Name: Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Découvrez une plateforme de biopuces cellulaires haut-débit pour analyser corrélativement la différenciation cellulaire et les forces de traction. Cette méthode avance la recherche en ingénierie tissulaire et biologie des cellules souches.

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Nous reconnaissons Austin Cyphersmith et Mayandi Sivaguru (Carl R. Institut Woese génomique de la biologie, Université de l&#39;Illinois à Urbana-Champaign) pour l&#39;assistance à la microscopie et généreusement accueillir l&#39;écran et la capture vidéo au cœur de la microscopie.

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Dans nos expériences, nous avons constaté que les défaillances les plus courantes sont liées à la qualité des matrices fabriquées et mal caractérisés réponse dans le système biologique d&#39;intérêt. Nous renvoyons le lecteur au tableau 1 pour les modes de défaillance communs dans les expériences de puces à ADN cellulaire et les étapes de dépannage associées. En ce qui concerne la qualité des réseaux, en particulier, nous recommandons ce qui suit. Confirmer la qualité technique et la robustesse des programmes, paramètres rangeant, et des tampons en utilisant des molécules marquées par fluorescence tels que la rhodamine conjuguée dextran. broches Nettoyer soigneusement avant ou après les rangeant par les instructions du fabricant et en outre vérifier visuellement que les canaux de broches sont claires des débris à l&#39;aide d&#39;un microscope optique. Confirmer la rétention de biomolécules Arrayed utilisant les taches de protéines générales ou immunomarquage. A noter que les biomolécules ayant un poids moléculaire inférieur à 70 kDa sont souvent pas conservés dans 23 l&#39;hydrogel, </<html> sup&gt; 31. Valider biomolécules Arrayed cellule-fonctionnalité en utilisant plusieurs types de cellules. Notez que seules les cellules adhérentes sont compatibles avec les tableaux; En outre, l&#39; adhésion à des réseaux dépend à la fois des propriétés spécifiques à des cellules (par exemple, le profil d&#39;expression de l&#39; intégrine) et les protéines d&#39;ECM sélectionnées. En raison de l&#39; espace limité, nous avons pas fourni un traitement extensif de conception de réseau, mise en page, et la fabrication ici et renvoyer le lecteur aux travaux antérieurs 23, 25. Nous utilisons généralement 100 sous - réseaux au comptant (150 diamètre um spot, 450 um de distance de centre à centre) composé de 10-20 conditions de biomolécules uniques (c. -à- 5-10 points / état). Le nombre de sous-réseaux dans un réseau varie en fonction du nombre de conditions biomolécules d&#39;intérêt, qui peut être confortablement étendu pour 1.280 sur un 25 × 75 mm lame de microscope (~ 6400 points dans 64 sous-réseaux)xref &quot;&gt; 25 31 Les paramètres ci - dessus en outre varier en fonction de la taille du motif d&#39;intérêt;. broches capables de générer des modèles de 75 à 450 um sont facilement disponibles. expériences de tableau sont mieux complétés par la validation de haute notation conditions disposées d&#39;intérêt en utilisant d&#39;autres formats de culture, des lectures d&#39;essai, et des systèmes de modèles biologiques. Plus précisément, nous vous recommandons de valider davantage les effets des conditions choisies disposées en utilisant des cultures en vrac conjointement avec des techniques standard de biologie moléculaire (par exemple, qRT-PCR, immunoblotting) ou la norme TFM. La manipulation génétique (par exemple, knockdown ou surexpression) du facteur d&#39;intérêt dans un système modèle biologique approprié peut également servir à confirmer les effets observés dans des tableaux. In vivo des modèles animaux représentent un autre moyen de validation et ont été récemment utilisés, par exemple, de confirmer le rôle central de la galectine-3 et la galectine-8le cancer du poumon métastatiques créneau, comme initialement identifié par puce à ADN de la cellule 31, 49. Un certain nombre d&#39;autres méthodes ont été utilisées pour sonder la régulation microenvironnement de fonctions cellulaires, y compris une variété de bidimensionnelles systèmes micro - usinés 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 et des systèmes tridimensionnels biomatériau d&#39; ingénierie 56, 57, 58 , 59, 60, 61. En comparaison avec d&#39;autres méthodes, les avantages particuliers de la plate-forme de puces à ADN cellulaire décrits ici comprennent: (1) Débit jusqu&#39;àdes centaines ou des milliers de différentes combinaisons de facteurs, ce qui permet l&#39;analyse des effets de l&#39;interaction; (2) accessible, l&#39;imagerie et l&#39;analyse automatisée; (3) l&#39;intégration des deux lectures biochimiques et biophysiques avec présentation contrôlée de facteurs disposés; (4) l&#39;aptitude à faire varier les propriétés du matériau du substrat; et (5) à haute teneur en analyse unicellulaire du destin et de la fonction cellulaire. En résumé, la combinaison des microréseaux cellulaires avec TFM sur des substrats de rigidité du substrat accordable permet la caractérisation complète des deux indices biochimiques et biophysiques. Tel que présenté ici, cette plate-forme est généralisable et peut être facilement appliquée à une variété de types de cellules adhérentes et des contextes de tissus vers une meilleure compréhension de la régulation de microenvironnement combinatoire de la différenciation cellulaire et la mécanotransduction.

Les interactions entre les cellules et les facteurs environnants microenvironnementales médient une grande variété de processus biologiques au cours du développement, l&#39; homéostasie et la maladie pathogenèse 1, 2, 3, 4. Ces interactions comprennent l&#39;administration microenvironnement de facteurs solubles à des cellules, la liaison cellule-matrice et interactions cellule-cellule par l&#39;intermédiaire de la liaison ligand-récepteur. En plus des considérations biochimiques ci - dessus, les paramètres biophysiques, comme les propriétés mécaniques du substrat (par exemple, le module de Young, de la porosité) et la forme des cellules, et mécanotransduction aval associé ont de plus en plus gagné la reconnaissance en tant que médiateurs clés de la différenciation des cellules 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. Les signaux résultant de ces interactions microenvironnementales servent comme entrées aux réseaux de gènes et les voies de signalisation. En outre, ces composants cellulaires intrinsèques fournissent également une rétroaction au microenvironnement par des facteurs sécrétés et des enzymes dégradant la matrice, complétant une boucle de corégulation complexe entre les programmes génétiques cellulaires intrinsèques et des facteurs cellulaires extrinsèque microenvironnementales 5, 11, 12. L&#39;utilisation de systèmes d&#39; ingénierie pour la présentation contrôlée des facteurs microenvironnement est avéré utile dans une gamme de contextes différents 13, 14, 15. Systèmes microfabriqués en particulier ont facilité la structuration spatiale précise des protéines et des cellules ainsi que des analyses hautement parallélisée via la miniaturisation 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Les puces à cellules représentent un tel système micro - usiné , dans lequel les combinaisons de biomolécules sont des contacts imprimés sur un substrat en hydrogel de polyacrylamide élastique 23, 24, 25. L&#39;inclusion de composants cellulaires-adhésif (à savoir les protéines de la matrice) permet une adhérence soutenue de culture cellulaire et sur les microréseaux, qui est souvent suivie d&#39;une analyse en aval par l&#39;intermédiaire d&#39;immunocytochimie et reporters fluorescents. Microréseaux cellulaires ont été productifs orientés vers la réalisation d&#39; une meilleure compréhension du phénotype des cellules du foie 23, 26, la différenciation des précurseurs de neurones 27, Mammardécisions y progéniteur du devenir 28, embryonnaires cellules souches d&#39; entretien / différenciation 23, 29, 30, poumon métastases du cancer 31, et réponse thérapeutique dans le mélanome 32. Récemment , nous avons démontré que l&#39;utilisation de puces à ADN de la cellule pour définir le rôle de la matrice extracellulaire (ECM) Composition de la protéine dans la description de l&#39; endoderme 33, la différenciation des progéniteurs du foie 34, 35, et une tumeur du poumon réponse aux médicaments des cellules 36. Dans ces travaux, nous avons mis l&#39;accent sur l&#39;extension des capacités combinatoires de la plate-forme de réseau et d&#39;explorer les intersections de la signalisation cellulaire intrinsèque avec la composition et la biomécanique de la matrice extracellulaire. En outre, nous avons mis en œuvre des lectures biophysiques cette plate-forme de réseau pour fournir la capacité de quantitativement caracponctuent la le rôle de la contractilité des cellules dans la différenciation des processus 35. Pour ce faire, nous avons intégré la microscopie à force de traction (TFM) avec des microréseaux cellulaires pour permettre une évaluation à haut débit de traction générée cellulaire. TFM est une méthode largement utilisée pour mesurer des forces de traction générées cellules et a fourni des informations importantes concernant la coordination de la cellule unique et une fonction de niveau de tissu avec la composition et biomécanique du microenvironnement local 37, 38, 39, 40. Ainsi, en combinant TFM avec des microréseaux cellulaires fournit un système à haut débit pour mesurer les principaux paramètres biophysiques, physiologiquement pertinents. La plate-forme de puces à ADN cellulaire décrit ici se compose de quatre sections: la fabrication de substrats de polyacrylamide, la fabrication de tableaux, de la culture cellulaire et test de lecture et l&#39;analyse des données. VoirLa figure 1 pour un résumé schématique des trois premières sections expérimentales; voir la figure 2 pour un résumé schématique de la section finale avec un accent sur l&#39; analyse des données d&#39;immunofluorescence. Afin d&#39;adapter la plate - forme de puces à ADN de la cellule à l&#39; étude des interactions cellule-substrat biomécaniques, on a utilisé des substrats de Polyacrylamide du module d&#39;accordable jeune , mais une porosité similaire, par Wen et al. 41. Pour permettre des mesures TFM des forces exercées par les cellules sur leur substrat, nous avons implémenté un format de Petri plat à fond de verre en plus du microscope en verre épais coulisse fréquemment utilisé par d&#39;autres groupes. Ainsi, cette plate - forme de puces à ADN cellulaire est capable de mesures parallèles de la différenciation cellulaire par immunofluorescence sur des lames de microscope et les forces générées cellules par TFM sur la vaisselle à fond de verre séparés. Nous avons également appliqué plusieurs améliorations à l&#39;approche analytique utilisée avec des microréseaux cellulaires. Spécifiquesly, au lieu de paramétrique Z-score de l&#39;intensité globale de l&#39;île, nous mesurons l&#39;intensité à cellule unique et appliquer la normalisation quantile afin de tenir compte des distributions non-normales et décrire plus précisément le comportement cellulaire. Nous croyons que ces améliorations fournissent une utilité particulière vers les enquêtes sur les processus biologiques dans lesquels les signaux à la fois biochimiques et biophysiques jouent des rôles importants qui se croisent. En outre, nos améliorations analytiques permettent l&#39;application des microréseaux cellulaires à des études d&#39;une gamme de fonctions cellulaires pour lesquelles une seule cellule et de comportement au niveau de la population divergent.

<table><tbody><tr><td>0,2 et micro ; Filtre à seringue m</td><td>Pall Corporation</td><td>4433</td><td>Correspondre avec des seringues en plastique Luer lock de taille appropriée.</td></tr><tr><td>100 & fois ; pénicilline&ndash ; solution de streptomycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>22 & times ; 60 mm</td><td>Lunettes de microscopie électronique Sciences</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3-(triméthoxysilyl)méthacrylate de propyle (3-TPM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Stocker sous gaz inerte selon les instructions du fabricant. L’exposition du 3-TPM à l’air pourrait compromettre la silanisation des substrats de verre. ATTENTION : Le 3-TPM est un liquide combustible. Tenir à l’écart de la chaleur, des étincelles, des flammes nues et des surfaces chaudes et utiliser uniquement dans une hotte chimique.</td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfonate hydraté (CHAPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri à fond de verre de 35 mm</td><td>Cell E& G</td><td>GBD00002-200</td><td>Puits de 13 mm composé d’un verre de protection #1.5. Permet la TFM et l’imagerie de cellules vivantes.</td></tr><tr><td>Microplaque en polypropylène à fond en V de 384 puits, non stérile</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>Microplaques en polystyrène à 6 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td> Les <td>boîtes de Pétri à fond en verre de 35 mm s’insèrent dans les puits de microplaques, facilitant ainsi la fabrication de réseaux.</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>ATTENTION : L’exposition à l’acrylamide peut entraîner une toxicité aiguë et une irritation. Portez des gants de protection, des vêtements et des lunettes de protection.</td></tr><tr><td>Collagène I, queue de rat</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>Collagène III, humain</td><td>EMD Millipore</td><td>CC054</td><td></td></tr><tr><td>Collagène IV, humain</td><td>EMD Millipore</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>Réticulant, 365 nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, rhodamine B-conjugué, 70 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1841</td><td>Utilisé comme marqueur pour l’emplacement du réseau.</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Fisher Scientific (HyClone)</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant DLL1, souris</td><td>R& D Systems</td><td>5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant DLL4, souris</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinant JAG1, rat</td><td>R& D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine, humain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent, inversé</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>Assurez-vous que le microscope est équipé d’une platine robotique pour l’imagerie fluorescente automatisée et la TFM. Contrôle de l’environnement (c’est-à-dire., 37 &deg ; C et 5 % de CO2) sont fortement recommandés pour la TFM.</td></tr><tr><td>Fluoromount G avec DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>ATTENTION : L’acide acétique est inflammable et corrosif. Portez des gants de protection, des vêtements et des lunettes de protection.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF Corporation</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, souris</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Scanner à puces</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>Les fluorophores doivent être compatibles Cy3 ou Cy5.</td></tr><tr><td>Microarrayer</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid Micro</td><td>D’autres microarrayers de capacité similaire ou supérieure peuvent facilement être remplacés.</td></tr><tr><td>Lames de microscope, 25 &times ; 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td>~<td>0,9 &ndash ; 1,1 mm d’épaisseur.</td></tr><tr><td>N,N&prime ; -Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>ATTENTION : L’exposition à l’acrylamide peut entraîner une toxicité aiguë et une irritation. Portez des gants de protection, des vêtements et des lunettes de protection.</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA), 16 % v/v</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>RT15710</td><td>Préparer le PFA frais (ne pas conserver) pour une fixation optimale. ATTENTION : L’exposition au PFA peut entraîner une toxicité aiguë et peut également irriter ou corroder la peau au contact. Portez des gants de protection, des vêtements et des lunettes de protection et utilisez-les uniquement dans une hotte chimique.</td></tr><tr><td>Protéine A/G, plateau de séchage recombinant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex, 2 000 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture rectangulaire à 4 chambres</td><td>Fisher Scientific (Nunc)</td><td>12-565-495</td><td>Pour la culture cellulaire sur lames de microscope en réseau.</td></tr><tr><td>Acétate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>ATTENTION : Le NaOH est très caustique et peut provoquer de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Portez des gants de protection, des vêtements et des lunettes de protection.</td></tr><tr><td>Broche furtive pour la mise en réseau</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>Nettoyez les broches après chaque exécution de la matrice en suivant les instructions du fabricant. Produit des domaines de 150 microns ; Achetez d’autres tailles de goupilles (75&ndash ; 450 microns) en fonction de votre application particulière.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

un haut-débit plate-forme cell biopuces pour corrélative analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

microréseaux cellulaires microfabriqués, qui consistent en des combinaisons de biomolécules coordonnées imprimées sur une surface d&#39;hydrogel élastique, fournissent un système d&#39;ingénierie à haut débit étroitement contrôlé pour mesurer l&#39;impact des signaux biochimiques disposés sur la différenciation cellulaire. Les efforts récents utilisant des microréseaux cellulaires ont démontré leur utilité pour les études combinatoires dans lesquelles de nombreux facteurs microenvironnement sont présentés en parallèle. Cependant, ces efforts ont porté principalement sur l&#39;étude des effets des signaux biochimiques sur les réponses cellulaires. Ici, nous présentons une plate-forme de puces à ADN cellulaire avec les propriétés des matériaux accordables pour évaluer à la fois la différenciation des cellules par des interactions d&#39;immunofluorescence et de la cellule-substrat biomécanique par la force de traction microscopie. Pour ce faire, nous avons développé deux formats différents en utilisant des hydrogels de polyacrylamide de variation du module de Young fabriqué soit sur des lames de microscope ou des plats à fond de verre de Pétri. Nous fournissons bespratiques de t et le dépannage pour la fabrication de biopuces sur ces substrats d&#39;hydrogel, la culture cellulaire ultérieure sur microarrays, et l&#39;acquisition de données. Cette plate - forme est bien adaptée à une utilisation dans les enquêtes sur les processus biologiques pour lesquels les deux biochimique (par exemple, la composition de la matrice extracellulaire) et biophysique (par exemple, la rigidité du substrat) indices peuvent jouer significative, coupant les rôles.

L&#39; utilisation de cette plate - forme, nous avons étudié le rôle des deux indices biochimiques et biophysiques dans la spécification du sort des progéniteurs du foie 34, 35. / Notch G conjuguée à des ligands de protéine A ont amélioré la rétention et le regroupement dans l&#39;hydrogel de polyacrylamide (figure 3A) et sont en outre capables de différenciation des progéniteurs du foie conduisant vers une destinée des cellules des canaux biliaires (figure 3B). En utilisant une analyse à cellule unique, nous avons quantifié la réponse à des ligands Notch pour les protéines d&#39;ECM de collagène I, le collagène III, le collagène IV, la fibronectine et la laminine (figure 3C), estimant que la réponse des progéniteurs du foie au ligand dépend également de la contexte ECM. Enfin, nous avons utilisé shRNA knockdown pour générer progéniteurs du foie sans les ligands DLL1 et JAG1. La réponse au ligand de Notch revêtu variait en fonction de la prEsence soit un ligand, ce qui confirme que la réponse au ligand cellulaire extrinsèque est également fonction du ligand expression de cellule intrinsèque (figure 3D). De plus, nous avons observé une sous - population distincte de la double-positive (ALB + / OPN +) cellules dans le knockdown DLL1 (Figure 3D). Ensemble, ces résultats représentatifs montrent: (1) les capacités combinatoires du format de tableau, comme en témoigne l&#39;appariement de multiples protéines revêtu d&#39;ECM et des ligands Notch avec le knockdown de ligands individuels; (2) la fonctionnalité non seulement revêtit protéines ECM, mais aussi revêtit ligand cellule-cellule par l&#39;intermédiaire de la protéine A / G à médiation par conjugaison; et (3) la mise en œuvre de notre analyse unicellulaire et sa capacité à discerner les sous-populations uniques. Nous avons également observé que la différenciation des progéniteurs du foie dépend à la fois de la rigidité du substrat et la composition de l&#39; ECM (figure 4A </str<html> ong&gt;), trouver spécifiquement que le collagène IV est favorable à la différenciation des deux substrats souples et rigides alors que la fibronectine ne supporte que la différenciation sur des substrats rigides (figure 4B). Cartes de chaleur représentatifs de mesures TFM ont suggéré que le stress de traction soutenue à faible rigidité du substrat sur le collagène IV une différenciation dans les cellules des canaux biliaires (figure 4C), une constatation confirmée par des valeurs racine carrée moyenne moyenne (Figure 4D). Ensemble, ces résultats représentatifs montrent: (1) l&#39;intégration réussie de TFM avec des microréseaux de cellules sur des substrats avec une rigidité accordable pour évaluer à la fois le phénotype cellulaire et la contrainte de traction; (2) la coordination du sort de progéniteurs du foie à la fois avec la composition de matrice et la rigidité du substrat; et (3) la mise en œuvre de nos analyses et typiques profils de contraintes de traction TFM en microréseaux cellulaires. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1: Vue d&#39; ensemble schématique montrant les trois premières sections expérimentales. Dans la section 1, des substrats en verre sont nettoyés et silanisées pour faciliter la fabrication d&#39;hydrogels de polyacrylamide. Dans la section 2, les combinaisons de biomolécules d&#39;intérêt sont préparés dans une source microplaques 384 puits. Un arrayer robotique est ensuite chargé avec des épingles propres, la microplaque source, et les hydrogels de polyacrylamide et initialisée, la fabrication des tableaux sur les hydrogels. Dans la section 3, les cellules sont ensemencées sur des domaines disposés en réseau et on les laisse adhérer, après quoi le protocole de culture d&#39;intérêt est effectuée. Au point final, les cellules sont soit fixes pour immunocytochimie / immunofluorescence ou analysées en utilisant TFM. Les barres d&#39;échelle sont de 75 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> dans les pages = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figure 2: Traitement et analyse des données immunofluorescence de tableaux. (A) sol, composites 32 bits des images RVB sont d&#39; abord mis en cellule et ensuite divisé en différents canaux de 8 bits. En utilisant une combinaison de marqueurs fluorescents disposés et îlots de cellules, trois coins de la matrice sont identifiés pour permettre l&#39;orientation automatique et maillage des réseaux. (B) les données à l&#39; unité de cellules est généré pour chaque canal des tableaux d&#39;entrée. Afin de tenir compte de la dérive expérimentale, la normalisation quantile est appliquée par répliquée biologique, produisant une distribution unique partagée entre toutes les répétitions. Quantile données normalisées est ensuite tracée et interprétée par le calcul des mesures d&#39;ensemble (par exemple, les cellules / île, intensité moyenne, les cellules de pourcentage positives pour une étiquette) ou d&#39; analyse directe des distributions unicellulaires.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figure 3: Notch Ligand Présentation du foie Progéniteur Différenciation à titre de médiateur. (A) Fc recombinant Notch ligands Jagged-1 (JAG1) et Delta-like 1 (DLL1) présentaient une meilleure rétention et le regroupement lorsque revêtit avec de la protéine A / G. La barre d&#39;échelle est de 50 um. Progéniteurs (B) , du foie différenciées en cellules du canal cholédoque , sur présentation d&#39; un ligand Notch. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) est un marqueur nucléaire, l&#39;albumine (ALB) est un marqueur cellulaire hépatique, et l&#39;ostéopontine (OPN) est un marqueur des cellules du canal cholédoque. La barre d&#39;échelle est de 150 um. (C) Quantification du pourcentage de cellules positives pour OPN pour les ligands de Notch JAG1, DLL1 et Delta-like 4 (DLL4) sur les protéines ECM collagène I, collagen III, le collagène IV, la fibronectine et la laminine. T Les -Tests de Student ont été effectuées contre le contrôle IgG pour chaque ligand Notch rangé dans chaque protéine ECM avec P-valeurs indiquées pour P &lt;0,05 (*). (D) Imaging cytométrie de ALB et OPN pour les cellules sur le collagène III présentées avec les ligands de Notch JAG1, DLL1 et DLL4. Progéniteurs hépatiques sans Notch ligands DLL1 et JAG1 (ie, shDll1 et shJag1) ont été générés en utilisant shRNA knockdown. Les données de (C) présentés sous forme de moyenne ± ETM Ce chiffre a été modifié à partir de Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figure 4: Matrix Composition et Substrat Rigidité Coordinate Liver Progéniteur Différenciation. (A) la différenciation hépatique progéniteurs biliaires cellules de canal dépend à la fois la composition de l&#39; ECM et la rigidité du substrat. DAPI est un marqueur nucléaire, ALB est un marqueur cellulaire hépatique, et OPN est un marqueur des cellules du canal cholédoque. (B) Quantification du pourcentage de cellules positives pour l&#39; OPN sur des substrats de module d&#39;Young 30 kPa, 13 kPa et 4 kPa pour le collagène I (C1), le collagène IV (C4), la fibronectine (FN), et toutes bidirectionnelles combinaisons de ces protéines de la MEC. (C) Contrainte de traction cellulaire dépend à la fois la rigidité du substrat et de la composition ECM. (D) Quantification des valeurs racine carrée moyenne de stress de traction sur des substrats de module de Young 30 kPa et 4 kPa pour le collagène I (C1), le collagène IV (C4), la fibronectine (FN), et toutes les combinaisons dans les deux sens de ceux protéines ECM. En (B) et (D), les données ont été présentées sous forme de moyenne ± t les -Tests de MEB et étudiantsont été réalisées contre 30 kPa pour chaque combinaison d&#39;ECM avec les valeurs P indiquées pour P &lt;0,05 (*) P &lt;0,01 (**), et P &lt;0,001 (***). Les barres d&#39;échelle sont de 50 um. Ce chiffre a été modifié depuis Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Section </td><td fo:width="1.5in"> Problème </td><td fo:width="1.5in"> Causes possibles </td><td> Solution </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Fabrication de polyacrylamide Substrat. </td><td> Coverglass ne peut pas être retiré de l&#39;hydrogel. </td><td> Surpolymérisation. </td><td> Réduire le temps de polymérisation à &lt;10 minutes (4 W / m 2). Vérifier que crossli UVsortie nker est à portée attendue. </td></tr><tr><td> Une mauvaise polymérisation d&#39;hydrogel de polyacrylamide. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Augmenter le temps de 10 minutes (&gt; 4 W / m 2) de polymérisation. Vérifiez que la sortie de réticulation UV est à portée attendue. </td></tr><tr><td> hydrogels polyacrylamide sont endommagés après le retrait de lamelle. </td><td> hydrogels de polyacrylamide souples sont faciles à endommager. </td><td> Nous observons rendement décroissant hydrogel de fabrication (~ 50%) pour le plus doux (soit 4 kPa) hydrogels en particulier. Manipuler hydrogels doucement et augmenter le nombre de départ pour atteindre le rendement souhaité. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Fabrication de tableaux. </td><td rowspan="2"> Pauvre ou incohérente morphologie du spot. </td><td> fonction de l&#39;humidificateur Incohérence. </td><td> Vérifier que l&#39;humidificateur et RHÉOMÈTRE fonctionnel tout au long de chaque cycle d&#39;impression et de maintenir 65% d&#39;humidité relative. </td></tr><tr><td> Pins coincé dans la tête d&#39;impression ou de sabotged. </td><td> Nettoyez la tête d&#39;impression pour permettre le mouvement de broche libre. broches Nettoyer soigneusement avant ou après chaque cycle d&#39;impression pour éliminer les agrégats de canaux de broches. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Culture cellulaire et test d&#39;exécution. </td><td rowspan="2"> détachement de la cellule ou de mort sur les tableaux après fixation initiale. </td><td> Sursemis et la prolifération excessive. </td><td> Réduire la densité de semis initiale et le temps. Utilisez &quot;maintenance&quot; ou &quot;différenciation&quot; des médias lors de la culture de réseau pour réduire la prolifération cellulaire. </td></tr><tr><td> Libération de toxique acrylamide monomère hydrogel. </td><td> Faire tremper les hydrogels dans dH 2 O pendant au moins 3 jours pour permettre la diffusion / libération de monomère d&#39;acrylamide et de réduire la toxicité cellulaire. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Les cellules ne fixent pas les tableaux. </td><td> -Ensemencement. </td><td> Augmenter la densité de semis initiale et le temps. Utilisez un type plus fortement adhérente de cellules. </td></tr><tr><td> Mauvais dépôt dela matrice ou de l&#39;état de biomolécules. </td><td> Repères propres des particules et des agrégats, confirment les paramètres d&#39;impression, et évaluer détachage des marqueurs fluorescents, par exemple, le dextrane conjugué à la rhodamine. </td></tr><tr><td> Spécificité des interactions cellule-matrice. </td><td> Différents types de cellules adhèrent spécifiquement à certains mais pas d&#39;autres protéines de la MEC. Testez plusieurs protéines ECM différentes avec vos cellules. </td></tr><tr><td> stockage réseau Suboptimal après fabrication. </td><td> Nous recommandons le stockage des tableaux fabriqués nuit à 65% d&#39;humidité relative et de la température ambiante, en partie pour éviter des changements de phase lors de la congélation. L&#39;adhésion cellulaire est sensible à la fois l&#39;humidité, la température et le temps de stockage; assurez-vous que ces paramètres sont compatibles / optimisé pour vos expériences. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Détachement d&#39;hydrogel à partir du substrat de verre au cours de la culture cellulaire. </td><td> Pauvre diapositive nettoyage et silanisation. </td><td> Remplacer les solutions de travail pour le nettoyage de diapositives etsilanisation. </td></tr><tr><td> hydrogel Overdehydrated. </td><td> Ne pas laisser hydrogels déshydratant sur une plaque chauffante pendant plus de 15-30 min. </td></tr><tr><td> 4. Analyse des données. </td><td> La forte variabilité entre les taches et les diapositives répliqués. </td><td> Variabilité dans le tableau de fabrication. </td><td> Vérifiez que les broches et les têtes d&#39;impression sont propres. Confirmer la fonction de l&#39;humidificateur. Visualiser et quantifier place et réseau de qualité en utilisant des marqueurs fluorescents. réseaux de magasins comme recommandé ci-dessus. </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Dépannage.

La différenciation cellulaire est régulée par une foule de facteurs microenvironnement, y compris les propriétés de la composition de la matrice et de matériaux de substrat. Nous décrivons ici une technique utilisant des puces à ADN de cellules en conjonction avec une force de traction au microscope pour évaluer la différenciation des cellules et les interactions cellule-substrat biomécaniques en fonction du contexte microenvironnement.

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

L'objectif général de cette plateforme de microréseau cellulaire est de corréler les mesures de la différenciation cellulaire et des forces de traction en fonction du contexte microenvironnemental. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du génie tissulaire, permettant à la fois des études fondamentales en biologie des cellules souches et l'optimisation de protocoles de différenciation. Les principaux avantages de cette technique incluent son débit, sa capacité à faire varier les indices biochimiques et biomécaniques, ainsi que ses lectures finales par immunofluorescence et microscopie de forces de traction, ou TFM.Bien que ces méthodes aient été utilisées, celles-ci pouvant être facilement appliquées à d'autres types cellulaires artériels et contextes tissulaires pour les chercheurs comprenant la différenciation des progéniteurs hépatiques. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la réussite expérimentale dépend de l'intégration du protocole de disposition avec des substrats hydrogels de haute qualité et la microscopie de force de traction. Pour fabriquer des hydrogels de polyacrylamide contenant des billes fluorescentes sur une boîte de Pétri de 35 mm à fond en verre silanisé afin d'évaluer en temps réel les interactions cellules-substrat à l'aide de la MFT, préparez d'abord les substrats en verre dans des solutions comme décrit dans le protocole textuel.Placer des boîtes de Pétri de 35 mm à fond en verre silanisé dans un plateau de séchage en verre et pipeter 20 microlitres de solution de prépolymère à initiateur photochimique dans un rapport 9:1 au centre de chaque boîte. Recouvrir délicatement chaque boîte d’un couvre-objet circulaire de 12 mm en évitant la formation de bulles. Afin de répartir les billes fluorescentes à la surface de l’hydrogel, retourner les boîtes et les laisser à température ambiante pendant 20 minutes.En maintenant toujours la boîte en position inversée, exposez-la à une lumière UVA de 365 nanomètres pendant 10 minutes. Ajustez le temps de polymérisation selon les besoins. Ensuite, immergez les hydrogels dans un tampon HEPES 1 M et laissez-les à température ambiante à l’abri de la lumière toute la nuit.Retirer délicatement les lamelles avec un rasoir, en prenant soin de ne pas endommager les hydrogels polymérisés. Déshydrater les hydrogels à 50 degrés Celsius sur un bloc chauffant jusqu'à complète dessiccation. Les hydrogels peuvent être conservés à température ambiante à l'abri de la lumière pendant trois mois.Préparez les tampons pour imprimer les biomolécules et pour la plaque source comme décrit dans le protocole écrit. Après avoir chargé les pointes propres comme indiqué dans le protocole écrit, préparez le microdispenseur et programmez-le à l’aide du logiciel du fabricant. Ensuite, allumez l’unité d’humidification.Régler le point de consigne à 65 % d'humidité relative et attendre que le rhéomètre atteigne ce point de consigne. Placer la plaque source dans l'adaptateur approprié. Puis insérer les substrats hydrogels déshydratés dans l'adaptateur adéquat.Régler les paramètres du programme afin de refléter précisément la configuration de la plaque source, la conception du réseau et le format souhaité. Démarrer la fabrication du réseau. Vérifier au moins une fois par heure que l'humidité relative n'est pas descendue en dessous de 65 % et que les pointes ne sont pas obstruées.Si l'humidité a chuté de manière inattendue, interrompez le pipetage pour remplir l'humidificateur et évacuer la condensation des tubes associés. Si les pointes sont bouchées, interrompez le pipetage pour nettoyer les pointes ou les remplacer par des pointes préalablement nettoyées. Une fois le programme terminé, placez les matrices fabriquées dans une boîte à lames ou dans une microplaque recouverte de papier d'aluminium.Laisser les puces à température ambiante et à 65 % d'humidité relative pendant la nuit. Selon notre expérience, les difficultés les plus fréquentes sont liées à la fabrication des puces. Nous recommandons de vérifier la qualité technique et la robustesse des puces fabriquées à l'aide de molécules marquées au fluorochrome, de colorations générales des protéines et d'immunofluorescences.Le jour suivant la fabrication, immergez le réseau dans des boîtes de Pétri de 35 mm contenant 3 mL de pénicilline-streptomycine à 1 % volume par volume dans du PVS. Exposez les substrats disposés en réseau à la lumière UVC pendant 30 minutes. Ensuite, remplacez la solution de pénicilline-streptomycine par du milieu de culture cellulaire.Après avoir collecté et compté les cellules, ensemencez-les sur les matrices à raison de 3 mL par boîte de Pétri de 35 mm. Incubez les cultures sur matrices à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant deux à 24 heures, ou jusqu'à la formation d'îlots cellulaires bien peuplés. La densité d'ensemencement et la durée peuvent être ajustées en fonction des cellules et de l'application spécifique.Après avoir permis la formation d'îlots cellulaires, laver les cultures sur puces deux fois avec 3 mL de milieu de culture cellulaire préchauffé. À ce stade, les contrôles appropriés et les traitements d'intérêt peuvent être ajoutés au système biologique. Changer le milieu des puces tous les un à deux jours afin de maintenir la concentration des traitements éventuels.Entre un et cinq jours après l'initiation des cultures sur réseau, effectuez une évaluation en temps réel des interactions entre les cellules et le substrat à l'aide de la microscopie de force tractionnelle (TFM). Transférez les boîtes de Pétri de 35 mm contenant les cultures sur réseau vers un microscope fluorescent inversé équipé d'une chambre d'incubation et d'un plateau robotisé pour les mesures de TFM. Dans une boîte, repérez les positions et les plans de focalisation des îlots cellulaires individuels à l'aide de la microscopie en contraste de phase.Passez à la microscopie de fluorescence en lumière rouge éloignée pour visualiser les billes. Ensuite, retournez à chacune des positions enregistrées à l'étape précédente et corrigez la coordonnée z du plan de mise au point, de sorte que seule la première couche de billes située sous l'îlot cellulaire soit nette. Enregistrez les nouvelles coordonnées et passez à l'acquisition automatisée d'images de tous les îlots cellulaires afin de capturer les images de contraste de phase et de fluorescence en lumière rouge éloignée préalables à la dissociation.Ensuite, ajoutez soigneusement 150 microlitres de solution BSA/SDS dans la boîte et attendez cinq minutes pour permettre une dissociation complète des cellules du substrat. Surveillez la dissociation cellulaire à l’aide de la microscopie en contraste de phase. Une fois que les îlots cellulaires ont été dissociés du substrat, retournez aux positions marquées et vérifiez que la première couche de billes est toujours au point. Si ces billes sont hors du plan en raison d'une déformation induite par la traction générée par la cellule, corrigez la coordonnée z du plan focalisé afin qu'elles soient à nouveau au point. Enregistrez les coordonnées z corrigées et répétez l'acquisition d'images automatisée de toutes les îlots pour capturer les images fluorescentes en rouge éloigné après dissociation. Répétez ces étapes pour les autres boîtes.Les ligands de la voie Notch conjugués à la protéine A/G, jagged un et delta comme un, ont montré une rétention améliorée dans les hydrogels. La présentation des ligands de la voie Notch a également induit la différenciation de progéniteurs hépatiques vers un destin de cellule de canal biliaire, comme en témoigne la présence du marqueur vert des cellules des canaux biliaires. La réponse aux ligands de la voie Notch a été quantifiée pour cinq protéines de la matrice extracellulaire, ou MEC, et a montré que la réponse des progéniteurs hépatiques aux ligands dépend du contexte de la MEC.L'ARNi en épingle à cheveux a été utilisée pour générer des progéniteurs dépourvus des ligands delta comme un et jagged un. Les cellules ont ensuite été exposées aux ligands notch jagged un, delta comme un et delta comme quatre. La réponse au ligand notch disposé en réseau variait selon l'expression intrinsèque de l'un ou l'autre ligand dans la cellule.Ces images montrent la différenciation des progéniteurs hépatiques dépendant à la fois de la rigidité du substrat et de la composition de la MEC. Une analyse quantitative a révélé que le collagène IV favorise la différenciation sur des substrats mous comme rigides, tandis que la fibronectine ne soutient la différenciation que sur des substrats rigides. Des cartes thermiques représentatives suggèrent qu'une contrainte de traction prolongée à faible rigidité du substrat sur le collagène IV favorise la différenciation en cellules des canaux biliaires.Cette observation a été confirmée par la quantification des valeurs moyennes quadratiques moyennes des contraintes de traction. Cette vidéo et le protocole associé ont décrit les étapes principales pour la fabrication de gels hydrogels et de réseaux afin de réaliser des cultures cellulaires sur des substrats en réseau et pour mesurer les interactions cellules-substrat à l'aide de la microscopie des forces de traction. Une fois les techniques maîtrisées, chaque expérience peut être réalisée en aussi peu qu'une à deux semaines si elle est effectuée correctement.Contrairement à cette méthode, les cultures cellulaires doivent être utilisées pour valider les conditions performantes du tableau à l’aide de PCR qualitative, de transfert immunoblot, d’axes mécanobiologiques à l’échelle standard ou d’autres techniques complémentaires de biologie moléculaire. Cette plateforme polyvalente peut être appliquée à l’analyse à haut débit des fonctions cellulaires dans un large éventail de contextes cellulaires et tissulaires, notamment la différenciation des cellules souches et la biologie des cellules cancéreuses.

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