Name: Mesure de la liaison des protéines à la F-actine par co-sédimentation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Découvrez le test de liaison des protéines à la F-actine par co-sédimentation pour étudier les interactions protéiques en biochimie cellulaire. Cette méthode simple permet de mesurer l'affinité de liaison sans équipement spécialisé.

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Le test de co-sédimentation d&#39;actine est une technique simple qui peut déterminer rapidement si une protéine lie l&#39;actine F. Avec quelques modifications, la technique peut également être utilisée pour mesurer l&#39;affinité de l&#39;interaction. En plus des points soulevés dans le protocole ci-dessus, les problèmes suivants devraient être pris en compte lors de la conception, de la conduite et de l&#39;interprétation de l&#39;analyse. Protéines d&#39;intérêt Des protéines fraîchement préparées ou congelées peuvent être utilisées dans le dosage. Si la protéine congelée est utilisée, il est fortement conseillé de comparer les résultats avec les protéines fraîches (jamais congelées) afin de s&#39;assurer que le gel n&#39;affecte pas la liaison de l&#39;actine F. G-acttin Source De nombreuses expériences de granulation utilisent G-actine isolée du muscle en raison de son abondance relative. Il existe trois isotypes d&#39;actine principaux chez les mammifères - alpha, bêta et gamma - qui sont remarquablement similaires (&gt; 90% de l&#39;identité de séquenceTy). Néanmoins, il existe des différences fonctionnelles entre les isotypes 12 , 13 . Si possible, l&#39;isotype G-actine utilisé dans l&#39;essai de liaison devrait correspondre à l&#39;isotype in vivo . Par exemple, si l&#39;on teste une protéine exprimée dans le muscle squelettique, l&#39;alpha-actine est le meilleur choix; Si l&#39;on examine une protéine exprimée en fibroblastes, la bêta-actine est recommandée. Utilisation de phalloidine Puisque la phalloidine se lie à la F-actine, elle peut interférer ou même bloquer la liaison de certaines protéines de liaison à la F-actine ( p. Ex., La phalloidine bloque la cofiline de se lier aux filaments d&#39;actine) 14 . Ainsi, la phalloidine doit être utilisée avec prudence et les résultats comparés aux échantillons traités avec la non-phalloidine, le cas échéant. Contexte élevé Il n&#39;est pas rare que les protéines sédimentent en l&#39;absence de F-actine ( Figure 1A , pas d&#39;échantillon de pastilles d&#39;actine FS). Cependant, des niveaux élevés de sédimentation de fond peuvent masquer une co-sédimentation d&#39;actine vraie et rendre difficile, sinon impossible, de déterminer si une protéine lie l&#39;actine F ou de mesurer l&#39;affinité de l&#39;interaction. L&#39;ajout de polidicanol au tampon de réaction (étape 4.1) peut réduire considérablement l&#39;arrière-plan et est une solution facile. Si cela ne réduit pas le fond, l&#39;ajustement du tampon de réaction, de la concentration de sel et / ou de la température d&#39;incubation peut aider. Courbe de liaison Pour générer une courbe de liaison, il est nécessaire de faire varier la concentration de la protéine d&#39;intérêt ou de la F-actine sur une série de réactions. En pratique, il est plus facile et préférable de maintenir la F-actine à une concentration fixe et de modifier la concentration de la protéine d&#39;intérêt. Le maintien de la F-actine à une concentration fixe ( par exemple, 2 μM) dans l&#39;essai de granulation limite le piégeage non spécifique à des concentrations plus élevées de F-actine et empêcheDépolymérisation à des concentrations inférieures (&lt;0,5 μM) de F-actine. La dépolymérisation peut être évitée en utilisant la phalloidine, bien que cela crée un facteur de complication potentiel dans le système (voir l&#39;étape 3.3 et plus haut). Le maintien de la F-actine à une concentration fixe permet également de comparer (et de normaliser) la pastille de F-actine à travers les échantillons et d&#39;identifier les expériences échouées ( c.-à-d. Où la pastille de F-actine est très variable, empêchant l&#39;analyse à travers les concentrations). Enfin, le maintien de la F-actine à une concentration fixe permet de déterminer si la liaison au filament d&#39;actine est coopérative ( figure 1C ). Reliure saturée Comme dans toutes les expériences contraignantes, il est essentiel que la liaison à la F-actine soit saturée et que la concentration de protéines plus les plateaux F-acttin ( Figure 1C ). Sans plateau, il n&#39;est pas possible de calculer une constante d&#39;équilibre de dissociation précise. Ainsi, ilEst important de planifier soigneusement la série de dilution à tester et d&#39;inclure toujours des concentrations de protéines plus élevées ( c.-à-d. Au moins 5 à 10 fois supérieures à celles attendues K d ). Analyse contraignante Pour que les constantes de dissociation mesurées soient concluantes, le dosage doit être effectué en utilisant une concentration de F-actine qui permet de déterminer la concentration des sites de liaison sur la F-actine pour que la protéine d&#39;intérêt soit beaucoup plus faible que l&#39;affinité. Pour vérifier si ce critère a été respecté, estimer la concentration des sites de liaison à partir de B max . Par exemple, si [F-actine] était 2 μM et B max = 0,5, alors [sites de liaison] ≈ 1 μM. Le K d devrait être au moins 5 à 10 fois supérieur à [sites de liaison]. Si le K d mesuré est du même ordre de grandeur que [sites de liaison], il est possible que la courbe de liaison observée représente un titrage de liaison à haute affinité siTes plutôt qu&#39;une véritable isotherme contraignant. Si cela est observé, répétez le dosage en utilisant une concentration d&#39;actine F 10 fois plus faible pour mesurer une affinité précise. Pour les interactions de haute affinité, la stabilisation de la phalloidine (étape 3.3) peut être nécessaire pour atteindre une concentration de F-actine suffisamment faible pour mesurer avec précision l&#39;affinité. Enfin, il existe des limites fondamentales avec le dosage de co-sédimentation dont les chercheurs devraient être conscients lors de l&#39;exécution et de l&#39;évaluation du dosage. Plus important encore, le dosage de co-sédimentation ne produit pas une véritable constante d&#39;équilibre. Les produits de liaison ( c.-à-d., Protéine plus F-actine) sont séparés des réactifs pendant la centrifugation, après quoi les produits peuvent alors se dissocier pour créer un nouvel équilibre. En conséquence, le dosage de co-sédimentation peut mal calculer ou échouer à détecter des interactions à faible affinité. Comme de nombreuses protéines liées à l&#39;actine ont une affinité faible ( c.-à-d., Micromolaire) pour l&#39;actine F, un résultat négatif ( <eM&gt; c&#39;est-à-dire, pas de liaison détectable) dans le dosage ne signifie pas nécessairement qu&#39;une protéine ne lie pas la F-actine. En variante, les tests de liaison TIRF à base de microscopie, à simple filament sont plus sensibles et plus précis pour déterminer une constante de dissociation (pour les examens sur cette technique, voir les références 15,16 ). Malgré ces limites, le dosage de granulation est au cœur de la plupart des chercheurs et constitue un outil efficace pour déterminer si une protéine lie l&#39;actine F et pour mesurer l&#39;affinité de l&#39;interaction.

L&#39;actine est une protéine cytosquelette essentielle qui joue un rôle critique dans les processus cellulaires multiples, y compris la motilité, la contraction, l&#39;adhésion et la morphologie 1 . L&#39;actine existe sous deux formes: l&#39;actine globulaire monomérique (G-actine) et l&#39;actine filamenteuse polymérisée (F-actine). Dans les cellules, l&#39;organisation de la F-actine est contrôlée par une grande collection de protéines qui régulent la nucléation, la croissance, la réticulation et le désassemblage des filaments d&#39;actine 2 , 3 , 4 . Cependant, la façon dont les protéines multiples liées à l&#39;actine fonctionnent de concert pour réguler l&#39;organisation du réseau d&#39;actine est encore largement inconnue. La mesure des interactions protéine-protéine est une approche importante pour comprendre comment les protéines exercent leurs effets sur le comportement cellulaire au niveau biochimique. De nombreux tests différents peuvent être utilisés pour détecter les interactions entre les protéines purifiées.Les approches communes pour les protéines solubles comprennent les pull-downs, la polarisation de fluorescence, la calorimétrie de titrage isotherme et la résonance de plasmon de surface. Il est important de noter que tous ces essais nécessitent que les protéines soient solubles et sont donc difficiles à adapter pour une utilisation avec une protéine polymère et filamenteuse telle que la F-actine. Ici, nous décrivons une technique - la co-sédimentation d&#39;actine, ou la granulation, le dosage - pour déterminer si un domaine protéique ou protéique lie l&#39;actine F et mesurer l&#39;affinité de l&#39;interaction. L&#39;essai de granulation d&#39;actine est une technique relativement directe qui n&#39;exige pas d&#39;équipement spécialisé, en dehors d&#39;une ultracentrifugeuse. Tous les réactifs peuvent être fabriqués, en supposant une connaissance de la biochimie de base ou achetés. Une fois que la liaison à l&#39;actine F est établie, le dosage peut être utilisé pour mesurer l&#39;affinité apparente ( c&#39;est-à-dire la constante d&#39;équilibre de la dissociation) 5 . En outre, une fois que l&#39;affinité est établie, l&#39;essai de granulationEst un outil utile pour mesurer comment les changements apportés à la protéine d&#39;intérêt ( p . Ex., Les modifications post-traductionnelles, les mutations ou la liaison au ligand) affectent son interaction avec la F-actine 6 . La technique présente des limites (voir la discussion ) dont le chercheur doit être conscient avant d&#39;essayer le dosage.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifugeuse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d’ultracentrifugation - 0,2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Actine, muscle squelettique de lapin</td><td>Cytosquelette</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Phalloïdine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothréitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine triphosphate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Ethylène glycol-bis(&beta ;-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-acide tétraacétique (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Bleu R-250 Colorant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration bleu colloïdal</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de la liaison des protéines à la f-actine par co-sédimentation

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

L&#39;organisation de l&#39;actine filamentaire (F-actine) dans les cellules est régulée par un grand nombre de protéines liées à l&#39;actine qui contrôlent la nucléation, la croissance, la réticulation et / ou le désassemblage de l&#39;actine. Ce protocole décrit une technique - la co-sédimentation d&#39;actine, ou la granulation, le dosage - pour déterminer si un domaine protéique ou protéique lie l&#39;actine F et mesurer l&#39;affinité de l&#39;interaction ( c&#39;est-à-dire la constante d&#39;équilibre de la dissociation). Dans cette technique, une protéine d&#39;intérêt est d&#39;abord incubée avec de la F-actine en solution. Ensuite, la centrifugation différentielle est utilisée pour sédimenter les filaments d&#39;actine, et la matière granulée est analysée par SDS-PAGE. Si la protéine d&#39;intérêt lie la F-actine, elle co-sédimentera avec les filaments d&#39;actine. Les produits de la réaction de liaison ( c.-à-d., L&#39;actine F et la protéine d&#39;intérêt) peuvent être quantifiés pour déterminer l&#39;affinité de l&#39;interaction. L&#39;essai de granulation d&#39;actine est une technique simple pour déterminerSi une protéine d&#39;intérêt lie la F-actine et pour évaluer comment les changements apportés à cette protéine, comme la liaison au ligand, affectent son interaction avec la F-actine.

Nous avons examiné la liaison de l&#39;homodimère αE-caténine à la F-actine dans le dosage de co-sédimentation. Comme les expériences antérieures ont montré que l&#39;affinité de l&#39;αE-caténine homodimère pour la F-actine est d&#39;environ 1 μM et le maximum de B jusqu&#39;à 1 11 , nous avons effectué le dosage avec une faible concentration de F-actine (0,2 μM plutôt que 2 μM, voir la discussion). Comme 0,2 μM est inférieur à la concentration critique, la phalloidine a été ajoutée pour stabiliser l&#39;actine F polymérisée à partir de la G-actine du muscle squelettique du lapin (étape 3.3). Des concentrations croissantes d&#39;homodimère d&#39;αE-caténine (0,125-12,0 μM) ont été incubées en présence ou en l&#39;absence d&#39;actine F 0,2 μM. Les échantillons ont été centrifugés et les granulés obtenus ont été analysés ( figure 1A ). Comme prévu, l&#39;homodimère d&#39;αE-catenine co-sédimenté avec la F-actine au-dessus du fond ( Figure 1A , compare les échantillons de pastilles de F-actine au no-F-acÉchantillons de granulés d&#39;étain). BSA a été exécuté comme un contrôle négatif ( figure 1B ). La protéine liée a été quantifiée et tracée sur une protéine libre pour calculer l&#39;affinité de l&#39;interaction ( figure 1C ). Les données tracées correspondent mieux à une équation de Hill. Le Kd calculé était de 2,9 μM, le B max était de 0,2, et le coefficient de Hill (h) était de 4,8. Ainsi, l&#39;αE-catenin homodimer lie la F-actine en coopération avec une faible affinité micromolaire, compatible avec les travaux antérieurs (un K d de 2,9 μM contre ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figure 1: dosage de co-sédimentation F-actine à haute vitesse. ( A ) Des concentrations croissantes (0,125-12,0 μM) d&#39;homodimère d&#39;αE-caténine ont été incubées avec (panneaux de gauche) ou sans (panneaux droits) 0,12 μM d&#39;actine F stabilisée avec phalloidN. Ils ont été incubés pendant 30 min à la RT et centrifugés. Le total (7,5% de la matière de départ) et la matière granulée (50% de la matière granulée) ont été séparés par SDS-PAGE et colorés au colorant Coomassie. ( B ) 4 μM BSA a été utilisé comme témoin négatif. Les échantillons totaux et de pastilles, avec (+) ou sans (-) F-actine, ont été séparés par SDS-PAGE et colorés au colorant Coomassie. ( C ) L&#39;αE-caténine liée (actine μM / μM) de A a été tracée contre l&#39;αE-caténine libre (μM), et les données s&#39;adaptent à une équation de Hill (ligne rouge). Les coefficients K d , B max et Hill (h) sont répertoriés. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figure 2: Quantification de la granulation d&#39;Actine </sTrong&gt; - organigramme. Ce schéma décrit les étapes clés de la section 5, avec des exemples d&#39;échantillons Total et Pellet ( A , CE ) et la courbe standard ( B ) utilisée pour la quantification. 5.13 étapes: 1 ) Mesurez la quantité de protéine d&#39;intérêt dans les échantillons totaux (A). 2 ) Générer une courbe standard en traçant l&#39;intensité de la bande par rapport à la masse protéique (B). 3 ) Mesurer la quantité de protéine d&#39;intérêt qui co-sédimenté avec la F-actine ( C ). 4 ) Mesurer la quantité de protéines d&#39;intérêt qui ont été granulées en l&#39;absence de F-actine ( D ). 5 ) Soustraire D de C pour déterminer la quantité de protéine liée à la F-actine. 6 ) Mesurer la quantité de F-actine dans chaque pastille (E), calculer la quantité moyenne de F-actine par échantillon et diviser chaque échantillon par la moyenne (les nombres ci-dessous montrent le rapport). 7 )Pour chaque échantillon, divisez la quantité de protéine liée (calculée à l&#39;étape 5) par le rapport de pastilles de F-actine (calculé à l&#39;étape 6) pour ajuster les différences dans la pastille. 8 ) Utilisez la courbe standard ( B ) pour calculer la quantité (masse) de la protéine liée normalisée dans chaque échantillon (étape 7). 9 ) Déterminer la concentration de protéines libres et de protéines liées pour créer une courbe de liaison. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ce protocole décrit une méthode pour tester la capacité d&#39;une protéine à co-sédimenter avec de l&#39;actine filamenteuse (F-actine) et, si la liaison est observée, mesurer l&#39;affinité de l&#39;interaction.

Mesure de la liaison des protéines à la F-actine par co-sédimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

L'objectif général de cette technique est de tester la capacité d'une protéine à co-sédimenter avec l'actine filamenteuse, et si une liaison est observée, de mesurer l'affinité de cette interaction. Cette méthode constitue une approche simple pour déterminer si une protéine se lie à l'actine F. Les avantages de cette technique sont qu'elle ne nécessite pas d'équipement spécialisé autre qu'une ultracentrifugeuse, et que tous les réactifs peuvent être préparés ou achetés.Pour commencer, préparez une protéine de haute pureté comme décrit dans le protocole textuel. Déterminez la concentration en protéine en mesurant l'absorbance à 280 nanomètres. Juste avant utilisation, effectuez une centrifugation à haut débit de la protéine pour éliminer les agrégats de protéine insoluble.Si la solubilité est un problème, remesurez la concentration en protéine après centrifugation. Ensuite, prélevez un aliquot d'actine globulaire ou d'actine G à partir du congélateur à moins 80 degrés Celsius et faites-le dégeler rapidement. Ajoutez le tampon de polymérisation 10X à l'actine G et diluez à une concentration finale de 1X avec de l'eau.Incubez le mélange pendant une heure à température ambiante pour permettre la polymérisation de l’actine. Après la polymérisation, conservez l’actine filamenteuse polymérisée, ou F-actine, en solution à quatre degrés Celsius, où elle restera stable pendant quelques semaines. Avant d’utiliser la F-actine après stockage, retournez doucement le tube ou donnez-lui plusieurs petits coups pour vous assurer que toute l’actine est dissoute et uniformément répartie en solution.Établir la liaison de la protéine d'intérêt à l'actine F comme décrit dans le protocole textuel. Une fois la liaison à l'actine F confirmée, diluer la protéine en série afin d'obtenir une gamme de concentration comprenant sept à huit échantillons à deux fois la concentration finale à tester. Par exemple, si la plage à tester va de 0,1 à huit micromolaire, préparer des dilutions de 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 et 0,2 micromolaire de la protéine dans un tampon de réaction 1X dans des tubes microcentrifugeuses. Diluez la protéine d'intérêt à la concentration finale dans du tampon de réaction 1X dans des tubes d'ultracentrifugation. Ajoutez de l'actine F aux échantillons appropriés. Incubez ensuite tous les échantillons pendant 30 minutes à température ambiante. Après 30 minutes, prélever un cinquième de chaque échantillon et le mélanger avec du tampon d'échantillonnage. Ce sont les échantillons totaux. Charger les tubes d'échantillons pour ultracentrifugation dans le rotor et centrifuger pendant 20 minutes à 100 000 ×g et à quatre degrés Celsius.Après centrifugation, retirez les trois quarts du surnageant de chaque tube et mélangez avec du tampon d'échantillonnage 4X dans un tube microcentrifuge distinct. Ce sont les échantillons de surnageant. Retirez le surnageant restant à l’aide d’une pipette adaptée aux gels, en prenant soin de ne pas perturber le culot.Ensuite, ajoutez du tampon d'échantillonnage 1X à tous les tubes et incubez pendant au moins cinq minutes à température ambiante. Après l'incubation, triturez l'échantillon de huit à dix fois avec une pipette p200, en lavant continuellement la zone du culot dans le tube. Grattez délicatement la pointe de la pipette sur le culot pendant la trituration pour faciliter la resuspension.Transférez la protéine re-suspendue dans un tube de microcentrifugeuse. Ce sont les échantillons de culot. Enfin, analysez les échantillons totaux et les échantillons de culot par électrophorèse SDS-PAGE.Imager les gels colorés à la Coomassie à l’aide d’un système d’imagerie permettant de mesurer les intensités des bandes protéiques sur une gamme large et linéaire. Des concentrations croissantes de dimère homologue de l’alpha E-caténine ont été incubées en présence ou en l’absence de 0,2 micromolaire d’actine F. Les échantillons ont été centrifugés et les culots obtenus ont été analysés.Comme prévu, l'homodimère de caténine alpha E a co-sédimenté avec l'actine F au-dessus du niveau de fond. L'albumine sérique de bovin a été utilisée comme témoin négatif. La protéine liée a été quantifiée et portée en graphique en fonction de la protéine libre afin de calculer l'affinité de l'interaction.Cette technique peut être réalisée en quatre heures ou moins si l'F-actine est déjà polymérisée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de retirer rapidement le surnageant après la centrifugation et de bien resuspendre entièrement le culot. Comme dans toutes les expériences de liaison, il est crucial que la liaison à l'F-actine soit saturée et que la pureté ainsi que l'F-actine atteignent un plateau ; sans plateau, il n'est pas possible de calculer une constante d'équilibre d'association précise.Il existe des limitations fondamentales au test de co-sédimentation dont les chercheurs doivent être informés, notamment le fait qu'il ne fournit pas une constante d'équilibre réelle, ce qui peut entraîner des erreurs de calcul ou l'incapacité à détecter des interactions de faible affinité. Malgré ces limitations, le test de co-sédimentation constitue un outil accessible et efficace pour déterminer si une protéine se lie à l'actine F et pour mesurer l'affinité de cette interaction.

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