Name: Gerichte plasmamembraan Levering van een hydrofobe Cargo ingekapseld in een Liquid Crystal nanodeeltjes Carrier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer hoe je vloeibare-kristalnanodeeltjes gebruikt voor gerichte levering van hydrofobe lading naar het plasmamembraan van levende zoogdiercellen. Deze methode verhoogt de opname-efficiëntie en vermindert cytotoxiciteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de NRL Base Funding Program (Work Unit MA041-06-41-4943). ON wordt ondersteund door een National Research Council postdoctoraal onderzoek associateship.

1. Bereiding van DIO-LCNP en DIO-LCNP-PEG-Chol <ol><li> Ontbinden vloeibaar kristallijne diacrylaat verknopingsmiddel (DACTP11, 45 mg), 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat (DIO, 2 mg), en een vrije radicaal initiator (azobisisobutyronitril, 1 mg) voor polymerisatie in 2 ml chloroform. Voeg dit toe aan een waterige oplossing van acrylaatgefunctionaliseerd surfactant (AC10COONa, 13 mg in 7 ml). </li><li> Roer het mengsel gedurende 1 uur en ultrasone trillingen bij 80% amplitude gedurende 5 minuten om een ​​mini-emulsie bestaat uit kleine druppeltjes van de organische materiaal omgeven door polymeriseerbaar oppervlakteactief middel in water te produceren. </li><li> Verwarm het mengsel tot 64 ° C in een oliebad de polymerisatie van zowel het verknopingsmiddel en surfactant initiëren als chloroform langzaam verdampt, waardoor een DIO-bevattende NP suspensie die wordt gestabiliseerd door de oppervlakteactieve stof. </li><li> Filter de NP suspensie (3 keer) door een 0,2 urn spuitfilter om eventuele samenvoeging verwijderen. Stoopnieuw de gefilterde NP oplossing bij 4 ° C tot verder gebruik. </li><li> Conjugatie van PEG-Chol Dio-LCNP via EDC koppeling. <ol><li> Oplossen Chol-PEG-NH2 · HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) in 25 mM HEPES buffer (pH 7,0). </li><li> Bereid een werkoplossing die N-hydroxy-succinimide-natriumzout (NHSS, 40 mM) en 1-ethyl-3- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimide hydrochloride (EDC, 400 mM) in HEPES buffer uit geconcentreerde voorraadoplossingen. </li><li> Voeg onmiddellijk 20 ul van vers bereide werkoplossing van NHSS / EDC 1,0 ml DIO-LCNP in HEPES buffer en roer gedurende 5 min. </li><li> Voeg 20 pl voorraadoplossing van Chol-PEG-NH2 · HCl aan dit mengsel en roer gedurende 2 uur. </li><li> Kort centrifugeren van het reactiemengsel bij maximale snelheid (~ 2000 xg) voor 30 sec met een mini tabletop centrifuge en laat de bovenstaande vloeistof op een PD-10 gelpermeatiechromatografie kolom geëquilibreerd met 13Dulbecco&#39;s fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS, 0,1x). </li></ol></li></ol> 2. Karakterisering van DIO-LCNP en DIO-LCNP-PEG-Chol <ol><li> Bevestig de succesvolle covalente vervoeging van PEG-Chol de DIO-LCNP oppervlak door gelelektroforese. <ol><li> Los op 0,5 g agarose in 50 ml (1x) tris-boraat elektroforese (TBE; 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM boorzuur en 2 mM EDTA) buffer. Verwarm de oplossing in een magnetron om de agarose op te lossen. Laat de oplossing enigszins afkoelen en giet de inhoud in een gel plaat in de elektroforese doos. Plaats een gel kam om monsterputjes te creëren. </li><li> Zodra de gel gestold, voeg de benodigde hoeveelheid (genoeg om de gel in de kamer onder water) van TBE loopbuffer naar de kamer. </li><li> Voeg 35 ul van DIO-LCNP monster (gewijzigd met glycerol, 5% v / v) aan de putjes van de gel en een looptijd van 20 minuten bij een spanning van 110 V. </li><li> Beeld de onder toepassing van een gel beeldvormingssysteem with excitatie en emissie filters bij 488 nm en 500-550 nm. </li></ol></li><li> Beoordelen van de deeltjesgrootte en verdeling door dynamische lichtverstrooiing (DLS) door verdunning van de DIO-LCNP-oplossing (~ 200-voudige verdunning) in PBS (pH ~ 8, 0.1x) en het meten op een DLS-instrument 14. Meet de zeta-potentiaal van de DIO-LCNPs met een geschikt zetapotentiaal meetinstrument. </li></ol> 3. Voorbereiding van Cultuur van de Cel Gerechten voor Delivery Experimenten en Imaging OPMERKING: dio-LCNP labeling uitgevoerd op HEK 293T / 17 humane embryonale niercellen (passages tussen 5 en 15) die zijn gekweekt zoals eerder beschreven 4. Voer de levering experimenten en de daaropvolgende cell imaging zoals hieronder beschreven. <ol><li> Bereid 35 mm weefselkweekschalen (voorzien van 14 mm No. 1 dekglaasje inserts) door ze te coaten met bovine fibronectine (~ 100 pi bij een concentratie van 20 ug/ Ml) in DPBS gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li><li> Verwijder de fibronectine bekledingsoplossing uit de kweekschaal. Oogst HEK 293 T1 / 7 cellen van de T-25 kolf door eerst wassen van de monolaag met 3 ml DPBS en vervolgens door toevoeging van 2 ml trypsine-EDTA (0,5% trypsine-EDTA 0,25%). </li><li> Incubeer de kolf bij 37 ° C gedurende 3 min ~. Verwijder de trypsine-EDTA en de terugkeer van de kolf naar de incubator. Zodra cellen losgemaakt van de fles, neutraliseren de trypsine door toevoeging van 4 ml compleet medium (Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium, DMEM, gewijzigd in 10% foetaal runderserum, 5% natriumpyruvaat en 5% antibioticum / antimycoticum bevatten) aan de kolf . Bepaal de cel concentratie in de opschorting door ze te tellen in een cel teller. </li><li> Stel de celconcentratie te ~ 8 x 10 4 cellen / ml met groeimedium. Voeg 3 ml van de celsuspensie om de schotel en cultuur in de incubator &#39;s nachts; De volgende dag zou de cellen bij ~ 70% confluentie en gebruiksklaar moet zijn. voldoendeceldichtheid is essentieel voor robuuste en efficiënte labeling van een hoog percentage cellen. </li></ol> 4. Cellular Levering van DIO en DIO-LCNPs en beeldvorming van gefixeerde cellen <ol><li> Bereid 1 ml oplossingen van DIO, DIO-LCNP en DIO-LCNP-PEG-Chol in de levering medium (HEPES-DMEM; DMEM dat 25 mM HEPES) door het verdunnen van voorraad oplossingen van Dio gratis en DIO-LCNPs; gepaste dio concentraties voor incubatie op cellen zullen ~ 1-10 urn (uitgedrukt als hetzij de van Dio gratis of DIO in de vorm van DIO-LCNP) zijn. </li><li> Verwijder het groeimedium uit de kweekschalen onder toepassing van een serologische pipet en was de cel monolagen (zie stap 3) tweemaal met DMEM-HEPES (2 ml elke was). Voer de afwassen door voorzichtig toevoegen en verwijderen HEPES-DMEM met een pipet van / naar de rand van de schotels. </li><li> Voeg 0,2 ml van de bereide DIO vrije of DIO-LCNP bezorgoplossingen naar het midden van de kweekschalen en terugkeer van de schalen in de incubator voor een passende periode (meestal 15 of 30 minuten, afhankelijk van de behoeften van het experiment). Langere incubatietijden toe te voegen aan meer niet-specifieke cellulaire etikettering van niet-membraneuze gebieden (bijvoorbeeld cytosol). </li><li> Na de incubatieperiode, verwijdert u de oplossingen met behulp van een serologische pipet. Was de celmonolagen twee keer met DPBS (2 ml per wasbeurt). Voer de afwassen door voorzichtig toevoegen en verwijderen DPBS / naar de rand van de schaal. </li><li> Bevestig de celmonolagen middels 4% paraformaldehyde (bereid in DPBS) gedurende 15 min bij kamertemperatuur. LET OP: Paraformaldehyde is ontvlambaar, een respiratoire irriterende en een verdacht carcinogeen. </li><li> Verwijder de paraformaldehyde oplossing met een pipet en voorzichtig was de cellen 1 uur met DPBS (2 ml) door het toevoegen en verwijderen DPBS gebruiken pipet / naar de rand van de schotels. </li><li> De gefixeerde cellen gereed zijn afgebeeld op de aanwezigheid van een vliezige fluorescentiesignaal met behulp van confocale laser scanningmicroscopie (CLSM). Voer de beeldvorming direct of alternatief vervangen medium met DPBS met 0,05% NaN3 en bewaar de schaaltjes 4 ° C. LET OP: NaN3 is giftig; uitoefenen uiterste voorzichtigheid bij het gebruik van NaN3. OPMERKING: Vaste monsters in deze wijze moet worden afgebeeld binnen 48 uur voor een optimaal resultaat. </li></ol> 5. Cellulaire Levering van DIO en DIO-LCNPs en FRET Imaging in levende cellen NB: Bij deze methode worden cellen colabeled met 6 uM elk DIO-LCNP-PEG-Chol (waar DIO is een FRET donor) en 1,1-dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DII gratis, waarbij Dii is een FRET acceptor). De release van DIO van DIO-LCNP-PEG-Chol en de opname in het plasmamembraan wordt bevestigd door een waargenomen toename van de energie-overdracht van de DIO donor naar de DII acceptor. <ol><li> Label cellen achtereenvolgens met DIO-LCNP-PEG-Chol en Dil-free toepassing van de werkwijze in stap 4 beschreven. </li><li> Na het kleuren was de cellen 1 uur met DPBS (2 ml) met behulp van een serologische pipet en vervang de wasbuffer met 2 ml live cell imaging oplossing (LCIS). </li><li> Op een microscoop podium met een verwarmd incubatiekamer, het live celmonster met een confocale microscoop (60X objectief) met een FRET beeldvorming configuratie intervallen van 30 min in een 4 uur periode met spannende DIO donor bij 488 nm en verzamelen volledige emissie spectra van zowel de donor als de DIO Dil acceptor 490-700 nm met een 32-kanaals spectrale detector. </li><li> LET OP: Voor meer informatie over FRET beeldvorming, zie referentie 15. </li><li> Bepaal de tijdsopgeloste emissie-intensiteit van zowel de DIO donor en acceptor Dil uit cellen gekleurd met DIO-LCNP-PEG-Chol en Dii. Bereken de tijdsopgeloste acceptor / donor FRET-ratio (DII EMI / DIO EMI) voor de beelden, die gestaag zal toenemen en uiteindelijk plaatau zodra de hoeveelheid dio donor verdeeld in het membraan heeft een maximum 16 bereiken. </li></ol> 6. cytotoxiciteit Assay van DIO en DIO-LCNPs aan de HEK 293T / 17 Cells LET OP: De cytotoxiciteit van de DIO-LCNP materialen wordt beoordeeld aan de hand van een tetrazolium kleurstof gebaseerde proliferatie assay 17. Cellen worden gekweekt in een plaat met meerdere putjes in aanwezigheid van variërende concentraties van de stoffen onder omstandigheden die levering / labeling emuleren. De cellen worden vervolgens gekweekt gedurende 72 uur om voor proliferatie. Een kleurstof (MTS (3- (4,5-dimethyl-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyfenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium) toegevoegd aan de putjes en metabolisch actief cellen zetten de kleurstof in een blauw formazan product. de hoeveelheid kleurvorming is recht evenredig met het aantal levensvatbare cellen. <ol><li> Oogst HEK 293 T1 / 7 cellen van de T-25 kolf door de procedure beschreven in stap 3.2.SeedHEK 293T / 17-cellen (5000 cellen / 100 pl / putje) aan de putjes van een 96-well weefselkweek behandelde plaat en kweek gedurende 24 uur. </li><li> Volledig verwijderen van het kweekmedium uit de putjes met behulp van een micropipet en voeg 50 ul van HEPES-DMEM met Dio gratis, DIO-LCNPs of DIO-LCNP-PEG-Chol bij toenemende concentraties aan putjes te repliceren. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. LET OP: Typisch, repliceert gedaan in drievoud of viervoud voldoende zijn om statistisch betrouwbare gegevens opleveren. <ol><li> Na incubatie, verwijdert u de medium dat het materiaal met behulp van een micropipet en vervangen door 100 ui groeimedium. Kweken van de cellen gedurende 72 uur. </li></ol></li><li> Voeg 20 ul van de tetrazolium substraat aan elk putje, de plaat terug in de incubator en laat kleurvorming verlopen bij 37 ° C gedurende 4 uur. Lees de absorptie (ABS) van de formazan product bij 570 nm (absorptie minima voor de DIO-LCNPs gebruikt in deze study) en 650 nm (voor het aftrekken van niet-specifieke achtergrond absorptie) met behulp van een microtiterplaat reader. </li><li> Zet de differentiële absorptiewaarde (abs 570 - abs 650) versus de concentratie materiaal en de resultaten als percentage van de controle celproliferatie (mate van proliferatie van cellen in alleen celkweekmedium). </li></ol> 7. Data Analysis <ol><li> Statistisch analyseren van de gegevens met een univariate variantie-analyse (ANOVA). Voor meerdere vergelijkingen, gelden post hoc-test van de Bonferroni&#39;s. Helpen gemiddelde waarden ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) tenzij anders vermeld. OPMERKING: De aanvaardbare kans op significantie was p &lt;0,05. </li></ol>

<ol><li>Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+actuation+of+therapeutic+nanoparticles%3A+an+update+on+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress.</a> Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).</li>
<li>Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+low-dose+toxicity+of+the+universal+solvent+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO.</a> FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).</li>
<li>Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tuning+of+organic+nanocolloids+by+controlled+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions.</a> ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).</li>
<li>Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Liquid+Crystal+Nanoparticles+for+Intracellular+Fluorescent+Imaging+and+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery.</a> ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).</li>
<li>Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+DiO-labelled+tumour+cells+in+liver+sections+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy.</a> J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).</li>
<li>Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+neuronal+connections+in+postmortem+human+hippocampal+complex+with+the+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI.</a> Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).</li>
<li>Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in neuroanatomical tracing.</a> Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+DiO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).</li>
<li>Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).</li>
<li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li>
<li>Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+with+fluorescent+carbocyanine+dyes+of+cultured+endothelial+and+smooth+muscle+cells+by+growth+in+dye-containing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium.</a> Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).</li>
<li>Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevation+of+intracellular+glucosylceramide+levels+results+in+an+increase+in+endoplasmic+reticulum+density+and+in+functional+calcium+stores+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons.</a> J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).</li>
<li>Garrett, R. H., Grisham, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarrett%2C+RH+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).</li>
<li>Berne, B. J., Pecora, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerne%2C+BJ+%22Dynamic+Light+Scattering%22">Dynamic Light Scattering</a>. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).</li>
<li>Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html">Basics of FRET Microscopy</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html ">http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html </a> (2016).</li>
<li>Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+hydrophobic+molecules+from+polymer+micelles+into+cell+membranes+revealed+by+Fo%CC%88rster+resonance+energy+transfer+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).</li>
<li>Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+MTT+assay+for+rapid+determination+of+chemosensitivity+of+human+leukemic+blast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells.</a> Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).</li>
<li>Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+raft-mediated+membrane+tethering+and+delivery+of+hydrophobic+cargos+from+liquid+crystal-based+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers.</a> Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).</li>
<li>Karve, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revival+of+the+abandoned+therapeutic+wortmannin+by+nanoparticle+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Een voortdurende doel van NMDD is de gecontroleerde targeting en afgifte van geneesmiddel formuleringen aan cellen en weefsels, in combinatie met gelijktijdige verbeterde werkzaamheid van het geneesmiddel. Een specifieke klasse van geneesmiddel moleculen, en is een belangrijke uitdaging gesteld hydrofoob drugs / beeldvormingsmiddelen die slecht tot geen oplosbaarheid in waterige media. Dit probleem heeft de overgang van krachtige geneesmiddelen geplaagd uit in vitro celkweek systemen om de klinische setting en ...

Sinds de komst van interfacing nanomaterialen (materialen ≤100 nm in ten minste één dimensie) met levende cellen, is een voortdurend doel geweest om te profiteren van de unieke grootte-afhankelijke eigenschappen van nanodeeltjes (NP) voor verschillende toepassingen. Deze toepassingen omvatten weefsel- en labeling / beeldvorming (zowel in vitro als in vivo), real-time detectie en de gereguleerde afgifte van geneesmiddelen en andere ladingen 1. Voorbeelden van dergelijke relevante NP eigenschappen zijn onder andere de grootte-afhankelijke uitstoot van halfgeleider nanokristallen (quantum dots, QDs); de fotothermische eigenschappen van gouden nanodeeltjes; de grote laadcapaciteit van de waterige kern van liposomen; en de ballistische geleidbaarheid van koolstof allotropen, zoals enkelwandige koolstofnanobuizen en grafeen. Meer recent heeft aanzienlijke interesse ontstaan ​​in het gebruik van NPs voor de geregelde modulatie van drugs en andere ladingen, zoals contrast / a beeldvormingheren. Hier, de reden is om aanzienlijk te verbeteren / optimaliseren van de totale oplosbaarheid, toegediende dosis, de circulatie tijd, en de uiteindelijke goedkeuring van de drug lading door het leveren van het als een NP formulering. Dit is bekend geworden als NP-gemedieerde geneesmiddelafgifte (NMDD) aan, en er zijn nog zeven FDA goedgekeurde NP geneesmiddelformuleringen voor gebruik in de kliniek verschillende kankers en honderden meer in verschillende stadia van klinische proeven behandelen. In wezen is het doel om &quot;meer met minder te bereiken;&quot; dat wil zeggen, de NP als een scaffold meer-medicijn met minder dosering besturen door gebruik te maken van het grote oppervlak: volume (bijvoorbeeld, harde deeltjes, zoals QDs en metaaloxiden) NPS of hun grote binnenruimte voor laden grote vracht ladingen (bijvoorbeeld liposomen of micellen). Het doel hiervan is om de noodzaak voor meerdere systemisch afgeleverd doseringsregimes verminderen terwijl het tegelijkertijd bevorderlijk waterige stabiliteit en verbeterde circulatie, met name vooruitdagende hydrofoob geneesmiddel dat ladingen, terwijl zeer effectief, matig oplosbaar in waterige media. Aldus is het doel van de hierin beschreven werk was om de levensvatbaarheid van het gebruik van een nieuwe NP matrix voor de specifieke en gecontroleerde afgifte van hydrofobe ladingen aan de lipofiele plasmamembraan bilaag bepalen. De motivatie voor het werk was de inherente beperkte oplosbaarheid en moeilijkheden bij de levering van hydrofobe moleculen aan cellen uit waterige media. Typisch, de levering van dergelijke hydrofobe moleculen vereist het gebruik van organische oplosmiddelen (bijvoorbeeld DMSO) of amfifiele oppervlakteactieve stoffen (bijvoorbeeld Poloxameren), die toxisch en compromissen cel- en levensvatbaarheid van het weefsel 2 of micel dragers kunnen, waarin de interne belasting kan beperkt capaciteiten. De NP carrier hier gekozen was een nieuw vloeibaar kristal NP (LCNP) formulering eerder ontwikkelde 3 en dat was eerder aangetoond dat een ~ 40-voudig bereiken<html> verbetering van de werkzaamheid van het antikankermiddel doxorubicine in gekweekte cellen 4. In de hierin beschreven werk, de vertegenwoordiger van de lading gekozen was de potentiometrische membraan kleurstof, 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat (DIO). DIO is een in water onoplosbare kleurstof die is gebruikt voor anterograde en retrograde traceren in levende en vaste neuronen, membraanpotentiaal metingen, en voor algemene membraan labeling 5, 6, 7, 8, 9. Door de hydrofobe aard is DIO gewoonlijk rechtstreeks toegevoegd aan celmonolagen of weefsels in een kristallijne vorm 10, of het wordt geïncubeerd bij zeer hoge concentraties (~ 1-20 uM) na verdunning van een concentratie stockoplossing 11, 12. content &quot;&gt; Hier de benadering gebruik de LCNP platform, een multifunctioneel NP waarvan de binnenkern volledig hydrofoob en waarvan het oppervlak tegelijkertijd hydrofiel en vatbaar voor bioconjugatie, als transportmiddel Dio. Dio is opgenomen in de LCNP kern tijdens de synthese en de NP oppervlak wordt vervolgens gefunctionaliseerd met een gePEGyleerd cholesterol groep aan het membraan binding van het DIO-LCNP pakket bij het plasmamembraan bevorderen. Deze benadering resulteerde in een afgiftesysteem dat DIO verdeeld in het plasmamembraan met een grotere betrouwbaarheid en membraan residence tijd dan de vrije vorm van Dio geleverd vanuit bulk-oplossing (Dio gratis). Verder is deze methode is gebleken dat het-LCNP gemedieerde levering van DIO aanzienlijk moduleert en drijft het tempo van de specifieke verdeling van de kleurstof in de lipofiele plasmamembraan dubbellaag. dit is bereikt terwijl gelijktijdig de cytotoxiciteit van de vrije geneesmiddel door het leveren van het als een LCNP formulering verminderen door ~ 40%. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Verwacht wordt dat de hierin beschreven methode een krachtige techniek waarmee onderzoekers wier werk en vereist de cellulaire afgifte van sterk hydrofobe ladingen die slecht oplosbare of volledig onoplosbaar in waterige oplossing zal zijn.

<table><tbody><tr><td>1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA)</td><td>ThermoFisher</td><td>E2247</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292-20MG</td><td>Gevaarlijk; maak een voorraadoplossing in DMSO</td></tr><tr><td>Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride</td><td>Nanocs, Inc.</td><td>PG2-AMCS-2k</td><td></td></tr><tr><td>Countess geautomatiseerde celteller</td><td>ThermoFisher</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Dioctadecyl-3,3,3&prime;&#8288;,3&prime;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>Gevaarlijk; maak een voorraadoplossing in DMSO</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>Verwarmen op 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14040182</td><td>Verwarmen op 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Dynamisch lichtverstrooiingsinstrument</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin bovien eiwit, plasma</td><td>ThermoFisher</td><td>33010018</td><td>Maak een voorraadoplossing van 1 mg/ml met DPBS. Gebruik 20-30 &micro;g/ml voor het coaten van MetTek-schaal, 2 uur bij 37 &deg;C</td></tr><tr><td>Formaldehyde (16%, W/V)</td><td>ThermoFisher</td><td>28906</td><td>Gevaarlijk; verdunnen tot 4% met DPBS</td></tr><tr><td>Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17)</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC&reg; CRL-11268&trade;</td><td></td></tr><tr><td>Live cell imaging solution (LCIS)</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td>Verwarmen op 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>MatTek 14 mm # 1.0 coverglas inzet celkweekschaal</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) met 25 mM HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>Verwarmen op 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>N-hydroxysulfosuccinimide natriumzout (NHSS)</td><td>ThermoFisher</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1si spectrale confocale microscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>meng als een 50% aan de celsuspensie voor het tellen van de cellen</td></tr><tr><td>Zeta potentiaal instrument</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoon processor</td><td>Sonics and Materials Inc</td><td>GEX 600-5</td><td></td></tr><tr><td>Mini Cetntrifuge</td><td>Benchmark</td><td>Mini-fuge-04477</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Sephadex&trade; G-25 Medium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System</td><td>Bio-RAD</td><td>76S/07434</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), fenolrood</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

gerichte plasmamembraan levering van een hydrofobe cargo ingekapseld in een liquid crystal nanodeeltjes carrier

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

De gecontroleerde afgifte van geneesmiddel / beeldvormingsmiddelen cellen is cruciaal voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en voor de studie van cellulaire signaleringsprocessen. Onlangs, nanodeeltjes (NP) zijn veelbelovend in de ontwikkeling van dergelijke afgiftesystemen getoond. Hier is een vloeibaar kristal NP (LCNP) gebaseerde afgiftesysteem toegepast voor de gecontroleerde afgifte van een in water oplosbare kleurstof, 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat (DIO), vanuit de NP kern het hydrofobe gebied van een plasma membraan dubbellaag. Tijdens de synthese van de NP werd de kleurstof efficiënt opgenomen in de hydrofobe kern LCNP, zoals bevestigd door meerdere spectroscopische analyses. Conjugatie van een gePEGyleerd cholesterolderivaat de NP oppervlak (DIO-LCNP-PEG-Chol) kon de binding van de kleurstof beladen NPs naar de plasmamembraan in HEK 293T / 17 cellen. Tijdsgeresolveerde laser scanning confocale microscopie en Förster resonance energy transfer (FRET) beeldvorming bevestigde de pasive uitstroom van DIO uit de LCNP kern en het inbrengen in het plasmamembraan dubbellaag. Ten slotte is de levering van DIO als LCNP-PEG-Chol verzwakt de cytotoxiciteit van DIO; de NP vorm van Dio tentoongesteld ~ 30-40% minder toxiciteit in vergelijking met Dio gratis geleverd vanuit bulk-oplossing. Deze benadering demonstreert de bruikbaarheid van de LCNP platform als efficiënte modaliteit voor membraan-specifieke afgifte en modulatie van hydrofobe moleculaire ladingen.

LCNPs werden bereid, waarbij de hydrofobe kern van de NP werd geladen met een representatieve membraan labeling sonde naar de bruikbaarheid van de LCNP tonen als efficiënte transportmiddel voor hydrofobe ladingen. Daartoe gekozen lading was zeer goed in water oplosbaar membraan potentiometrische-labeling kleurstof, dio. DIO-loaded LCNPs (DIO-LCNPs) werden gesynthetiseerd met behulp van een tweefasige mini-emulsietechniek met de chemische componenten DACTP11, AC10COONa en DIO, zoals weergegeven in figuur...

Vloeibaar kristal nanodeeltje (LCNP) Nanodrager wordt benut als middel voor de gecontroleerde afgifte van een hydrofoob lading naar de plasmamembraan van levende cellen.

Gerichte plasmamembraan Levering van een hydrofobe Cargo ingekapseld in een Liquid Crystal nanodeeltjes Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om een op vloeibaar kristal gebaseerd nanodeeltje te gebruiken als afgifteplatform voor de gecontroleerde afgifte van een hydrofobe lading aan het lipofiele gedeelte van het plasmamembraan van levende zoogdiercellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van geneesmiddelenafgifte, zoals hoe de afgifte en cellulaire opname van slecht wateroplosbare hydrofobe ladingen efficiënt kan worden gefaciliteerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een specifiekere afgifte mogelijk maakt van membraan-gerichte hydrofobe ladingen aan het plasmamembraan, gekoppeld aan een verminderde cytotoxiciteit ervan.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Okhil Nag, een postdoc uit mijn laboratorium. Begin deze procedure met de bereiding van DiO vloeibaarkristal-nanodeeltjes zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens 20 µL vers bereide werkoplossing van NHSS/EDC toe aan 1,0 mL van de DiO vloeibaarkristal-nanodeeltjes in HEPES-buffer.En roer gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens 20 µL van een stamoplossing van cholesterol PEG amine toe aan dit mengsel en roer gedurende twee uur.

targeted-plasma-membrane-delivery-hydrophobic-cargo-encapsulated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Dit protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe het systeem te gebruiken voor een breed scala aan toepassingen.

Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

In deze studie werd een methode beschreven voor het synthetiseren van ultrakleine populaties van biocompatibele nanodeeltjes, evenals verschillende in vitro methoden om hun celinteracties te beoordelen.

Solid lipidenanodeeltjes (SLN) voor intracellulaire targeting Toepassingen

De meest gebruikte methode voor het nanogestructureerde lipidedrager (NAR) synthese zijn olie-in-water emulsie, homogenisering en stollen. Dit werd hier aangepast door het toepassen van een hoge afschuiving dispersie na het stollen een NLC met gewenste grootte, verbeterde drug inkapseling en drugs laden efficiency als een potentiële drager voor dacarbazine levering te bereiken.

Inkapseling van kanker therapeutisch middel Dacarbazine behulp Nanogestructureerde Lipid Carrier

Het doel van dit protocol is om cationische/anionische liposomen met een neuro-targeterend peptide te gebruiken als een CNS-afleversysteem om siRNA in staat te stellen de BBB over te steken. De optimalisatie van een afleversysteem voor behandelingen, zoals siRNA, zou meer behandelingsopties mogelijk maken voor prionen en andere neurodegeneratieve ziekten.

Levering van therapeutische siRNA het CZS gebruiken kationische en anionische liposomen

Nanodeeltjes zijn in opkomst als veelbelovende dragersystemen voor een groot aantal indicaties. Hier beschrijven we een eenvoudige maar krachtige methode om zijde nanodeeltjes produceren met behulp van reverse engineered Zijdevlinder zijde. Deze zijde nanodeeltjes kunnen gemakkelijk worden geladen met een therapeutische payload en vervolgens verkend voor drug delivery applicaties.

Fabricage en Drug Delivery Toepassingen van Silk Nanodeeltjes

Nanomaterialen bieden veelzijdige mechanismen van gecontroleerde therapeutische aflevering voor zowel basiswetenschap en translationeel toepassingen, maar hun fabricage vaak vereist expertise die niet beschikbaar is in de meest biomedische laboratoria. Hier presenteren we protocollen voor het schaalbare fabricage en therapeutische laden van uiteenlopende zelf gemonteerd nanocarriers met behulp van flash nanoprecipitation.

Snelle, schaalbare montage en laden van bioactieve eiwitten en Immunostimulants in verschillende synthetische Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van kationische nanoliposomes, die is gebaseerd op de methode van de droge-film en kan worden gebruikt voor de veilige en efficiënte levering van in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA.

Generatie van kationische Nanoliposomes voor de efficiënte levering van In Vitro getranscribeerd Messenger RNA

Dit artikel beschrijft de inkapseling van falcarindiol in lipide-gecoate 74 nm nanodeeltjes. De mobiele opname van de nanodeeltjes door menselijke stamcellen in lipide druppels wordt gecontroleerd door fluorescerende en confocal beeldvorming. Nanodeeltjes worden vervaardigd door de snelle injectie methode van oplosmiddel verschuiven, en hun grootte wordt gemeten met de Dynamische lichtverstrooiing techniek.

Opname van nieuwe lipide-gecoate nanodeeltjes met Falcarindiol door menselijke mesenchymale stamcellen

Methoden ter voorbereiding en karakterisering van de fysisch-chemische eigenschappen en bioactiviteit van neutraal geladen, pH-responsieve siRNA nanodeeltjes worden gepresenteerd. De criteria voor succesvolle siRNA nanomedicines zoals grootte, morfologie, oppervlaktelast, siRNA lading, en gen het silencing worden besproken.

Voorbereiding van neutraal geladen, pH-responsieve polymere nanodeeltjes voor cytosolische siRNA levering

Deze studie beschrijft klassieke hydratatie met behulp van de dunne lipide-film methode voor de bereiding van nanoliposome gevolgd door nanodeeltjes karakterisatie. Een 47 kDa-hydrofiele en bolvormige proteïne, Tarin, is met succes ingekapseld als een strategie om de stabiliteit te verbeteren, snelle klaring te voorkomen en gecontroleerde afgifte te bevorderen. De methode kan worden aangepast aan hydrofobe moleculen inkaping.

Voorbereiding en karakterisering van Nanoliposomes voor de Entrapment van bioactieve hydrofiele bolvormige eiwitten

Lipide nanodeeltjes worden ontwikkeld met behulp van een microfluïdische mengplatformbenadering voor mRNA- en DNA-inkapseling.

Het formuleren en karakteriseren van lipide nanodeeltjes voor genafgifte met behulp van een microfluïdisch mengplatform

Leer hoe je vloeibare-kristalnanodeeltjes gebruikt voor gerichte levering van hydrofobe lading naar het plasmamembraan van levende zoogdiercellen. Deze methode verhoogt de opname-efficiëntie en vermindert cytotoxiciteit.

Gerichte plasmamembraan Levering van een hydrofobe Cargo ingekapseld in een Liquid Crystal nanodeeltjes Carrier

Meer video's verkennen