます。副作用として、彼らが本当に必要な徴候の広い範囲抗生物質を保存できます。他のサンプルの種類 (例えば組織標本、綿棒、血腫、等) は、当社のプロトコルに従って調べることができます。PCR カートリッジはクローズド システムですのでトラブルシューティングは不要でユーザー側でできます。プロトコルの任意の適応は、製造元により実装する必要があります。しかし、詳細について明らかにされていない新しいバージョンで変更点を正確に製造元によってシステムを強化する、両方のソフトウェアとハードウェア (カートリッジ) の変更によって継続的に行われます。

痛みを伴う股関節は、整形外科で診断の課題です。、無菌を緩める後 PJI はインプラントの失敗は、2 番目のほとんど理由は、人工関節手術後壊滅的な合併症を示します。PJI は治療が困難と診断することは困難です。主要な罹患率、機能と生活の質の損失と再発性感染症で PJI は可能性の診断を逃した。したがって、感染症は、治療対策を開始する前に痛みを伴う関節を呈するすべての患者で排除されるべき。
患者の医療記録、臨床検査、血液検査 CRP や白血球数と同様、放射線影響を受ける関節の szintigraphy は、基本的な診断1を構成します。術前のルーチンには、可能な限り無菌条件下で関節穿刺も含めます。取得吸引は、さらに診断に非常に貴重な材料です。
細胞数と確立されたアッセイ2として共同吸引細胞の分化のほか蛋白質バイオ マーカーの検出は差動診断3,4,5で助けるかもしれない。従来の微生物学的文化のまま病原体検出のゴールド スタンダードです。バイオ フィルム、両方のグラム陽性およびグラム陰性の細菌とインプラント表面に付着による PJI の主要な病原因子であります。したがって、2007 年に、超音波処理の手順は外国ボディ関連感染の整形外科手術における病原体検出を許可するように削除されたインプラントにバイオ フィルムを破壊診断に実装されました。細菌はそれにより休憩フォームから文化、検出、アクティブなフォームに可能な再度取ら。削除されたインプラントの超音波処理は、組織標本 (78.5% vs. 60.8%)6からの文化よりも高い感受性を示した。
PCR などの核酸増幅検査 (NAT) 最近 PJI を診断する臨床医および微生物の範囲に移動しました。手術前に抗生物質による治療を受けた患者で特に PCR 診断は起炎微生物7,8,9を識別するに有益であることが示されました。最近では、インプラントや組織の感染症 (ITI)、特別に設計された新しいマルチプレックス PCR システムが導入されました。このカートリッジ ベースのシステムでは、様々 な菌の同定のゲノム マーカーおよび抗生物質耐性マーカーを提供しています。(人工関節の感染、手術部位感染症、循環器関連感染症、カテーテル関連感染症、糖尿病性足感染症、深い皮膚組織感染症インプラント感染症、示されているそのアプリケーションの範囲の中で・熱傷創感染、この技術 (超音波処理液、滑液、綿棒、ティッシュ、膿、吸引/滲出液、およびバイオ フィルム) のためのサンプル材料の広いパネルを使用ことができます10、11,12。
従来の微生物学と比較すると、プロシージャの最大の利点は速度: 時間以内に原因となる病原体を識別できます。さらに、この PCR システムは、初期の段階で対象となる抗生物質療法の開始を許可する遺伝子エンコード耐性マーカーの広いパネルを検出します。PCR の支援により、外科医は、診断手順11の非常に早い段階で感染し、非感染患者を区別することができるかもしれない。ここでは、共同吸引超音波処理液から PJI をすばやく診断、このマルチプレックス PCR を実行するプロトコルを提案する.

<table><tbody><tr><td>滅菌プラスチック容器&nbsp;</td><td>ロック&ロック、ディストリビューターISI GmbH、ゾーリンゲン、ドイツ</td><td>EAN 8803733184403</td><td>インプラントバ</td></tr><tr><td>クトソニック14.2&nbsp;</td>の輸送コンテナ<td>バクトソニック、バンデリン、ベルリン、ドイツ</td><td>3290</td> <td>"超音波処理機"</td></tr><tr><td>50mlファルコンチューブベ</td><td>クトン&ディキンソン、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>352070</td><td>遠心分離</td></tr><tr><td>PEDS中血液培養フラスコ&nbsp;</td><td>ベクトン&ディキンソン、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>442194</td><td>培養培地</td></tr><tr><td>コロンビア寒天、羊の血液5%ベ</td><td>クトン&ディキンソン、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>254071</td><td>培地</td></tr><tr><td>Mac Conkey 寒天</td><td>ベクトン &ディキンソン、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>254078</td><td>培養媒体</td></tr><tr><td>チョコレート寒天&nbsp;</td><td>ベクトン&ディキンソン、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>254089</td><td>培地</td></tr><tr><td>サブロー寒天&nbsp;</td><td>ベクトン&ディキンソン、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>254096</td><td>培地</td></tr><tr><td>チオグリコール酸ブイヨン&nbsp;</td><td>ベクトン&ディキンソン、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>221788</td><td>培地</td></tr><tr><td>Schaedler agar</td><td>Becton &ディキンソン、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>254084</td><td>培地</td></tr><tr><td>カナマイシン/バンコマイシン寒天</td><td>ベクトン &ディキンソン、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>254077</td><td>培地</td></tr><tr><td>Bactec FX血液培養システム&nbsp;</td><td>ベクトン&ディキンソン、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>441386/441385</td><td>培地</td></tr><tr><td>Unyvero A50 Analyzer</td><td>Curetis、ホルツガーリンゲン、ドイツ</td><td>60001</td><td>PCRマシン</td></tr><tr><td>Unyvero L4 Lysator</td><td>Curetis、ホルツガーリンゲン、ドイツ</td><td>60002</td><td>PCRマシン</td></tr><tr><td>Unyvero C8 Cockpit</td><td>Curetis、ホルツガーリンゲン、ドイツ</td><td>60003</td><td>PCRマシン</td></tr><tr><td>Unyvero M1 Masterix Tube</td><td>Curetis、ホルツガーリンゲン、ドイツ</td><td>10002</td><td>消耗品 PCR</td></tr><tr><td>Unyvero i60 ITI カートリッジ</td><td>Curetis、ホルツガーリンゲン、ドイツ</td><td>10040</td><td>消耗品 PCR</td></tr><tr><td>Unyvero サンプルチューブ キャップ</td><td>Curetis、ホルツガーリンゲン、ドイツ</td><td>10004</td><td>消耗品 PCR</td></tr><tr><td>Unyvero サンプルチューブ</td><td>Curetis、ホルツガーリンゲン、ドイツ</td><td>10003</td><td>消耗品 PCR</td></tr><tr><td>S-Monovette 2.7ml</td><td>Sarstedt AG,N&uuml;mbrecht, ドイツ</td><td>05.1729.001&nbsp;</td><td>輸送コンテナ(吸引)</td></tr><tr><td>メス typ 11</td><td>pfm medical, ケルン, ドイツ</td><td>200130011</td><td>刺し傷用メス</td></tr><tr><td>PP 容器 70mL 55x45mm</td><td>Sarstedt AG, N&uuml;mbrecht, Germany</td><td>759,922,721</td><td>輸送容器(組織標本)</td></tr><tr><td>Vicryl Plus</td><td>Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germany</td><td>VCP247H</td><td>外科用縫合材料</td></tr><tr><td>Prolene 0</td><td>Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germany</td><td>EH7920H</td><td>外科用縫合材料</td></tr><tr><td>Prolene 2/0</td><td>Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germany</td><td>EH7697H</td><td>外科用縫合材料</td></tr><tr><td>Kodan&nbsp;Tinktur forte farblos</td><td>Sch&uuml;lke &Mayr GmbH, Norderstedt, Germany</td><td>104005</td><td>アルコール性皮膚消毒剤</td></tr></tbody></table>

リビジョン人工で新規診断: 超音波処理と多重ポリメラーゼの連鎖反応のインプラント

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

整形外科患者における外国ボディ関連の感染症、特にステム関節感染 (PJIs)、股関節の壊滅的な合併症です。感染症は複雑な治療を必要とする、長期入院、原因のかなりの費用があります。複数の外科リビジョンは関数同様の損失と生活の質のようにこれらの患者に必要なすることができます。
ルーチンの術前診断には、C-反応性蛋白 (CRP) の血液検査とその他バイオ マーカーだけでなく、細胞数、分化および文化の共同吸引分析が含まれます。術中標本組織学および微生物学の標準的な手順があります。微生物学の分子生物学の技術の実装との組み合わせで、超音波処理で削除されたインプラントの細菌学的検査は、PJI の差動診断を高めるために現在採用されている 2 つの手法を表しています。
ここではカートリッジ ベース多重ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) システムを使用して共同の吸引や超音波処理液分析のステップごとの手順を提示します。結果は、PJI の従来文化との合意条件と照合されました。組織生検の結果から従来の微生物学的文化の共同 61.5%、54.6% 82.3% の特異性および 66.7%、66.7% 88.9% の感度を示した超音波処理液吸引それぞれ。PCR は超音波処理液と 50.0% 55.6% の感度を示した関節液と両方 100.0% 特異性の診断。組み合わせて両方の PCR 診断は、66.7% の感度と特異性は 100.0% に持っていた。マルチプレックス PCR したがって適度な感度、PJI の診断に高い特異性と迅速な診断ツールを提案します。

PJI、筋骨格感染症学会 (MSI) のコンセンサス会議で定めの存在は、実証済みの 1 つの主要な基準またはマイナーの 5 つの基準のうち少なくとも 3 つとがあったと考えられていた。主要な基準には、2 つの独立した微生物サンプルの瘻孔の有無や病原体の検出があります。小基準は陽性細胞数を含める (> 3,000 白血球/μ L) または肯定的な細胞の分化 (> 85% 好中球の顆粒) 共同の吸引で血液中の肯定的な CRP と堆積速度サンプル、組織サンプルで肯定的な組織やちょうど 1 つの微生物学的サンプル19で病原体の検出。感度と特異度を核酸増幅検査 (NAT) の MSI のゴールド スタンダードと比較して求めた。病原体の検出を含む患者の詳細は、表 1に与えられています。
独自の結果診断の超音波処理液と共同吸引 (50.0% と 55.6%) が非常に強力な特異性は 10011PCR のため中等度感受性を示した。たびに PCR 診断 (合計 n = 62 テスト) 共同吸引の所見が陽性 (n = 31) や超音波処理液 (n = 31)、従来の微生物学的文化の一つで後で同じ病原体が検出されました。異なるサンプルの PCR 非感染例を示した偽肯定的な結果 (図 1参照)。
PCR 診断は従来の微生物の培養方法と証明されたいくつかの病原体を検出できませんでした。超音波流体試料中 16 (37.0%) のうち 6 真の病原体や関節液の培養から 13 (38.0%) のうち 5 病原体は PCR 検出によって失われました。ほとんどの場合、PCR 診断はコアグラーゼ陰性ブドウ球菌 (11 のうち 8) の検出を逃した。両方の材料 (関節吸引および超音波処理液、PCR は「プール」) の結合された PCR 診断 12 のうち 18 感染例を正しく識別される (感度 66.7%, 95% CI: 41.0% 86.7% に、表 2を参照してください).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55147/55147fig1.jpg"> 図 1:NAT の概要結果します。グラフは、集団の患者サンプルから集計された結果を示しています。右側左側、PJI の条件に一致する患者のグループはいないグループです。バーは、核酸の増幅方法を表しています。合計の割合としては、偽陽性と偽陰性が赤で表示されます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55147/55147fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>ジョイント</td>
			<td>リビジョンの原因</td>
			<td>一致する MSI 基準?</td>
			<td>前の抗生物質治療ですか。</td>
			<td>超音波処理液の培養</td>
			<td>共同吸引文化</td>
			<td>NAT 超音波文化</td>
			<td>NAT 共同吸引</td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>無菌を緩める</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>無菌を緩める</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>無菌を緩める</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td>Dermabacter ブラストシスチス ・</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>無菌を緩める</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>無菌を緩める</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td>Leifsonia アクアティカ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>無菌を緩める</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>無菌を緩める</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>不安定性</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>慢性脱臼</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td>黄色ブドウ球菌 haemolyticus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>無菌を緩める</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>無菌を緩める</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>無菌を緩める</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>不安定性</td>
			<td>違います</td>
			<td>違います</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>急性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>うん</td>
			<td>緑膿菌</td>
			<td>緑膿菌</td>
			<td></td>
			<td>緑膿菌 緑膿菌</td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>急性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td>大腸菌 大腸菌</td>
			<td>大腸菌 大腸菌</td>
			<td>大腸菌 大腸菌</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>慢性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td>Corynebakterium 属</td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>急性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td>黄色ブドウ球菌</td>
			<td>黄色ブドウ球菌</td>
			<td>黄色ブドウ球菌</td>
			<td>黄色ブドウ球菌 黄色ブドウ球菌</td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>慢性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td>連鎖球菌 agalacticae</td>
			<td>連鎖球菌 agalacticae</td>
			<td>連鎖球菌 agalacticae</td>
			<td>連鎖球菌 agalacticae</td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>慢性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>うん</td>
			<td></td>
			<td>黄色ブドウ球菌</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>慢性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>慢性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>うん</td>
			<td>Staphlococcu 表皮</td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>慢性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>慢性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td></td>
			<td>コアグラーゼ陰性 ブドウ球菌</td>
			<td>コアグラーゼ陰性 ブドウ球菌</td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>慢性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td>黄色ブドウ球菌</td>
			<td></td>
			<td>黄色ブドウ球菌</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>急性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td>コアグラーゼ陰性 ブドウ球菌</td>
			<td>コアグラーゼ陰性 ブドウ球菌</td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>急性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td></td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td></td>
			<td>コアグラーゼ陰性 ブドウ球菌</td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>慢性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>急性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td></td>
			<td>狀 表皮</td>
			<td>コアグラーゼ陰性 ブドウ球菌</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>慢性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td>黄色ブドウ球菌</td>
			<td>黄色ブドウ球菌</td>
			<td></td>
			<td>黄色ブドウ球菌 黄色ブドウ球菌</td>
		</tr><tr><td>ヒップ</td>
			<td>慢性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>違います</td>
			<td>エンテロコッカス faecialis</td>
			<td>エンテロコッカス faecialis</td>
			<td>エンテロコッカス 属</td>
			<td>エンテロコッカス 属</td>
		</tr><tr><td>膝</td>
			<td>慢性感染症</td>
			<td>うん</td>
			<td>うん</td>
			<td>Enterocuccus 球菌</td>
			<td>Enterocuccus 球菌</td>
			<td>エンテロコッカス 属</td>
			<td>エンテロコッカス 属</td>
		</tr></tbody></table>表 1: 患者の詳細、検出された病原体。MSI の条件に一致するリビジョンの手術の原因を含む患者の詳細、および従来の微生物学と NAAT 分析で検出された病原体の表形式の結果。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>基準</td>
			<td>PCR を超音波します。</td>
			<td>PCR の吸引</td>
			<td>プールされた PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>P 値</td>
			<td>0.0036</td>
			<td>0.0013</td>
			<td>0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>感度</td>
			<td>50.0%</td>
			<td>55.6%</td>
			<td>66.7%</td>
		</tr>
<tr>
<td>特異性</td>
			<td>100.0%</td>
			<td>100.0%</td>
			<td>100.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>陽性予測値</td>
			<td>100.0%</td>
			<td>100.0%</td>
			<td>100.0%</td>
		</tr>
<tr>
<td>負の予測値</td>
			<td>59.1%</td>
			<td>61.9%</td>
			<td>68.4%</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 微生物学的方法の結果。超音波処理液、関節吸引とプールされた PCR 診断の PCR の評価の表形式の結果。N それぞれ、吸引、超音波、31 の試験片を = n = 62 プールされた PCR のデータ。

痛みを伴う関節の差動診断は治療の成功に不可欠です。関節穿刺は、日常的に術前に実行されます。共同の吸引と超音波処理液の多重ポリメラーゼの連鎖反応、これらのサンプルからの迅速な病原体検出のための実行可能なツール説明です。

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

関節穿刺、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、および超音波処理を用いて説明される一連の手法の全体的な目的は、人工関節周囲感染が疑われる症例において、整形外科医に迅速かつ信頼性の高い微生物学的結果を提供することです。本手法は、病原体の早期発見、ひいては早期の標的治療といった、人工関節周囲感染の診断および治療分野における重要な課題の解決に寄与します。これらの技術の主な利点は、迅速に結果を得られることです。人工関節周囲感染が疑われる症例において、鑑別診断を迅速化させることができます。患者を診察台の上に仰臥位で눕かせます。膝を穿刺する場合は、膝の下に膝ロールを配置し、膝が軽く屈曲した状態で保持されるようにします。電気バリカンを使用して、密集しているか長い体毛を短くします。次に、テキストプロトコルに従って器具テーブルを準備し、手術着を着用します。続いて、皮膚消毒剤を使用して、穿刺部位の患者の皮膚を十分に洗浄します。開口部のある滅菌ドレープで穿刺部位を覆います。次に、ドレープ越しに穿刺部位を確認します。尖ったメスを用いて、切開部位の皮膚に小さな刺入切開を加えます。カニューラをシリンジのルアー slips に接続します。次に、カニューラを穿刺切開口から挿入します。膝関節の上方陥凹において、膝蓋骨の上極の下方から陥凹に向かって背側および内側に45度の角度で狙いを定め、針を約5 cmの深さまで挿入します。シリンジのプランジャーを引き、関節液を吸引します。血腫の形成を防ぐため、刺入部位にドレッシング材を当て、その上から包帯を巻きます。アルコール消毒剤を用いて、小児用血液培養ボトルのゴム膜を消毒します。次に、新しいカニューレをシリンジに取り付け、吸引した関節液を1〜3 mL、フラスコに注入します。緩やかに振とうまたは回転させて混ぜ合わせます。未処理の関節吸引検体を用意する場合は、シリンジからカニューレを取り外してください。次に、添加剤なしの採血管を開け、関節穿刺液を1 mL注入します。PCR解析のため、蓋を閉めて固定します。細胞数計測および分化能解析のため、1～4 mLの関節穿刺液をEDTA含有採血管に移します。マスターミックスチューブを室温に置いて解凍します。採取した検体180 mcLをサンプルチューブに移します。ワークフロー全体の品質管理のためのプロテインキナーゼKおよび内部コントロール遺伝子が含まれているサンプルチューブキャップで、サンプルチューブを密閉します。コックピットにて、左下の「New Test」ボタンに触れて操作ソフトウェアを開きます。タッチスクリーンを使用して、患者データまたはサンプルIDを入力してください。ドロップダウンから検体を選択するには、まず「ITI Cartridge」を選択し、次にアプリケーションモードとして「Orthopedics」を選択し、最後にサンプルタイプとして「Synovial Fluid」または「Sonication Fluid」を選択します。その後、「Start」ボタンを押してください。サンプルチューブ底部のバーコードをスキャンします。次に、サンプルチューブをLysatorに挿入します。その後、コックピット画面でサンプルを選択し、Lysatorからサンプルチューブを解除します。その後、Lysatorからサンプルチューブを取り出し、Lysatorのトップカバーを閉じます。サンプルチューブをPCRカートリッジのサンプルチューブスロットに転送します。次に、解凍したマスターミックスチューブをPCRカートリッジのマスターミックススロットに挿入します。コックピットモニターの指示に従い、マスターミックスとサンプルチューブが入ったPCRカートリッジをスキャンします。PCRカートリッジをアナライザーの指定されたカートリッジスロットに挿入します。コックピットタッチスクリーンの左下隅で「Active Tests」を選択し、適切なサンプルIDを選択して検査結果を表示させます。結果を装置のメモリに保存し、今後の参照のために印刷またはエクスポートします。微生物学者に連絡して症例の詳細を報告し、サンプルを速やかに分析できるよう準備を依頼してください。層流クリーンベンチ内で、手術室から運ばれた摘出プロステーゼが入ったプラスチック容器を開け、摘出された異物が少なくとも80%浸るまで滅菌0.9% sodium chloride溶液を加えます。プラスチック容器を閉じます。その後、プラスチック容器を30秒間、十分に振とうまたは撹拌します。プラスチック容器を超音波バスに入れます。次に、バス内の液量を確認します。周波数 40 ± 2 kHz、出力密度 0.22 ± 0.04 W/cm² で、検体を 5 分間ソニケーションします。その後、検体を 30 秒間振盪または十分にボルテックスします。ラミナーフローベンチ内で、ソニケーション液 50 mL を採取し、滅菌チューブに移した後、チューブをしっかりと密閉します。濃縮超音波処理液を作成するため、チューブを4200 ×gで10分間遠心分離し、10 mLの液量を残して、ピペットで残りの上清を除去します。ピペッティングとボルテックスミキシングによりペレットを再懸濁します。適切な培養液を入れた各フラスコに、濃縮超音波処理液を0.5 mLずつ接種します。このビデオの前半で示した通り、小児用血液培養ボトルに濃縮超音波処理液を2 mL接種します。次に、PCR分析用に、1 mLの濃縮超音波処理液を添加剤のない滅菌チューブに移します。接種した培養培地をインキュベーターに移します。培養物を14日間インキュベートし、毎日増殖を確認します。1つの主要基準、または5つの副次基準のうち少なくとも3つが認められた場合に、人工関節周囲感染症であると診断しました。主要基準には、瘻孔の存在、または2つの独立した微生物学的検体から病原体が検出されることが含まれます。副基準には、関節穿刺液における細胞数の陽性または細胞分化の陽性、血液検体におけるCRPおよび血沈速度の陽性、組織検体における組織学的陽性、または単一の微生物学的検体における病原体の検出が含まれます。本結果では、超音波洗浄液および関節穿刺液のPCR診断において中程度の感性が示されましたが、特異度は100%という非常に強力な結果となりました。関節穿刺液または超音波洗浄液のPCRで陽性所見が得られた場合、その後、従来の微生物学的培養のいずれかにおいて同一の病原体が検出されました。非感染症例の異なる検体を用いたPCRでは、偽陽性の結果は認められませんでした。超音波洗浄液サンプルの真の病原体16例のうち6例、および関節液培養からの病原体13例のうち5例が、PCR検出で検出されませんでした。関節吸引液と超音波洗浄液の両方の検体を組み合わせたPCR診断では、18例の感染症例のうち12例を正しく特定しました。このビデオを視聴することで、人工関節周囲感染における診断経路をどのように改善すべきかについて、十分な理解が得られるはずです。微生物学者と整形外科医が、分画診断を最大限に向上させるために密接に連携する必要があることがお分かりいただけたかと思います。正しく実施すれば、関節穿刺から5時間以内に、カートリッジベースのマルチプレックスPCRによる臨床的に価値のある結果を得ることができます。この手順を行う際は、全過程を通じて無菌的に作業することを忘れないでください。ヒト組織検体または微生物検体の取り扱いは、極めて危険な場合があることに留意してください。本手順の実施にあたっては、個人用保護具の使用など、常にすべての予防措置を講じる必要があります。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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