Name: Generazione di IPSC-derivati cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Scopri come generare organoidi cerebrali umani derivati da iPSC per modellare disturbi neurodevelopmentali precoci come la microcefalia. Questo metodo robusto offre risultati riproducibili per studiare la neurogenesi.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Siamo grati alla struttura del tessuto embedding e la struttura di base del microscopio di CMMC. Siamo grati per le discussioni e il supporto tecnico forniti dai membri del Laboratorio per Centrosome e citoscheletro Biology. Ringraziamo Li Ming Gooi per la correzione delle bozze del manoscritto.

1. Generazione di Brain organoidi (23 giorni) <ol><li> Avvio di neuroectoderma (5 giorni) Nota: I seguenti punti dovrebbero essere considerati prima dell&#39;inizio della differenziazione. Il metodo riprogrammazione (ecc lentiviral-, basata microRNA Sendai-virus-, episomal-, o) per ottenere iPSCs umani dovrebbe essere idealmente la stessa per tutti i pazienti e controllare linee IPSC. Vari kit e le istruzioni sulla base di protocolli pubblicati riprogrammazione sono disponibili 15, 16, 17, 18. La qualità delle linee IPSC umani è la chiave per realizzare una differenziazione ottimale. Monitorare colonia e la morfologia delle cellule con un microscopio e convalidare pluripotency testando l&#39;espressione di marcatori come Oct3 / 4, Nanog, o TRA-1-60. <ol><li> iPSCs cultura umani in condizioni di assenza di alimentazione di mezzo A su un piatto rivestito con Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matrice. NOTA: Grow iPSCs umane e di mantenere una condizione di cultura definita e per evitare un ulteriore passo per la rimozione di cellule feeder embrionali di topo (MEF) prima dell&#39;inizio della differenziazione senza siero privo di alimentatore. Il numero di passaggio ottimale per iPSCs umani per iniziare intervalli differenziazione dal passaggio 15 sulla riprogrammazione del passaggio 70 in totale. Quando passaging, staccare colonie hiPSC come cellule aggregato utilizzando una soluzione distacco cellulare appropriata con ridotte sollecitazioni meccaniche e una pipetta sierologica 2 mL per trasferire aggregati ad un nuovo piatto. Evitare di dissociazione di singole cellule, in quanto questo potrebbe indurre la differenziazione ed apoptosi nelle maggior parte delle linee IPSC. E &#39;stato riferito che a lungo termine, passaging unicellulare potrebbe aumentare alterazioni genomiche in iPSCs umano 19, 20. Evitare procedure distacco delle cellule, che richiedono una fase di centrifugazione per rimuovere la soluzione distacco, in quanto ciò riduce la vitalità complessiva di iPSCs. Testtutte le culture di contaminazioni microbiche, in particolare micoplasma, su base regolare, poiché questo potrebbe alterare la qualità delle iPSCs e la loro capacità di differenziazione. <ol><li> Cappotto 60 millimetri di tessuto coltura piatto con matrice EHS secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Scongelare un&#39;aliquota di 1 x 10 6 iPSCs umani. Seme i iPSCs in un 60-mm piatto di coltura di tessuto rivestito in matrice EHS e contenente 5 ml di terreno A (vedere la Tabella Materials). Cambiare la media giornaliera e il passaggio dopo 5 a 7 giorni in cui le cellule raggiungono ~ 80% di confluenza. NOTA: Passaggio le iPSCs scongelati a 80% di confluenza con metodi standard, come il distacco privo di enzimi di colonie 21, almeno una volta prima di iniziare la differenziazione. In breve, rimuovere il terreno COPSI, lavare le cellule una volta con pre-riscaldato 37 mezzo di Eagle modificato di Dulbecco ° C: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), e incubare i iPSCs seguendo il produttoreistruzioni utilizzando il reagente A (vedere la tabella materiali). Non superare il tempo di incubazione consigliato al fine di evitare la dissociazione di singole cellule. iPSCs umani dovrebbero essere staccati e galleggianti come aggregati, cellule non come singoli. Possono poi essere trasferite in EHS piatti matrici rivestite; per esempio, COPSI aggregati da un piatto di 60 mm può essere distribuito a 4 nuovi piatti 60 mm. </li><li> Verificare la presenza di micoplasma con un kit di rilevamento micoplasma secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare iPSCs solo libero-Mycoplasma, come micoplasma può alterare la capacità di differenziazione dei iPSCs. </li></ol></li><li> Dissociare iPSCs (80% confluenti) e preparare una sospensione singola cella utilizzando reagente B. <ol><li> Lavare le iPSCs una volta con pre-riscaldato (37 ° C) DMEM / F12. </li><li> Aggiungere preriscaldata reagente B (ad esempio, 1 ml in piastre da 60 mm) e incubare le iPSCs per 5 min a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Flick 20 volte con un dito sulla parte inferiore eil piatto permette il distacco dei iPSCs. Controllare per il distacco delle cellule sotto il microscopio. </li><li> Pipetta la sospensione cellulare su e giù nel piatto 5 volte con una micropipetta 1 mL. </li><li> Aggiungere 3 ml di terreno A diluire 1 ml di reagente B e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml. </li><li> girare con cautela l&#39;iPSCs (500 xg) per 4 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di terreno B e contare il numero di cellule con un emocitometro. NOTA: Essere consapevoli di utilizzare unico mezzo per B risospensione. Evitare l&#39;uso medio A, in quanto contiene una troppo elevata concentrazione di bFGF, che potrebbe inibire la differenziazione. </li></ol></li><li> Diluire la sospensione cellulare di 4,5 x 10 5 cellule per ml in terreno B supplementato con 10 pM rho associata inibitore della proteina chinasi (Y-27632). </li><li> Aggiungere 100 microlitri per pozzetto in un non-aderenti, v-bottom, piastra da 96 pozzetti. NOTA: Assicurarsi che le celle sono equamente distribuiti nel suspensione agitando la provetta ogni volta prima di estrarre porzioni 100 microlitri. È importante che ogni pozzetto deve contenere un numero di cellule equivalente per ottenere neurosfere omogenee in dimensione e forma (tonda, superfici definite). </li><li> Girare delicatamente la piastra con le cellule a 500 xg e temperatura ambiente per 3 min e incubare a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Cambiare la media giornaliera, eliminando 50 microlitri e l&#39;aggiunta di 50 ml di mezzo fresco B in tutti i pozzetti per i prossimi 5 giorni. </li></ol></li></ol> 2. Incorporare Neurosfere a EHS Matrix (4 giorni) <ol><li> Preparare mezzo neurosfere miscelando il seguente: 1: 1 miscela di DMEM / F12 e media C (v / v), 1: 200 (v / v) integratore 1, 1: 100 (v / v) integratore 2 senza (w / o) La vitamina A, 1: 100 L-glutammina, 0,05 mM aminoacidi non essenziali (MEM), 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 1,6 g / L di insulina, e 0,05 mM β-mercaptoetanolo. </li><li> Raccogliere il neurosfere ingegnoah 200 microlitri micropipetta con una punta ~ 2 millimetri precedentemente tagliato con forbici sterili. </li><li> Posizionare i neurosfere circa 5 mm distanti sulla pellicola paraffina (3 x 3 cm 2) in un piatto vuoto 100 mm e rimuovere con attenzione tanto del mezzo rimanente come possibile. </li><li> Aggiungere una goccia (7 mL) di matrice EHS su ogni singola neurosfere. </li><li> Incubare la matrice EHS gocce con le neurosfere per 15 minuti in un incubatore. </li><li> Lavare le neurosfere con attenzione dal film di paraffina da vampate di calore con il mezzo neurosfere. Per lavare, utilizzare una micropipetta 1 ml e un nuovo 100 millimetri Petri contenenti 10 ml di terreno neurosfere. </li><li> Incubare le neurosfere per i prossimi 4 giorni e aggiungere 2 ml di terreno neurosfere fresco il giorno 2. NOTA: Assicurarsi che gli scaffali in incubatrice sono piatte in modo che i EHS neurosfere matrice-incorporato non ammassarsi su un lato del piatto. </li></ol> 3. organoidi in una sospensione RotaryCultura (14 giorni) <ol><li> Preparare cervello medio organoide miscelando il seguente: 1: 1 miscela di DMEM / F12 e media C (v / v), 1: 200 (v / v) integratore 1, 1: 100 (v / v) integratore 2 w / o vitamina A, 1: 100 L-glutammina, 0,05 mM MEM, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 1,6 g / L di insulina, 0,5 uM dorsomorphin, 5 pM SB431542, e 0,05 mM β-mercaptoetanolo. </li><li> Aggiungere 100 ml di cervello organoide mezzo a ciascuna beuta trottola attraverso i suoi bracci laterali e metterli in un incubatore per pre-riscaldamento per almeno 20 min. </li><li> Impostare un programma di agitazione a 25 giri al minuto, secondo le istruzioni del produttore. NOTA: Prima di trasferire le neurosfere matrice-embedded EHS in fiasche filatore, accertarsi che siano tutti separati. Se due o più sono collegati attraverso matrice EHS, separarli tagliando la matrice di collegamento con un bisturi. </li><li> Trasferire accuratamente le neurosfere matrice-embedded EHS in fiasche filatore contenenti 100 ml di terreno organoide noiing una pipetta sierologica 2 ml. Utilizzare i bracci laterali del pallone filatore per trasferire i neurosfere nel pallone. </li><li> Posizionare i contenitori filatore su una piattaforma di agitazione magnetica in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2; questo è il giorno 0 della cultura organoide. </li><li> Modificare la media una volta alla settimana (o più spesso quando c&#39;è un cambiamento di colore), eliminando la metà del mezzo e aggiungendo la stessa quantità di terreno fresco. NOTA: Quando si riprendono i palloni filatore fuori dell&#39;incubatore, attendere 3-5 minuti per consentire le organoidi affondare fino al fondo del pallone. Rimuovere il supporto posizionando la punta di vetro pipetta (collegato ad una pompa) sulla superficie del liquido; aspirare il mezzo attenzione attraverso un&#39;apertura laterale / braccio del pallone. Queste manipolazioni devono essere eseguite sotto il cofano laminare. </li></ol> 4. Analisi di cervello organoidi <ol><li> Fissazione di organoidi <ol><li> Raccogliere le organoidi il giorno 14 del pallone filatore cultura with un taglio 1 micropipetta mL (taglio ~ 5 mm). Mettere tutti in piastre da 60 mm e lavare una volta con 5 ml di caldo DMEM / F12 per 3 min. </li><li> Preparare una provetta da 1,5 ml con 500 ml di caldo 4% paraformaldeide (PFA). Attenzione: Indossare pelle e protezione per gli occhi e il lavoro sotto una cappa di sicurezza durante la manipolazione PFA fissativo. </li><li> Collocare ogni organoide separatamente in ciascun tubo e correggerli per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Non fissare le organoidi per più di 60 min. Per spostare i organoidi, utilizzare un ciclo inoculazione o qualsiasi altro escogitare che è conveniente. </li><li> Rimuovere il PFA e lavare i organoidi fissati due volte per 10 minuti ciascuno con 1 ml di PBS. </li><li> Memorizzare i organoidi in 1 ml di PBS a 4 ° C fino a 7 giorni, fino ad ulteriore utilizzo. </li></ol></li><li> Incorporare le organoidi per criosezionamento <ol><li> Rimuovere il PBS e aggiungere 1 ml di 30% di saccarosio in soluzione acqua distillata per provetta a disidratare le organoidi prima di loro cryofreezing; dopo l&#39;aggiunta di Sucrosoluzione se le organoidi dovrebbe essere galleggiante in superficie. Conservare le organoidi durante la notte in soluzione di saccarosio a 4 ° C; il giorno dopo, i organoidi dovrebbero hanno affondato fino al fondo della provetta. NOTA: organoidi possono essere conservati per un massimo di 3-5 giorni a 4 ° C in soluzione di saccarosio, se necessario. </li><li> Riempire uno stampo vinile campione con 400 ml di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e utilizzare un ciclo inoculazione di effettuare un organoide al centro dello stampo. Etichettare il bordo dello stampo con il nome del campione. </li><li> Congelare lo stampo organoide contenente a -80 ° C fino criosezionamento. </li><li> cryoslides vetro cappotto con 0,1% di soluzione di lisina poli-l-(PLL) in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente e lasciate asciugare i vetrini per 3 h. Conservare i campioni a 4 ° C e caldo fino a camera temperato prima dell&#39;uso. NOTA: PLL-rivestimento è un passo importante, poiché impedisce le fette organoide dal galleggiante via. Raccogliere e conservare soluzione PLL a 4 ° C fino a 3mesi. Prima di riutilizzo, filtrare con una siringa 0,22-micron e farlo riscaldare a temperatura ambiente. </li><li> Organoidi sezione cryofrozen in 20-50 fette um di spessore su vetro PLL rivestite cryoslides 22. Lasciate che i vetrini con sezioni asciugare per 1 ora a temperatura ambiente. Conservare le sezioni a -80 ° C fino ad ulteriore trasformazione. </li></ol></li></ol> 5. immunofluorescenza colorazione di sezioni organoide NOTA: Per la caratterizzazione generale della organoidi, colorazione con nestina, un marker progenitore neuronale, e TUJ1, un marker pan-neuronale, è raccomandato. Come esempi aggiuntivi, immunofluorescenza con fosfo-Vimentin (p-Vim), le etichette mitotiche apicali cellule gliali radiali, e Arl13b, per ciglia, sono descritti. Per testare l&#39;apoptosi, utilizzare il test Terminal deossinucleotidil transferasi (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL). Porre i vetrini in una scatola di plastica durante le incubazioni per proteggerli da polvere, luce,e l&#39;essiccazione. <ol><li> Scongelare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte con 200 microlitri di PBS-glicina (0,225 g di glicina in PBS) per 3 min per estinguere l&#39;autofluorescenza PFA-indotta. </li><li> Permeabilize sezioni con 200 microlitri di 0,5% Triton X100 / 0,1% Tween in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> lavarli due volte con 200 microlitri di soluzione di PBS-glicina per 3 min. </li><li> incubare con 200 ml di 0,5% gelatina di pesce / 0,1% Triton X100 in PBS per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C per bloccare l&#39;antigene legame aspecifico. NOTA: Se è richiesto un saggio di TUNEL, eseguire il test come da protocollo del produttore. Iniziare con il saggio TUNEL prima di eseguire l&#39;immunocolorazione, come potrebbe interferire con anticorpi secondari e spegnere fluorofori quando utilizzati in seguito. </li><li> Diluire gli anticorpi nel bloccare soluzione alle seguenti concentrazioni: nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01:20; e anticorpi secondari, 1: 1000. </li><li> Incubare con 200 microlitri del primo anticorpo primario (per esempio, nestina) per 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare 3 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco. </li><li> Diluire il primo (anti-topo 488) anticorpo secondario 1: 1.000 in soluzione bloccante e incubare il vetrino in 200 microlitri per 1-2 ore a temperatura ambiente. D&#39;ora in poi, proteggere sempre le diapositive dalla luce. </li><li> Lavare 3 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco. </li><li> Incubare con 200 microlitri della successiva anticorpo primario (per esempio, TUJ1) per 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare 3 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco. </li><li> Aggiungere 200 microlitri della prossima anticorpo secondario (anti-coniglio 647) per 1-2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 x 3 min. con 200 microlitri di soluzione di blocco. </li><li> Aggiungere 200 ml di 4&#39; , 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ad una nM conc 30entration in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente per colorazione nucleare. </li><li> Lavare 2 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco. </li><li> Lavare 1 x 1 min con 200 ml di acqua distillata e lasciare che le sezioni asciugare per 10-20 minuti, fino a quando non goccia d&#39;acqua ovvia è più visibile. </li><li> Montare le sezioni con mezzo di inclusione. Conservarli al riparo dalla luce a 4 ° C per un massimo di diverse settimane. </li><li> Procedere con l&#39;analisi microscopica all&#39;immagine una panoramica, zona organoide ventricolare, corticale primitivo, e altre aree di interesse. </li><li> Utilizzare un microscopio confocale con un olio 63X filtri obiettive e fluorescenti, scelti in base alle anticorpi secondari colorante fluorescente-tag utilizzati 1, 10. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

MCPH è un disordine dello sviluppo neurologico umana complessa che non può essere ricapitolato in modelli animali in vivo o in cultura semplici cellule umane in vitro si avvicina. La manifestazione clinica della MCPH comincia ad apparire durante il primo trimestre, quando comincia presto neurogenesi. Così, organoidi cerebrali in 3D rappresentano un sistema sperimentale affidabile per modellare lo sviluppo MCPH. Inoltre, 3D organoidi cervello umano sono un approccio ideale in quanto i) che consentono l&...

disturbi dello sviluppo neurologico umana, come la microcefalia, possono essere studiate solo male in modelli animali a causa del fatto che il cervello umano ha una superficie corticale estesa, una caratteristica unica diversa da animali non umani. Questo aspetto rende lo sviluppo del cervello umano un processo complesso che non può essere studiato sufficientemente in 2D, nel sistema di coltura cellulare in vitro. Emergenti tecniche di coltura 3D consentono la generazione di organoidi tessuto simile da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). La differenziazione in vitro di cellule staminali pluripotenti in coltura in sospensione 3D permette la formazione di vari tipi di cellule in un modo tempestivo e regione specifica, dando origine ad un organizzato, tessuto stratificato 1, 2, 3. Grazie a laboratori che pionieri tecnologie di coltura 3D e demistificato la complessità della formazione degli organi, partendo da cellule staminali,abbiamo sviluppato un metodo robusto di generare organoidi cerebrali delineare eventi precoci di sviluppo del cervello umano e modellare microcefalia in vitro 1, 2, 3. È da notare che abbiamo adattato il metodo originale sviluppato da Lancaster et al. generare organoidi cerebrali 1. Questo metodo è stato modificato in base alle nostre esigenze sperimentali. L&#39;obiettivo di uno studio da Gabriel et al. sia per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari della neurale mantenimento delle cellule staminali durante lo sviluppo cerebrale. Per fare questo, uno studio meccanicistico è stato effettuato analizzando le cellule progenitrici neurali (NPC) in organoidi cervello 3D derivate da un paziente microcefalia 4. Questo paziente portava una mutazione in CPAP, una proteina conservata centrosomica richiesto per la biogenesi centrosome 5. Una crisi ipoglicemica ampiamente accettatatesi è che microcefalia è il risultato di una deplezione del pool NPC, e questo potrebbe essere dovuto sia a morte cellulare o alla differenziazione precoce 1, 6, 7, 8, 9. Analizzando le zone ventricolari (VZS) di organoidi cerebrali microcefalia, è stato dimostrato che un numero significativo di NPC subisce divisione cellulare asimmetrica, a differenza organoidi cerebrali derivate da un donatore sano 4. Ampie analisi microscopiche e biochimiche del cervello organoidi microcefalia hanno rivelato un ruolo inaspettato per CPAP in tempo utile lo smontaggio cilia 4. Specificamente, CPAP mutato è associato ritardato smontaggio cilium e ritardata ciclo cellulare rientro, porta alla differenziazione precoce di NPC 4. Questi risultati suggeriscono un ruolo per cilia in microcefalia e THcoinvolgimento EIR durante la neurogenesi e le dimensioni del cervello di controllo 10. La prima parte di questo protocollo è una descrizione di un metodo in tre fasi per generare organoidi cerebrali omogenei. Come accennato prima, il protocollo Lancaster originale è stato adattato e modificato per soddisfare il nostro scopo 1. In primo luogo, iPSCs umani sono coltivate in una condizione priva di alimentazione definita sulla matrice Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Questo passaggio evita le variazioni di colture di cellule staminali pluripotenti alimentatore-dipendente. In questo protocollo, l&#39;induzione della differenziazione neurale per formare epitelio neurale parte direttamente dal iPSCs. Saltando la fase di formazione del corpo embrioide (EB), i neurali procede differenziazione in maniera più controllata e diretta. Questo approccio limita la formazione spontanea e non orientato di altri strati di cellule germinali, come mesoderma e endoderma. Applicando questo protocollo, neurosfere contenenti rosette neurali possono essere raccolte il giorno 5 per EHS matrice incorporamento e coltura in sospensione stazionario. Il mezzo organoide utilizzato per il terzo gradino del nostro protocollo è completato con dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin è un inibitore della piccola molecola di proteina morfogenica ossea (BMP), e inibisce la SB431542 / activin / via di segnalazione nodale TGFp. La combinazione di questi fattori potrebbe promuovere la differenziazione neuronale più efficiente rispetto all&#39;acido retinoico solo 11, 12, 13, 14. Complessivamente, queste modifiche consentono la generazione riproducibile di organoidi cerebrali, con variazioni minime attraverso organoidi. È importante sottolineare che questo metodo è stato applicato per generare robusto organoidi cerebrali microcefalia da iPSCs paziente, che portano le mutazioni nei geni che influiscono centrosomi e dinamiche del ciclo cellulare. La seconda parte di questo protocollo fornisce le istruzioni per preparare brain organoidi per l&#39;analisi e l&#39;interpretazione dei difetti cellulari in microcefalia. Questo include la fissazione, criosezionamento, colorazione di immunofluorescenza e analisi al microscopio confocale. Questo protocollo fornirà al lettore una descrizione dettagliata dei risultati attesi e con la guida per l&#39;interpretazione.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>anticorpo secondario anti-topo di capra (H + L), Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-coniglio 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B anticorpo policlonale di coniglio.</td></tr><tr><td>Sistema CELLSPIN</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato; fornitori multipli</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, US</td><td>31331093</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Miscela di nutrienti F-12&nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>Composto C; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Terreno di inclusione</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; terreno di inclusione; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Matrice Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Matrice</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC-qualificata; importante: gelatina</td></tr><tr><td>di pesce qualificata hESC&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>G7765-250ML</td><td>Gelatina da pelle di pesce d'acqua fredda; fornitori multipli; autoclave dopo l'aggiunta a PBS per sciogliere e sterilizzare, conservare a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Glicina per la biologia molecolare; fornitori multipli&nbsp;</td></tr><tr><td>Ansa di inoculazione con ago, monouso (1 & micro; L)</td><td>Sigma Aldrich, Stati Uniti</td><td>BR452201-1000EA</td><td>fornitori multipli&nbsp;</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I3536-100MG</td><td>fornitori multipli</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco, US</td><td>25030081</td><td>L-glutammina (200 mM)</td></tr><tr><td>Tecnologie delle cellule staminali</td> <td>del mezzo A</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (hiPSC medium)</td></tr><tr><td>Medium B</td><td>cell technologies</td><td>#05835</td><td>Medium induction medium (NIM); mezzo di differenziazione neurale</td></tr><tr><td>Medium C</td><td>Gibco, US</td><td>21103049</td><td>Neural Basal Medium</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, US</td><td>11140035</td><td>MEM soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)</td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza, Svizzera</td><td>#LT07-218</td><td>Kit di rilevamento del micoplasma; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin anticorpo monoclonale di topo (4D11)</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>4% in PBS, soluzione di stoccaggio a -20 gradi C; Attenzione: indossare protezioni per la pelle e gli occhi e lavorare sotto il cappuccio&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS compresse</td><td>Gibco, Stati Uniti</td><td>18912014</td><td>Vedere produttore istruzioni; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, US</td><td>15140122</td><td>Fornitori multipli</td></tr><tr><td>Soluzione di poli-L-lisina (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>Fornitori multipli</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Fosfo-Vimentina (Ser55)</td></tr><tr><td>mAb Reagente A&nbsp;</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td># 05872</td><td>Nota al protocollo 1.1.1.2; ReLSR (reagente per la selezione e il passaggio di cellule ES e iPS umane prive di enzimi); Si prega di seguire manufactorer&acute; s protocollo; prodotti alternativi da più fornitori disponibili</td></tr><tr><td>Reagente B&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>A6964-100ML</td><td>La soluzione Accutase è una soluzione enzimatica per la dissociazione di singole cellule; fornitori multipli; protocollo 1.1.2 "soluzione di dissociazione cellulare enzimatica" &nbsp;</td></tr><tr><td>Ricerca Criostato Leica CM3050 S Leica</td><td>biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Fornitori multipli</td></tr><tr><td></td><td>SB431542 Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>Fornitori multipli</td></tr><tr><td>Pallone rotante 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>Fornitori multipli</td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus vetrini per microscopio</td><td>Thermo scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>I vetrini devono essere etichettati con un "+" e caricati positivamente</td></tr><tr><td>Integratore 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>Integratore N-2 (100x)</td></tr><tr><td>Integratore 2 senza vitamina A</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>integratore B-27 (50x), meno vitamina A; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>Fornitori multipli</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>Fornitori multipli</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>Fornitori multipli</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&beta;-Tubulin III (policlonale di coniglio)</td></tr><tr><td>TUNEL assay</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Tween 20 per biologia molecolare</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Fornitori multipli</td></tr><tr><td>foglio impermeabile</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilm " M&rdquo;; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); fornitori multipli</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Gibco, US</td><td>31350010</td><td>2-mercaptoetanolo (50 mM); fornitori multipli</td></tr></tbody></table>

generazione di ipsc-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

La limitata disponibilità di modelli in vitro adatti che possano rappresentare in modo affidabile lo sviluppo complesso del cervello umano è un collo di bottiglia significativo che limita la traduzione della ricerca di base sul cervello in applicazioni cliniche. Mentre le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno sostituito le cellule staminali embrionali umane eticamente discutibili, gli studi di differenziazione neuronale basati su iPSC rimangono descrittivi a livello cellulare, ma non riescono a fornire adeguatamente i dettagli che potrebbero essere derivati da un complesso tessuto cerebrale umano 3D. 
Questa lacuna è ora colmata attraverso l'applicazione di organoidi cerebrali 3D derivati da iPSC, "Brains in a dish", che modellano molte caratteristiche del complesso sviluppo del cervello umano. Qui viene descritto un metodo per generare organoidi cerebrali 3D derivati da iPSC. Gli organoidi possono aiutare a modellare la microcefalia primaria autosomica recessiva (MCPH), un raro disturbo dello sviluppo neurologico umano. Una spiegazione ampiamente accettata per la malformazione cerebrale nella MCPH è un esaurimento del pool di cellule staminali neurali durante le prime fasi dello sviluppo del cervello umano, un difetto di sviluppo difficile da ricreare o dimostrare in vitro. 
Per studiare l'MCPH, abbiamo generato iPSC da fibroblasti derivati da pazienti portatori di una mutazione nella proteina centrosomica CPAP. Analizzando la zona ventricolare degli organoidi cerebrali 3D della microcefalia, abbiamo dimostrato la differenziazione prematura dei progenitori neurali. Questi organoidi cerebrali 3D sono un potente sistema in vitro che sarà determinante nella modellazione di disturbi cerebrali congeniti indotti da sostanze chimiche neurotossiche, infezioni virali neurotrofiche o mutazioni genetiche ereditarie.

La generazione di organoidi cerebrali richiede almeno tre settimane di coltura continua (Figura 1A). Per ottenere risultati riproducibili, è consigliabile che il ricercatore documenta ogni passo e, soprattutto, evita alcuna modifica per quanto riguarda i componenti di media, punti di tempo, e la manipolazione delle cellule. Qui, diamo una sintesi di come valutare se le tappe critiche sono raggiunti al fine di ottenere organoidi di qualità sufficiente alla fine dell&#39;e...

La modellazione dello sviluppo del cervello umano è stata ostacolata a causa della complessità senza precedenti del tessuto epiteliale neurale. Qui viene descritto un metodo per la generazione robusta di organoidi cerebrali per delineare gli eventi precoci dello sviluppo del cervello umano e per modellare la microcefalia in vitro.

Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

L'obiettivo generale di questo protocollo per la generazione di organoidi cerebrali umani derivati da iPSC è modellare i disturbi neurosviluppali umani precoci. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo del cervello umano, come il ruolo dei sintesomi e delle ciglia nella neurogenesi e nella microcefalia primaria. Il principale vantaggio di questa tecnica è che rappresenta un modello solido e rapido per ottenere risultati riproducibili da organoidi cerebrali derivati da iPSC di pazienti.La procedura sarà dimostrata da Elke Gabriel, una ricercatrice post-dottorato del mio laboratorio presso il Centro di Medicina Molecolare di Colonia. Per iniziare questa procedura, raccogliere le neurosfere con una micropipetta da 200 microlitri utilizzando una punta da due millimetri precedentemente tagliata con forbici sterili. Successivamente, posizionare le neurosfere a circa cinque millimetri di distanza l'una dall'altra su un film di paraffina in una piastra da 100 millilitri.E rimuovere con attenzione la maggior quantità possibile del mezzo residuo. Quindi, aggiungere una goccia di matrice EHS su ciascun neurosfero singolo. Incubare le gocce di matrice EHS con i neurosfere per 15 minuti a 37 gradi Celsius.In seguito, lavare con attenzione le neurosfere dal film di paraffina lavandole con mezzo per neurosfere. Successivamente, incubare le neurosfere per i successivi quattro giorni e aggiungere due millimetri di mezzo fresco per neurosfere al secondo giorno. In questa procedura, aggiungere 100 millilitri di mezzo per organoidi cerebrali a ciascun matraccio agitatore attraverso i bracci laterali.E preriscaldare il mezzo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per almeno 20 minuti. Successivamente, assicurarsi che le neurosfere siano tutte separate. Se due o più sono collegate tramite matrice EHS, separarle tagliando la matrice di collegamento con un bisturi.Impostare un programma di agitazione a 25 giri al minuto. Trasferire con attenzione le neurosfere incorporate nella matrice EHS nei flaconi agitatori contenenti 100 millilitri di mezzo per organoidi. Successivamente, posizionare i flaconi agitatori su una piastra magnetica di agitazione all'interno dell'incubatore per 14 giorni a 37 gradi Celsius.Questo è il giorno zero della coltura di organoidi. Cambiare il mezzo una volta alla settimana rimuovendo metà del mezzo e aggiungendo la stessa quantità di mezzo fresco. In questo passaggio, raccogliere gli organoidi dalla coltura in fiasca agitata al giorno 14 utilizzando una micropipetta da un millilitro pre-tagliata.Mettere tutti in una piastra da 60 millimetri e lavarli una volta con cinque millilitri di DMEM F12 caldo per tre minuti. Successivamente, preparare una provetta da 1,5 millilitri con 500 microlitri di PFA al 4% caldo. Posizionare ogni organoide separatamente in ciascuna provetta e fissarli per 30-60 minuti a temperatura ambiente.In seguito, utilizzare un’ansa di inoculazione per rimuovere gli organoidi. Quindi, rimuovere il PFA e lavare gli organoidi fissati due volte per 10 minuti ciascuna con un millilitro di PBS. Successivamente, conservare gli organoidi in un millilitro di PBS a quattro gradi Celsius per un massimo di 7 giorni per ulteriori utilizzi.Per incorporare gli organoidi per la crio-sezione, rimuovere il PBS e aggiungere 1 millilitro di soluzione di saccarosio al 30% in ogni provetta per disidratare gli organoidi prima della criocongelazione. Dopo l'aggiunta della soluzione di saccarosio, gli organoidi dovrebbero galleggiare sulla superficie. Conservare gli organoidi tutta la notte nella soluzione di saccarosio a quattro gradi Celsius.Entro il giorno successivo, gli organoidi dovrebbero essere affondati sul fondo del tubo. Successivamente, riempire uno stampo per campioni in vinile con 400 millilitri di composto OCT. Utilizzare quindi un’ansa di inoculazione per posizionare un organoide al centro dello stampo.Etichettare il bordo dello stampo con il nome del campione. Successivamente, congelare lo stampo contenente gli organoidi a meno 80 gradi Celsius fino alla criosezione. In seguito, ricoprire le vetrini in vetro con PLL 0,1% in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi, lasciare asciugare i vetrini per tre ore. Conservare i vetrini a quattro gradi Celsius e riscaldarli alla temperatura ambiente prima dell'uso. Successivamente, sezionare gli organoidi congelati in fette spesse da 20 a 50 micrometri sui vetrini criogenici rivestiti con PLL.Lasciare asciugare i preparati per un'ora a temperatura ambiente e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino all'ulteriore elaborazione. Imaging immunofluorescente di organoidi criosezionati che mostrano una zona ventricolare tipica e una placca corticale primitiva. La zona ventricolare si estende dal lato apicale a quello basilare.Si noti che le cellule all'interno della zona ventricolare (VZ) mostrano nuclei disposti in modo simile a un palizzata, suggerendo che si tratti di cellule gliali radiali. Il pannello destro mostra la colorazione immunofluorescente di NPC positive a nestina all'interno della VZ e di neuroni positivi a TUJ1 nella lamina corticale primitiva. Qui sono mostrati due esempi di VZ colorate con PVIM e ARL13B.Le regioni contrassegnate da quadrati bianchi sono ingrandite. Le cellule gliali radiali apicali che si dividono nel lato apicale della zona ventricolare sono positive per PVIM. Il piano di divisione di una cellula in anafase è orizzontale rispetto alla linea della superficie del lume, che è marcata dalla colorazione per ARL 13B.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 23 giorni se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire controlli periodici della qualità e del microplasma sulle colture. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo in neurobiologia per esplorare i meccanismi dello sviluppo neuronale negli organoidi cerebrali umani.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare organoidi cerebrali umani da diverse linee cellulari iPSC, inclusi ceppi cellulari di pazienti con funzioni cellulari compromesse.

generation-ipsc-derived-human-brain-organoids-to-model-early

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Il video dimostra un metodo per generare organoidi cerebrali umani da cellule staminali pluripotenti indotte. Mostra come la neurosfera formi uno strato neuroectodermico, che sopprime la formazione di altri strati germinali. Le neurosfere sono incorporate in una matrice di gel 3D e formano gemme neuroepiteliali. Quando vengono incubate con terreni organoidali, queste gemme neuroepiteliali si differenziano in specifiche regioni cerebrali, con conseguente formazione di organoidi cerebrali maturi.

Un metodo in vitro per generare organoidi cerebrali umani

Questo video mostra un test per generare organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Le iPSC umane sono indotte a formare corpi embrioidi (EB). Gli EB vengono coltivati su un'impalcatura polimerica utilizzando un mezzo di induzione, promuovendo la differenziazione in cellule staminali neurali, cellule progenitrici e neuroni immaturi. Infine, gli EB vengono incorporati in una matrice e trasferiti in un mezzo di mantenimento per la formazione di organoidi cerebrali.

Generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

Organoids cerebrale rappresentano un nuovo modello di sistema di indagare cervello umano sviluppo anticipato in vitro. Questo articolo fornisce la metodologia dettagliata per generare efficientemente omogenei dorsale del forebrain-tipo organoids da cellule staminali pluripotenti indotte umane tra cui passaggi critici di caratterizzazione e convalida.

Generazione di standardizzato e riproducibile del Forebrain-tipo Organoids cerebrale da umani cellule staminali pluripotenti indotte

Questo protocollo è stato generato come mezzo per produrre organoidi cerebrali in modo semplificato e a basso costo senza fattori di crescita esogeni o matrice di membrana seminterrato, pur mantenendo la diversità dei tipi di cellule cerebrali e molte caratteristiche dell'organizzazione cellulare.

Un metodo statico auto-diretto per generare organiidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane

Presentiamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) di sviluppo neocorticale, nonché metodologie complementari che consentono l'analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del cilio primario (PC).

Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale

Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e il loro uso nella modellazione delle malattie mitocondriali.

Generazione di organoidi del cervello umano per la modellazione della malattia mitocondriale

Qui descriviamo un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). Per ottenere organoidi cerebrali in grandi quantità e di alta qualità, utilizziamo mini bioreattori fatti in casa.

Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte in mini bioreattori fatti in casa

In questo studio, forniamo una tecnica dettagliata per un sistema di coltura organoide corticale semplice ma robusto che utilizza colture hPSC standard prive di alimentatore. Questo è un protocollo rapido, efficiente e riproducibile per la generazione di organoidi che modellano aspetti della senescenza cerebrale in vitro.

Generazione robusta e altamente riproducibile di organoidi cerebrali corticali per la modellazione della senescenza neuronale cerebrale in vitro

Presentiamo un protocollo per generare un organoide cerebrale umano con microglia residente incorporando cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) nello sviluppo di organoidi.

Derivazione di un organoide cerebrale umano con sviluppo di microglia

Neurodevelopmental processi come proliferazione, migrazione e neuriti sono spesso perturbati in malattie neuropsichiatriche. Così, vi presentiamo protocolli per in modo rapido e riproducibile valutare questi processi neurodevelopmental in umano iPSC-derivati NPC. Questi protocolli permettono anche di valutare gli effetti di fattori di crescita e di terapeutica sullo sviluppo di NPC.

Rilevamento rapido dei fenotipi di Neurodevelopmental in cellule precursori neurali umane (NPC)

Scopri come generare organoidi cerebrali umani derivati da iPSC per modellare disturbi neurodevelopmentali precoci come la microcefalia. Questo metodo robusto offre risultati riproducibili per studiare la neurogenesi.

Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

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