Name: Rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Scopri come rilevare ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando uno screening del lievito ottimizzato per laboratori didattici universitari. Questo metodo economico quantifica gli attivisti dei recettori ERα ed ERβ.

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Questo progetto è stato finanziato dalla accensione finanziamenti a TME e AMR da Louisiana Tech University e Furman University, rispettivamente. Finanziamenti supplementari è stato fornito da una sovvenzione di avanzamento 2015 facoltà di AMR e TME da The Associated collegi del sud, una sovvenzione Louisiana EPSCoR Pfund TME dal National Science Foundation e la Louisiana Board of Regents e un viaggio premio a TME dalla Università del sud. Ringraziamo il Dr. David Eubanks (Furman) per assistenza con analisi statistiche e Mr. Christopher Moore per "darci una mano" durante le riprese.

1. preparazione reagenti
<ol>
	<li>Preparare il supporto di glucosio e galattosio mescolando 6,7 g lievito azoto base, 20 g di destrosio o galattosio, solfato di adenina 20 mg (aggiunto come 10 mL di una soluzione acquosa stock di 200 mg/100 mL), uracile 20mg (aggiunto come 10 mL di una soluzione acquosa stock di 200 mg/100 mL) , leucina 60mg (aggiunto come 6 mL di una soluzione acquosa 1 g/100 mL) e 20 mg istidina (aggiunto come 2 mL di una soluzione acquosa 1 g/100 mL) in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 1 L. sterilizzare mediante filtrazione (filtro 0,2 µm). Media può essere memorizzato a 4 ° C per diverse settimane.</li>
	<li>Preparare estradiolo (E2) standard di dissoluzione in polvere E2 in etanolo anidro e diluire le concentrazioni di lavoro appropriato (227.5 nM &#38; 9.75 nM) in etanolo al 50%. Nota: Se l'estradiolo è acquistato come una fiala da 1 mg, aggiungere 1 mL di etanolo direttamente al flaconcino per sciogliere la polvere di estradiolo. Questo produce uno stock di 3,67 mM #1.  Diluire 10 μL di stock #1 in etanolo al 990 μL di rendere 1 mL di brodo μM 36,71 #2.  Quindi, diluire 10 μL di stock #2 in etanolo al 50% 990 μL di rendere 1 mL di brodo di 367.13 nM #3.  Per rendere il lavoro delle scorte, diluire stock μL 619.7 #3 in etanolo di 50% 380.3 μL di rendere 1 mL di 227.5 nM lavoro magazzino utilizzato per creare curve standard con lievito che esprimono ERα.  Diluire il magazzino μL 26.56 #3 in etanolo al 50% 973.44 μL per fare 1 mL di 9,75 nM lavoro magazzino utilizzato per creare curve standard con lievito esprimendo ERβ. Guarnizione standard con parafilm e conservare a -20 o -70 ° C. Attenzione: E2 è un sospetto cancerogeno e tossico riproduttiva. È nocivo se inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle. E2 può provocare danni all'allattamento al seno i bambini e feti. E2 è molto tossico per la vita acquatica. Utilizzare protettivi appropriati (guanti, cappa aspirante, mascherina antipolvere) ed evitare l'esposizione durante la gravidanza e l'allattamento. Alienare E2 come rifiuti pericolosi e non rilasciano nell'ambiente.</li>
	<li>Preparare il tampone di LacZ mescolando 8,52 g Na2HPO4, 5,52 g NaH2PO4•H2O, mg 95,21 MgCl2, 745,5 mg KCl, sale di sodio di 2 g N-lauroylsarcosine e ONPG (400 mg) o CPRG (77,7 mg) in acqua deionizzata per un finale volume di 1 L. Store LacZ tampone in aliquote di mL 20 a-20 ° C. Nota: Un 20ml aliquota è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Preparare il carbonato di sodio mescolando 105,9 g di carbonato di sodio in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 1 L. negozio a TA.</li>
	<li>Preparare 1 M ditiotreitolo (DTT) in acqua. Congelare 25 aliquote µ l di DTT a-20 ° C. Attenzione: Il DTT è un'acuta della pelle e irritante per gli occhi. Utilizzare indumenti protettivi appropriati (guanti, cappa aspirante, mascherina antipolvere) per evitare la pelle e contatto con gli occhi, inalazione e ingestione. Nota: Ciascuna aliquota è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti.</li>
</ol>
2. preparazione di campioni e controlli di estrazione
<ol>
	<li>Prelevare campioni da testare. Nota: Questo articolo presenta i dati per quindici PCPs, tra cui sapone, crema per capelli, shampoo, crema solare, burrocacao, Fondazione, crema da barba, smalto e lozione.</li>
	<li>Unire 1 g del campione con 10 mL di etanolo anidro in una provetta conica da 15 mL. Preparare un controllo negativo estrazione costituito da 11 mL di etanolo in una provetta conica da 15 mL. Preparare replicati. Nota: Per il disegno sperimentale presentato, sono state preparate tre aliquote di tutti i 15 PCPs e soluzioni di controllo estrazione triplicate, producendo un totale di 48 campioni, ciascuno dei quali è stato analizzato in triplice copia utilizzando il protocollo nella sezione 4. Un piatto unico può ospitare fino a 23 campioni in triplici copie. Etanolo anidro è usato in questo passaggio perché evapora prontamente. Utilizzare i controlli negativi estrazione per verificare che gli estrogeni non sono lisciviazione in campioni da provette coniche.</li>
	<li>Da una combinazione di agitazione manuale e Vortex o agitando tubi su un vortex multi-provette, omogeneizzare tubo contenuto per 30 min.</li>
	<li>Centrifugare provette coniche alla massima velocità consentita in una centrifuga di secchio per 10 min. decantare il supernatante da ciascuna provetta attraverso un colino di cella di 40 µm in una provetta conica da 50 mL. Vuoto contenuto di ogni provetta da 50 mL in un flacone di vetro scintillazione.</li>
	<li>Fiale di lasciare aperto in un cappuccio ventilato per una settimana consentire etanolo farlo evaporare completamente. In alternativa, asciugare i campioni in un cappuccio ventilato sotto azoto o con un evaporatore rotante. Per evitare la degradazione dei costituenti sensibili luce, proteggere i campioni essiccazione dalla luce (ad esempio, il tessuto opaco posto sopra porta cappuccio ventilato).</li>
	<li>Ricostituire i campioni in 1,0 mL di etanolo al 50% e vortexare per omogeneizzare.</li>
</ol>
3. messa in coltura e subcoltura lievito14
<ol>
	<li>Mantenere le colture di lievito attivo (ceppo batterico di W303a di S. cerevisiae14) incubando lievito nei mezzi di glucosio filtro-sterilizzato a 30 ° C. Lievito di sottocultura settimanale media fresco glucosio filtro-sterilizzato.</li>
	<li>Due notti (circa 42 h) prima di preparare le piastre Sì, sottocultura lievito aggiungendo 0,1 mL di colture di lievito attivo a 10 mL di media filtro-sterilizzato glucosio utilizzando una tecnica sterile.  Incubare a 30 ° C per due notti.  Agitazione non è necessaria se lievito vengono coltivata come culture poco profonde in sterile 250 mL Erlenmeyer boccette. Nota: Lievito può essere conservato anche su piastre di agar refrigerati per diversi mesi. Per archiviazione a lungo termine (anni), unire culture O/N con glicerolo sterile 15-50%, vortice e congelare a-70 ° C. Per preparare il glicerolo sterile, è necessario utilizzare una siringa per trasferire 300 glicerolo µ l in un cryovial ed autoclave con il tappo svitato. Quindi aggiungere 1.200 coltura di lievito O/N µ l utilizzando una tecnica sterile.</li>
</ol>
4. preparazione sì piastre (giorno 1 del dosaggio)
<ol>
	<li>In un becher di sterile e utilizzando una tecnica sterile, diluire il lievito da passo 3.2 a una densità ottica di 0.065 ± 0.005 a 610 nm (OD610) in media filtro-sterilizzato galattosio.<ol>
		<li>Confermare la densità ottica di pipettaggio 120 µ l di ogni campione di lievito in triplice copia insieme con spazi vuoti galattosio triplicate in un piatto chiaro polistirolo (piastra non deve necessariamente essere sterile).  Utilizzare uno spettrofotometro di piastra per verificare che la coltura di lievito diluito ha un netto OD610 di 0,065 ± 0.005 sottrarre OD610 letture di spazi di galattosio da letture di610 OD lievito per determinare netto OD610 del lievito. Preparare un volume finale di almeno 30 lievito mL diluito per ogni piastra a 96 pozzetti. Nota: Spettrofotometro filtri misurare l'assorbanza tra 610 e 595 nm possono essere utilizzati per questa misura.</li></ol></li></ol>Un approssimativo rapporto 1:6 v: v: media del lievito in genere produce un OD610 vicino 0,065, quindi iniziare con l'aggiunta di lievito di 4,5 mL ai media di 30 mL e aggiungere più lievito o supporti appropriati ottenere un netOD610 tra 0.060 e 0.070.
	
	
	<li>Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere questa sospensione di lievito diluito ai pozzetti di una sterile, polipropilene, micropiastra a 96 pozzetti in base al layout della piastra (Figura 1). Durante il pipettaggio, mantenere la fonte lievito sospesa continuamente agitando il contenitore o la miscelazione con la pipetta. Per questo passaggio, è utile usare un pipettatore ripetuto con una punta di siringa sterile. Nota: Placche in polipropilene sono sterilizzati con due piastre impilate in autoclave, avvolti in carta stagnola.  La piastra superiore funge da un coperchio per piatto del campione e può essere lavato, re-autoclavato e riutilizzato.</li>
	<li>Aggiungere 120 µ l filtro-sterilizzato galattosio media a 3 ulteriori pozzi (H10 - 12) in base al layout della piastra (Figura 1). Questi pozzi servono come controlli multimediali per contabilizzare assorbanza contribuito dai media da solo.</li>
	<li>Costruire una curva standard in ogni piastra diluendo in modo seriale triplici copie di standard lavorativi E2 (227.5 nM per ERα, 9.75 nM per ERβ) in pozzetti contenenti la sospensione di lievito (A1 - G3) in base al layout della piastra (Figura 1).  Iniziare aggiungendo 5 µ l di standard di E2 pozzetti A1 e A3. Mescolare microtiter contenuto pipettando e poi diluire in serie questa sospensione spostando µ l 205 da pozzetti A1 - 3 nei pozzetti B1 - 3. Ripetere la miscelazione e il trasferimento di µ l 205 attraverso riga G. Nota: Una volta completata la diluizione seriale, scartare 205 μL da pozzi G1 - 3. Alla fine di questo passaggio, tutti i pozzetti standard dovrebbero contenere 120 μL. La diluizione seriale produrrà le concentrazioni finali di E2 elencate nella tabella 1. Per i passaggi di diluizione seriale, è utile usare un pipettatore multicanale con puntali sterili.</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l del veicolo (50% di etanolo) nei pozzetti di controllo del veicolo contenente la sospensione di lievito (H1 - 3) in base al layout della piastra (Figura 1). Nota: I pozzetti di controllo del veicolo vengono utilizzati per quantificare dell'assorbanza di fondo connesso con i media e le cellule di lievito. Inoltre, citotossicità o crescita promuovendo effetti del test campioni possono essere rilevati confrontando i valori di610 OD di testare pozzetti con quelli dei pozzetti di controllo del veicolo.</li>
	<li>Aggiungere 5 triplici copie µ l dei campioni ed estrazione negativa dei pozzetti contenente la sospensione di lievito secondo il layout della piastra (Figura 1). Nota: Prendere nota dei quali campioni o estrazione negativa controlli vengono aggiunti a ciascun pozzetto.  Per tenere traccia di quali pozzi hanno campioni e che non lo fanno, iniziare con una scatola di fresca di suggerimenti e utilizzare punte dalle stesse posizioni nella casella le posizioni dei rispettivi pozzetti della piastra. Una piastra a 96 pozzetti può ospitare fino a 23 campioni in triplice copia.</li>
	<li>Mescolare il contenuto del campione, controllo di estrazione e pozzetti di controllo del veicolo di pipettaggio. Regolare i volumi di questi pozzi a 120 µ l rimuovendo µ l 205 da ciascuno come descritto nella legenda per Figura 1.</li>
	<li>Sigillare le piastre con un film sterile, adesiva, porosa. Etichettare le piastre e incubare per 17 ore a 30 ° C. La piastra non deve necessariamente essere agitato durante l'incubazione</li>

5. elaborazione sì piastre (giorno 2 del dosaggio)
<ol>
	<li>Dopo le 17 ore di incubazione a 30 ° C, è necessario rimuovere piastre dall'incubatrice. Se piastre saranno evasi immediatamente, passare al punto 5.1.1. Se piastre saranno trattati in un secondo momento, passare al punto 5.1.2.<ol>
		<li>Utilizzare un pipettatore multicanale per mescolare il contenuto di ogni fila di pozzetti e quindi trasferire 50 µ l di sospensione di lievito da ogni pozzetto per il corrispondente bene di una micropiastra chiara, polistirolo, 96 pozzetti. Nota: Lastre di polistirolo non è necessario essere sterile ma dovrebbero avere un coperchio. Utilizzare nuove punte di pipetta per ogni fila di pozzetti per evitare la cross-contaminazione pozzi, anche se pipettaggio attraverso triplici copie con una pipetta multicanale 8-punta, suggerimenti solo bisogno di essere cambiato tra insiemi triplicate.<ol>
			<li>Etichettare la nuova piastra. Procedere al punto 5.2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Per memorizzare le piastre prima dell'elaborazione, eseguirne il wrapping in involucro di plastica. Conservare in frigorifero avvolti piastre a 4 ° C per 6 d. in seguito, rimuovere le piastre dal frigorifero, scartare li e trasferire il contenuto di tutti i pozzetti pipettando come descritto al punto 5.1.1. Procedere al punto 5.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l di 1 M DTT a 20 mL di tampone di LacZ scongelati, temperatura per una concentrazione finale di 1 millimetro DTT. Buffer di LacZ mix bene. Se utilizzando una pipetta multicanale, dispensare in un serbatoio di reagente. Attenzione: Indossare guanti e lavorare con DTT in una cappa, se possibile</li>
	<li>Usando sia una pipetta multicanale o ripetendo pipettatore, aggiungere 200 µ l di tampone di LacZ contenente DTT e ONPG o CPRG in tutti i pozzetti della piastra in polistirolo e immediatamente misurare e registrare il OD610 di tutti i pozzetti usando uno spettrofotometro di piastra. Ripetere per piastre aggiuntive. Nota: Le letture di610 OD sono utilizzate nel denominatore del calcolo LacZ (punto 6.1). Per questo motivo, ottenere le letture immediatamente dopo il pipettaggio e prima settle di cellule o vengono lisate dai buffer di LacZ. Se i valori di610 OD per pozzetti sono notevolmente superiori o inferiori ai valori di610 OD per pozzetti di controllo del veicolo, gli estratti di campione sono dipromozione o citotossici ai lieviti, rispettivamente. LacZ calcolo verrà corretto per piccole differenze nella densità delle cellule attraverso pozzi, ma se le differenze superino il 30% in entrambe le direzioni, quindi diluire il campione ricostituito (dal punto 2.6) in ulteriori 50% etanolo e verificare nuovamente il campione restituendo al punto 3.2 12.</li>
	<li>Coprire le piastre con un coperchio. Incubare piastre contenenti lievito quello espresso ERα14 a 30 ° C per 40 min (per ONPG) o 3 h (per CPRG). Incubare piastre contenenti lievito quello espresso ERβ14 a 30 ° C per 70 min (per ONPG) o 4 h (per CPRG). Nota: Quando si lavora con CPRG, tempi di incubazione sono flessibili; Incubare per 2-4 h produce risultati idonei con entrambi i recettori, con incubazioni più lunghe, aumentando la sensibilità del test.</li>
	<li>Dopo incubazione piastre, utilizzare una pipetta multicanale o ripetuta pipettatore per aggiungere 100 µ l di carbonato di sodio in ciascun pozzetto. Carbonato di sodio aumenta il pH e interrompe la reazione di β-galattosidasi.</li>
	<li>Misurare e registrare il OD405 (per ONPG) o OD574 (per CPRG) di tutti i pozzetti usando uno spettrofotometro di piastra.</li>
</ol>
6.Calcolo dei valori LacZ
Nota: I valori LacZ quantificare il grado di cambiamento di colore per ogni campione e offrono un metodo normalizzato di confrontare valori tra saggi separati di contabilità per diverse variabili (ad es., densità ottica lievito, densità ottica media e incubazione tempo se Questo differisce tra pozzi sulla stessa piastra)12.
<ol>
	<li>Calcolare mezzo di valori di610 OD triplici per pozzetti di controllo multimediale (galattosio) (H10-12) e calcolare mezzo di triplice copia OD405 o valori574 OD per comandi del veicolo (50% di etanolo) (H1-3). Utilizzare questi mezzi ed il tempo di incubazione (t) in ore per la piastra per cambiare colore (punto 5.5) per calcolare i valori di LacZ (corrispondente al grado di cambiamento di colore in ogni pozzetto) per tutti gli standard e campione pozzi utilizzando le seguenti equazioni: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq1.jpg"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq2.jpg">
	<ol>
		<li>In alternativa, utilizzare l'applicazione automatizzata nell'appendice 1 per calcolare valori di LacZ per standard e campioni. Nota: Il layout di piastra utilizzato con l'applicazione deve essere identico al layout del piatto presentato nella Figura 1. Se non sono stati utilizzati alcuni pozzetti, mantenere letture di assorbenza dei pozzi vuoti come segnaposto nel dataset assorbanza viene incollato nell'applicazione LacZ appendice 1 .  Ciò mantiene la disposizione spaziale della piastra nell'applicazione ed assicura che i pozzetti di controllo multimediale sono nella loro posizione richiesta.  Inoltre, l'applicazione non verrà eseguito se non ci sono celle vuote.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Calcolare mezzo di triplice copia LacZ valori per ogni standard di E2 e di ogni campione. Segnalare i valori medi di LacZ come µ l-1h-1. Registro-trasformazione delle concentrazioni di ciascun E2 standard e generare un documento di foglio di calcolo, formattato come file CSV (appendice 2).</li>
</ol>
7. campione estradiolo equivalenti (EEQs) utilizzando la regressione logistica 4 parametri di interpolazione
Nota: EEQs riguardano valori di esempio LacZ (cambiamento di colore) i valori di LacZ della curva standard creato con E2. EEQs così determinare quanto campione è necessaria per suscitare la stessa risposta di cambiamento di colore come una concentrazione nota di E2.
<ol>
	<li>Per calcolare EEQs per campioni di prova, prima di tracciare la curva standard. Misura i valori medi di LacZ per E2 standard (asse y) e il registro-trasformate E2 concentrazioni corrispondenti (asse x) per un modello di regressione logistica quattro-parametro.</li>
	<li>Utilizzare il modello per interpolare EEQs per i valori di test campione LacZ. Condurre i calcoli di regressione logistica di EEQs utilizzando il software statistico come descritto nell'appendice 2.</li>
</ol>
8. standardizzazione EEQs (ng/mL) alla massa del campione di PCP
<ol>
	<li>Di relazionarsi EEQs con la quantità di campione di PCP aggiunto a ciascun pozzetto nel passaggio 4.5, moltiplicare EEQ (ng/mL) per il volume totale placcato nei pozzetti (325 µ l) ed poi dividere per il volume di campione estratto aggiunto ad ogni pozzetto (5 µ l). Nota: Questi valori rappresentano EEQ per mL di campione estratto. Se i campioni sono stati preparati usando 1 g di PCP, questi valori rappresentano anche EEQ per grammo di PCP (ng/g). Espresso in questo modo, valori EEQ (ng/g) possono essere confrontati attraverso valori diversi PCPs. EEQ (ng/g) per i prodotti di cura personale testati in questo studio sono riportati nella tabella 2, e raccolti in tutta l'intero protocollo di dati di esempio sono inclusi in Appendice 3.</li>
</ol>

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<li>Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+the+detection+of+beta-galactosidase+in+transfected+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells.</a> Biotechniques. 11 (6), (1991).</li>
<li>Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+beta-galactosidase+tissue+levels+in+a+tumor+cell+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Find+Exp+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model.</a> Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).</li>
<li>Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+beta-galactosidase+activity+in+tissue+in+the+presence+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood.</a> J Vasc Res. 37 (6), 585-593 (2000).</li>
<li>Gray, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+alcohol+tolerance+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Studies on the alcohol tolerance of yeasts.</a> J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).</li>
<li>Schug, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+endocrine+disruption+out+of+the+next+generation+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals.</a> Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Lo sì è un metodo a basso costo utilizzato per rilevare estrogenici ligandi in campioni ambientali, quali acqua, cibo, tessuti vegetali o prodotti di cura personale. I dati presentati qui confrontare 2 recettori per gli estrogeni (ERα ed ERβ), 2 substrati (ONPG e CPRG) e 2 linee temporali (protocollo 2 d senza refrigerazione) e protocollo di sette giorni con refrigerazione per misurare estrogenicità nei prodotti di cura personale via l'analisi Sì. La 7D, refrigerato protocollo utilizzando CPRG e lievito che esprimono ERα e/o ERβ meglio quantifica EEQs mentre anche essendo compatibile con i vincoli di tempo imposto da corsi di laboratorio dello studente non laureato che si incontrano solo una volta / settimana per diverse ore. Infatti, rispetto al dosaggio 2 d senza refrigerazione, il dosaggio di refrigerati di sette giorni è stato associato con varianza ridotta attraverso piastra replicati. Inoltre, la parte lineare della curva standard è stato leggermente ampliata per i dati raccolti mediante il saggio refrigerato. La parte lineare della curva standard definisce la gamma di rilevazione di analisi ed è l'unica parte della curva standard che può essere utilizzata per interpolare campione EEQs.
In tutti, ma uno dei campioni testati, EEQs misurato utilizzando CPRG erano inferiori rispetto a quelli quantificati con ONPG. Con un più elevato coefficiente di estinzione e inferiore Km e Vmax, CPRG è dieci volte più sensibile di ONPG17. Così, CPRG possono essere usate alle concentrazioni più basse e può essere utilizzato per rilevare gli importi più bassi di β-galattosidasi. Per questi motivi, è in genere preferibile CPRG ONPG18,19. Tuttavia, una maggiore sensibilità di substrato non spiega i valori inferiori di EEQ rilevato con CPRG. I valori più elevati di EEQ rilevati con ONPG potrebbero essere a causa dell'interferenza di matrice con il dosaggio, come osservato da altri autori2,18. Pigmenti gialli da estratti di prodotto di cura personale potrebbero gonfiare i valori EEQ rilevati con ONPG. Altri hanno aggirato questo problema includendo i controlli del pigmento nel loro disegno sperimentale2, un approccio che raddoppia il numero di piastre in un esperimento. Quando interferenze di matrice possono essere problematica, CPRG potrebbe essere un substrato preferibile per il dosaggio di sì, anche se è più costoso e richiede tempi di incubazione più lunghi rispetto a ONPG. Inoltre, il cambiamento di colore indotto tramite la fenditura del substrato di β-galattosidasi è più drammatico con CPRG, rendendo più facile per gli studenti a visualizzare i risultati.
Miller et al. (2010), chi ingegnerizzato il lievito utilizzato nel presente protocollo, notato che il lievito esprimendo ERβ erano più sensibili al 17 β-estradiolo che lievito che esprimono ERα, un'individuazione suffragata da nostri dati14x 30. Oltre a potenziali sfumature nella costruzione del plasmide, Miller et al. (2010) non poteva spiegare questa differenza di sensibilità14. Una differenza tra i due costrutti di plasmide è che ERα espressione è regolata da galattosio, mentre ERβ espressione è regolata da glucosio o galattosio. Il lievito usato per il test di sì sono coltivate in media del glucosio e solo dato galattosio quando essi sono diluiti all'inizio del test. Di conseguenza, lievito esprimendo ERβ potrebbe accumulare più alti numeri di copia di proteine recettoriali prima dell'inizio del test, quindi che conferisce maggiore sensibilità ai leganti estrogenici.
La minore sensibilità di lievito che esprimono ERα può spiegare i tassi più elevati di mancato rilevamento di estrogenicità nei campioni misurati con ERα confrontato con ERβ. Per aumentare le probabilità che EEQs il campione verrà rilevato, gli utenti potrebbero impiegare metodi e solventi di estrazione differenti o aggiungere maggiori volumi di campione al lievito. Se vengono utilizzati più elevati volumi di campione, le concentrazioni di E2 standard devono essere regolate tale che lo stesso volume di standard e di campioni può essere utilizzato nell'analisi. Una limitazione di aggiunta più campione è che il lievito può tollerare solo 6-10% di etanolo, con migliore tolleranza alle temperature di incubazione di 30 vs 35 ° C20. Per controllare per gli effetti di etanolo sui lieviti, gli investigatori dovrebbero aggiungere triplice copia "lievito solo" pozzi al layout della piastra e confermare che il OD610 di questi pozzi "lievito solo" è paragonabile alla OD610 di pozzetti di controllo del veicolo immediatamente dopo l'aggiunta del LacZ buffer. In alternativa, possono essere aggiunti campioni disciolti in etanolo a piastre microtiter asciutto e l'etanolo evaporato fuori prima di lievito vengono aggiunti. Dimetilsulfossido (DMSO) è anche usato come un solvente di campione in sì saggi, ma la concentrazione finale del lavoro di DMSO con lievito dovrebbe essere limitata a 1%12.
Il dosaggio di sì è uno strumento di screening potente per la rilevazione estrogenicità in campioni ambientali. In particolare, lo sì rileva ligandi che legano i recettori per gli estrogeni nucleari che interagiscono con gli elementi di risposta dell'estrogeno per dirigere gene espressione14. Tuttavia, lo sì ha anche alcune importanti limitazioni. Lo sì non rileva EEs che funzionano attraverso meccanismi non-nucleari come recettori di membrana estrogeno o meccanismi che coinvolgono elementi aggiuntivi come fattori di trascrizione di attivatore della proteina 1 (AP-1). Inoltre, perché il lievito non hanno la stessa capacità metabolica come cellule di mammifero, lo sì non riesce a rilevare ligandi che richiedono l'attivazione metabolica di essere estrogenici.
Inoltre, il dosaggio di sì prontamente non può distinguere tra estrogeni e anti-estrogenici ligandi in campioni complessi. Invece, misura estrogenicità netto , che è l'effetto della somma dei ligandi estrogeniche e anti-estrogenici. Per quantificare la concentrazione di antagonisti ER o valutare l'attività inibitoria di miscele, il dosaggio può essere modificato incubando il lievito con l'agonista standard (17 β-estradiolo) e una gamma di concentrazioni di prova campione12. Questo processo determina se antagonisti nei campioni possono diminuire l'attività del reporter indotta da agonista e fornisce uno schermo utile per identificare la presenza di antagonisti di ER in campioni.
Il protocollo qui presentato può ospitare una varietà di tipi di campione, anche se alcuni campioni potrebbero richiedere modifiche per la procedura di preparazione di estrazione e campione. Ad esempio, EEQs varia ampiamente tra replica di alcuni prodotti di cura personale. I campioni più variabili tendevano a contenere le goccioline di olio o altrimenti non erano completamente omogenei, che indica che un solvente più lipofilico come etere dietilico sarebbe utile. In alternativa, oli e cera in prodotti di cura personale potrebbe escludersi estraendo campioni con etanolo al 50% invece di etanolo al 100%.Un'estrazione di etanolo 50% anche catturare altri ligandi estrogenici solubile in acqua (ad es., alcuni pigmenti). Tuttavia, l'etanolo 50% evapora più lentamente di etanolo al 100% e così può estendere il tempo di estrazione. Inoltre, alcuni campioni (ad esempio saponi) erano citotossici ai lieviti, conseguente misure di densità riduttrice delle cellule (OD610). Volpe et al. (2008) suggeriscono che tali campioni devono essere diluiti e ritestati se differenze di densità delle cellule superino il 30% rispetto al veicolo controllo pozzi12.
Se l'analisi Sì è usata per scopi di ricerca analitica, curve di diluizione delle piscine di campione possono essere testate per determinare preventivamente volumi appropriati di Estratto da aggiungere al lievito al punto 4.5. In alternativa, gli estratti possono essere testati contemporaneamente a più volumi (per esempio, 5 µ l e 20 µ l di Estratto aggiunto al lievito nel passaggio 4.5) o diluizioni che si estendono su ordini di grandezza (ad es., 0,2 µ l, 2 µ l e 20 µ l). "Appropriati" volumi dell'estratto sono quelli che identificano estrogenicità abbinando LacZ valori lungo la parte lineare della curva standard. Ottimizzazione previene i problemi causati dall'aggiunta di campione troppo o troppo poco al lievito, quali citotossicità, falsi negativi o estrogenicità che supera la curva standard. Come accennato in precedenza, i volumi di campioni ed E2 standard devono essere regolati quando diverse quantità di legante vengono utilizzati tali che lievito sono esposti a un volume costante e la concentrazione di etanolo o altro veicolo su tutta la piastra.
Nonostante il potenziale di falsi negativi, il dosaggio di sì è stato identificato come uno strumento di test di livello 3 per gli interferenti endocrini di Schug et al. (2013), che ha sviluppato un protocollo completo di Tiered per endocrino (TiPED)21. Per la formazione universitaria, il dosaggio è prezioso per l'insegnamento di concetti relazionati alla endocrino, coltura cellulare, grippaggio del ricevitore, l'attività dell'enzima, ingegneria genetica, statistiche e disegno sperimentale. Gli studenti che usano l'analisi praticano anche competenze di laboratorio fondamentali e largamente applicabile ad esempio diluendo in modo seriale standard; estrazione di campioni; rendendo le soluzioni; costruzione e interpolando curve standard; calcolo delle concentrazioni; rendendo le soluzioni; dimostrazione tecnica sterile; coltura delle cellule; identificazione di variabili e controlli; raccolta, organizzazione e analisi dei dati; costruire e interpretare grafici; e utilizzando attrezzature di laboratorio comuni quali micropipettors e spettrofotometri.

Il lievito dell'estrogeno Screen (Sì) viene ampiamente utilizzato per quantificare ligandi che imitano l'estradiolo (E2 o 17 β-estradiolo) in una varietà di matrici, tra cui acqua, tessuti vegetali, prodotti di consumo e alimenti1,2,3, 4. Collettivamente, tali ligandi sono chiamati "Estrogeni ambientali (EEs)." Lo sì è stato originariamente sviluppato come un basso costo, in vitro alternativa alle prove di in vivo come il roditore uterotrofico dosaggio5,6 e la trota iridea alimentazione dosaggio7. Lo scopo di queste prove è quello di determinare se un prodotto contiene sostanze chimiche che stimolano o bloccano meccanismi estrogeno-dipendenti. Rilevamento della SEO è fondamentale, perché possono interferire con la segnalazione, particolarmente durante lo sviluppo fetale normale dell'estrogeno endogeno. Questa interferenza compromette la salute aumentando il rischio di obesità, sterilità, cancro e perdita conoscitiva8.
Nonostante l'importanza della SEO e altri EDCs per la salute pubblica, endocrino non è comunemente incluso nei programmi di studio dello studente non laureato. Questa carenza è parzialmente a causa di una carenza di attività che illustrano i principi coinvolti mentre anche essere accessibile a studenti universitari. Inoltre, esistono numerose varianti del protocollo Sì9,10,11,12,13, e questa diversità rende saggio ottimizzazione richiede molto tempo per coordinatori di laboratorio non specificamente addestrati nelle tecniche pertinenti. Infine, sì analisi vengono completate solitamente lunga oltre 1 giorno o 2 giorni consecutivi con un'incubazione di O/N. Questa tempistica non è compatibile con il formato dei corsi di laboratorio dello studente non laureato, che in genere si incontrano una volta / settimana per diverse ore.
In risposta a queste esigenze, questo manoscritto segnala un protocollo ottimizzato di sì 96 pozzetti che include metodi di estrazione etanolica per Personal Care Products (PCPs)3 e un passo di refrigerazione di 6 giorni per ospitare riunioni settimanali di laboratorio. Etanolo assoluto è un solvente organico versatile che può sciogliere una varietà di soluti polari e non polari. Inoltre, è indicato per i corsi di laurea perché è prontamente disponibile, relativamente non tossico, a prezzi accessibili e miscibile con l'acqua; evapora facilmente anche senza attrezzature speciali. Tuttavia, l'etanolo non è ideale per l'estrazione fortemente idrofobici interferenti endocrini o molti oli e cere, gli ultimi due ingredienti comuni in PCPs. efficienza di estrazione povera aumenta il rischio di risultati falsi negativi. Con questo vincolo in mente, gli investigatori dovrebbero scegliere le procedure di estrazione (ad es., estrazione etanolica o estrazione in fase solida) che le caratteristiche del campione di indirizzo e soddisfare obiettivi di studio (ricerca contro istruzione dello studente non laureato).
Lo sì si basa su ricombinante Saccharomyces cerevisiae originariamente creato da Dr. Charles Miller all'Università di Tulane. Si prega di vedere Miller et al. (2010) per una mappa completa del plasmide derivati dal14. Lievito trasformato con questi plasmidi costitutivamente espresso umano ERα nucleare o ERβ (anche chiamato ESR1 ed ESR2, rispettivamente) quando coltivate in media che contengono galattosio (per ERα) o glucosio o galattosio (per ERβ). Se estrogenici prodotti chimici sono presenti nei media, si legano ai recettori, creazione di complessi ligando-recettore che attivare l'espressione di β-galattosidasi (lacZ) ad un livello proporzionale alla concentrazione di sostanze chimiche estrogenici. Cellule di lievito vengono poi lisate per rilasciare la β-galattosidasi accumulata. Il buffer di lisi contiene ONPG o CPRG, che sono scisso dalla β-galattosidasi per produrre prodotti di gialli o rossi, rispettivamente. Colorimetrici prodotti possono essere quantificati misurando l'assorbanza usando uno spettrofotometro di piastra microtiter. Il grado di cambiamento di colore è proporzionale alla concentrazione di ligandi estrogeniche a cui era esposto il lievito.
La scelta del substrato (CPRG o ONPG) dipende dal potenziale dell'assorbanza di fondo derivanti dai campioni in fase di test. Ad esempio, estratti di piante spesso aggiungerà una tonalità gialla ai media che gonfia artificialmente misure estrogenicità se ONPG (quantificato a 405 nm) è usato come substrato per la β-galattosidasi. Con estratti della pianta, CPRG (quantificato a 574 nm) può essere un substrato colorimetrico più appropriato. CPRG è più costoso di ONPG ma è usato a un decimo la molarità. Questo articolo presenta estrogenicities di PCP estratti quantificati utilizzando sia ONPG e CPRG.
Quantificare la estrogenicità di campioni ambientali utilizzando sia ERα ed ERβ è un approccio più globale rispetto all'utilizzo di uno solo di questi recettori. Negli animali, questi recettori espositivo distribuzione tissutale differenziale, attività di carattere normativo e affinità di legame per ligandi estrogenica e anti-estrogenici15. Ad esempio, i fitoestrogeni vegetali in genere associare ERβ più fortemente2, considerando che prodotti chimici sintetici possono mostrare preferenza per ERα o ERβ o possono essere associati sia recettori ugualmente ben15. Di conseguenza, un estrogeno recettore non necessariamente prevedere associazione a altra.
Sebbene SEO si trovata in molti prodotti di consumo (ad es., pesticidi, detergenti, adesivi, lubrificanti, materie plastiche, alimenti e prodotti farmaceutici) così come le piante, i dati presentati sono stati ottenuti utilizzando una selezione di PCPs. PCPs sono convincenti, prontamente disponibile, buon rapporto qualità-prezzo e ambientali rilevanti per gli studenti universitari. Gli studenti possono essere invitati a portare loro PCPs preferita da casa per testare in laboratorio. Possono anche cercare il database Skin Deep, sviluppato Environmental Working Group16 per generare confronti basati su ipotesi di PCPs con alta e bassi punteggi di tossicità. In questo modo, gli studenti possono sviluppare contemporaneamente competenze di laboratorio avanzato; impegnarsi nell'apprendimento auto-diretto, basata sull'indagine; ed esplorare questioni emergenti in scienze ambientali e la salute.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer (per tubi singoli o multipli)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-215-365</td><td>Qualsiasi miscelatore sarà sufficiente.</td></tr><tr><td>Centrifuga a tazze</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>75-063-839</td><td>Qualsiasi centrifuga a secchiello sarà sufficiente se è in grado di centrifugare provette coniche a 4000 giri/min.</td></tr><tr><td>Bruciatore Bunsen</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>17-012-823</td><td>È sufficiente un bruciatore Bunsen o un bruciatore ad alcool (Fisher Scientific 04-245-1).</td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>50125590H</td><td>Qualsiasi incubatrice sarà sufficiente se è in grado di mantenere 30 °C.</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>BioTek (www.biotek.com)</td><td>EPOCH2</td><td>Un lettore di piastre di marca diversa sarà sufficiente se è in grado di misurare l'assorbanza a lunghezze d'onda di 405, 574 e 610 nm.</td></tr><tr><td>Software per lettore e imager di micropiastre Gen5</td><td>BioTek (www.biotek.com)</td><td>GEN5</td><td>Il software richiesto dipende dalla marca e dal modello del lettore di piastre; Il software GEN5 è destinato all'uso con il lettore di piastre BioTek.</td></tr><tr><td>Frigorifero</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>05LREEFSA</td><td>Qualsiasi frigorifero sarà sufficiente se è in grado di mantenere 4 °C.</td></tr><tr><td>Pipettor o PipetAid compatibile con pipette sierologiche da 1 a 10 ml</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-681-15E</td><td>Eventuali pipettatori sono sufficienti se compatibili con pipette sierologiche da 1 e 10 ml.</td></tr><tr><td>Micropipettatore P10</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F144562G</td><td>Qualsiasi micropipettatore sarà sufficiente se è in grado di erogare 5 &micro;l.</td></tr><tr><td>Micropipettatore P200</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F144565G</td><td>Qualsiasi micropipettatore sarà sufficiente se è in grado di erogare fino a 200 &micro;l.</td></tr><tr><td>pipettatore multicanale P300</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FBE1200300</td><td>Qualsiasi pipettatore multicanale sarà sufficiente se è in grado di erogare 50 - 205 &micro;l.</td></tr><tr><td>Pipettatore ripetuto</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F164001G</td><td>Deve essere in grado di erogare 100 - 320 &micro; l; Questo pipettatore è facoltativo perché al suo posto è possibile utilizzare un pipettatore multicanale.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 mL provette coniche con tappi</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>05-539-801</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di scintillazione in vetro</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastre a fondo piatto a 96 pozzetti in polistirene con coperchio (non sterili)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastre a fondo piatto a 96 pozzetti in polipropilene senza coperchio&nbsp;</td><td>Cole-Parmer (www.coleparmer.com)</td><td>EW-01728-81</td><td></td></tr><tr><td>Bicchieri di vetro da 100 mL</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-539H</td><td>Qualsiasi bicchiere di vetro è sufficiente se autoclavabile.</td></tr><tr><td>250 mL di fiasche di vetro Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FB500250</td><td>Qualsiasi fiaschetta di vetro Erlenmeyer sarà sufficiente se autoclavabile.</td></tr><tr><td>Film sterile, adesivo, poroso&nbsp;</td><td>VWR (www.vwr.com)</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Pinze metalliche</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>12-000-157</td><td>Qualsiasi pinza metallica sarà sufficiente.</td></tr><tr><td>Serbatoio reagenti</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>07-200-127</td><td></td></tr><tr><td>Unità di filtrazione (0,2 &; micro; m)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>09-761-52</td><td></td></tr><tr><td>Flacone a spruzzo (per etanolo)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-897-10</td><td>Sarà sufficiente qualsiasi flacone a spruzzo da laboratorio.</td></tr><tr><td>Flaconi autoclavabili</td> Fisher <td>Scientific (www.fishersci.com)</td><td>06-414-1D</td><td>È sufficiente qualsiasi flacone autoclavabile in vetro.</td></tr><tr><td>10 ml di pipette sierologiche in vetro (sterili)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-678-27F</td><td>Qualsiasi pipetta sierologica in vetro sarà sufficiente.</td></tr><tr><td>1 ml di pipette sierologiche in vetro (sterili)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-678-27C</td><td>Qualsiasi pipetta sierologica in vetro sarà sufficiente.</td></tr><tr><td>Puntali per micropipettor P10</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-3810</td><td>Tutti i puntali sono sufficienti se compatibili con il micropipettatore di cui sopra.</td></tr><tr><td>Puntali per micropipettatore P200</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-8810</td><td>Tutti i puntali sono sufficienti se compatibili con il micropipettatore di cui sopra.</td></tr><tr><td>Puntali per micropipettatore P300</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-9810</td><td>Tutti i puntali sono sufficienti se compatibili con il micropipettatore di cui sopra.</td></tr><tr><td>Puntali per siringa per pipettatore ripetuto</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F164150G</td><td>Necessario solo se si utilizza un pipettatore ripetuto.</td></tr><tr><td>Piastre di Petri sterili</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FB0875712</td><td>Qualsiasi capsula di Petri sterile sarà sufficiente.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Yeast&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae ceppi privi del prodotto genico TRP1 (es., W303a)</td><td>American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)</td><td>MYA-151</td><td>Sono disponibili anche su richiesta degli autori.</td></tr><tr><td>Recettore/plasmide reporter per ER&alfa;</td><td>Addgene (www.addgene.org)</td><td>pRR-ERalpha-5Z (Plasmide #23061)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Recettore/plasmide reporter per ER&beta;</td><td>Addgene (www.addgene.org)</td><td>pRR-ERbeta-5Z (Plasmide #23062)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Difco agar</td><td>BD (www.bd.com)</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>D0632</td><td>ATTENZIONE:&nbsp; Il ditiotreitolo è un irritante acuto per la pelle e gli occhi. Utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati (guanti, cappa aspirante, maschera antipolvere) per evitare il contatto con la pelle e gli occhi, l'inalazione e l'ingestione.</td></tr><tr><td>Orto-nitrofenil-&beta;-D-galattopiranoside</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>Clorofenolo rosso-&beta;-D-galattopiranoside</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>10884308001</td><td></td></tr><tr><td>Lievito azoto base</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Galattosio</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>Adinina solfato</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>A9126</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Istidina</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>17 &beta;-estradiolo& nbsp;</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MP Biomedicals&nbsp;</td><td>E8875-250 mg &nbsp; &nbsp; &nbsp; 0219456401 - 1 mg</td><td>ATTENZIONE:&nbsp; L'estradiolo è un sospetto cancerogeno e tossico per la riproduzione. È dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle. L'estradiolo può causare danni ai bambini allattati al seno e ai feti. L'estradiolo è molto tossico per la vita acquatica. Utilizzare un'adeguata protezione personale (guanti, cappa aspirante, maschera antipolvere) ed evitare l'esposizione durante la gravidanza e l'allattamento. L'estradiolo deve essere smaltito come rifiuto pericoloso e non rilasciato nell'ambiente.</td></tr><tr><td>100% etanolo</td><td>Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico monoidrato</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico (anidro)</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di</td> <td>potassioSigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (N-lauroilsarcosina sale sodico)</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>L5125</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di sodio</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments </td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel software per fogli di calcolo</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td>Excel è un comodo software per fogli di calcolo per la gestione degli output dei dati e la generazione di file .csv per l'analisi R.</td></tr><tr><td>Software Java (richiesto per l'applicazione dell'Appendice 1)&nbsp;</td><td>Oracle Corporation</td><td></td><td>Per calcolare i valori LacZ utilizzando l'applicazione nell'Appendice 1, scaricare prima il software Java gratuito (https://www.java.com/en/download/), quindi aprire l'applicazione LacZ nell'Appendice 1. I risultati LacZ creati dall'applicazione possono essere copiati premendo "control (ctrl) + c" sulle tastiere dei PC o "command + c" sulle tastiere dei Mac.</td></tr><tr>L'Appendice 2 del <td>software statistico JMP versione 13.0.0</td><td>di SAS Institute</td><td></td><td>include le istruzioni per l'utilizzo di JMP per adattare i dati LacZ a una curva di regressione logistica a quattro parametri. La curva viene utilizzata per interpolare gli equivalenti di estradiolo (EEQ) del campione di prova, rispetto alla curva standard dell'estradiolo.</td></tr><tr><td>Software di calcolo statistico e grafico R</td><td>Il software R Foundation</td><td></td><td>Free R può essere scaricato da https://www.r-project.org/.&nbsp; Le indicazioni e il codice per l'utilizzo di R per adattare i dati LacZ a una curva di regressione logistica a quattro parametri sono riportati nell'Appendice 2.</td></tr></tbody></table>

rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Il lievito dell'estrogeno Screen (Sì) viene utilizzato per rilevare estrogenici ligandi in campioni ambientali ed è stato ampiamente applicato negli studi dell'endocrino. Ligandi estrogenici comprendono sia naturali che artificiali "estrogeni ambientali" (EEs) trovato in molti beni di consumo, tra cui Personal Care Products (PCPs), plastica, pesticidi e alimenti. EEs perturbare ormone segnalazione negli esseri umani e altri animali, potenzialmente riducendo fertilità e aumentando il rischio di malattia. Nonostante l'importanza della SEO e altri Endocrine interrompere Chemicals (EDCs) per la salute pubblica, endocrino non è in genere incluso nei programmi di studio dello studente non laureato. Questa lacuna è in parte a causa di una mancanza di attività di laboratorio pertinenti che illustrano i principi coinvolti mentre anche essere accessibile a studenti universitari. Questo articolo presenta un ottimizzato Sì per quantificare ligandi in prodotti di cura personale che legano l'alfa recettori dell'estrogeno (ERα) e/o beta (ERβ). Il metodo incorpora uno dei due substrati colorimetrici (ortho- nitrofenil-β-D-galattopiranoside (ONPG) o clorofenoli rosso-β-D-galattopiranoside (CPRG)) che sono scisso dalla β-galattosidasi, un'incubazione refrigerata 6 giorni passo per facilitare l'uso nei corsi di laboratorio dello studente non laureato, un programma automatico per calcoli LacZ e codice R per l'analisi di regressione logistica di associato 4 parametri. Il protocollo è stato progettato per consentire agli studenti universitari di sviluppare e condurre esperimenti in cui hanno schermo i prodotti di loro scelta per estrogeno imita. Nel processo, imparano circa endocrino, coltura cellulare, grippaggio del ricevitore, l'attività dell'enzima, ingegneria genetica, statistiche e disegno sperimentale. Contemporaneamente, si esercitano anche competenze di laboratorio fondamentali e ampiamente applicabili, come: calcolo delle concentrazioni; rendendo le soluzioni; dimostrazione tecnica sterile; diluizione in serie standard; costruzione e interpolando curve standard; identificazione di variabili e controlli; raccolta, organizzazione e analisi dei dati; costruire e interpretare grafici; e utilizzando attrezzature di laboratorio comuni quali micropipettors e spettrofotometri. Così, questo saggio di esecuzione incoraggia gli studenti a impegnarsi nell'apprendimento basato sulla ricerca esplorando questioni emergenti in scienze ambientali e la salute.

Questo articolo presenta una schermata di estrogeno ottimizzato lievito per quantificare ligandi in prodotti di cura personale (PCPs) che legano l'alfa recettori dell'estrogeno (ERα) e/o beta (ERβ). Il metodo incorpora due opzioni di substrato colorimetrico, una sei giorni incubazione refrigerata per uso nei corsi di laurea e gli strumenti statistici per l'analisi dei dati.

Rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un test di screening degli estrogeni su lievito per quantificare gli agonisti del recettore degli estrogeni umani estratti da prodotti per la cura personale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della tossicologia, del disturbo endocrino e dell'ecofisiologia, poiché consente di rilevare e quantificare gli estrogeni ambientali presenti nell'acqua, negli alimenti e nei prodotti per la cura personale. I principali vantaggi di questa tecnica in vitro sono il basso costo, l'ampia diffusione e l'offerta di un'ottima piattaforma per l'insegnamento delle abilità tecniche di laboratorio.Il rilevamento degli estrogeni ambientali è fondamentale perché possono alterare la segnalazione ormonale, in particolare durante lo sviluppo fetale e i periodi di transizione fisiologica come la pubertà. Le parti più complesse di questo metodo sono i calcoli e l'analisi dei dati, che abbiamo semplificato sviluppando un'applicazione di facile utilizzo. Inoltre, è essenziale un'accurata pipettaggio.Questo protocollo inizia con la preparazione dei reagenti. Preparare i mezzi di coltura contenenti glucosio e galattosio, i controlli del veicolo con etanolo al 50% e gli standard di estradiolo che verranno utilizzati nel primo giorno del saggio, nonché il buffer LacZ, il ditiotreitolo e il carbonato di sodio per il secondo giorno. Sterilizzare i mezzi di coltura contenenti glucosio e galattosio mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,2 micrometri.Fino a 23 diversi prodotti per la cura personale (PCP) o controlli di estrazione possono essere testati in triplice replicato su una singola piastra a 96 pozzetti. I PCP includono sapone, crema per capelli, shampoo, protezione solare, trucco, crema da barba e lozione. Ai fini della ripresa, i campioni saranno preparati a partire da soli otto PCP.Combinare un grammo di ogni campione con 10 millilitri di etanolo anidro in un tubo conico da 15 millilitri. Inoltre, preparare un controllo negativo di estrazione costituito da 11 millilitri di etanolo anidro in un tubo conico da 15 millilitri. Omogeneizzare il contenuto di ciascun tubo conico per 30 minuti mediante una combinazione di agitazione manuale e vortexaggio.Centrifugare i tubi conici alla velocità massima consentita in una centrifuga a cestello per 10 minuti. Decantare il soprannatante da ogni tubo attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, trasferire il contenuto di ogni tubo da 50 millilitri in un vial di vetro per scintillazione.Lasciare evaporare completamente l'etanolo lasciando le provette aperte in una cappa ventilata per una settimana. Proteggere i campioni in asciugatura dalla luce per evitare il degrado dei costituenti sensibili alla luce. Quando i campioni sono asciutti, ricostituire ciascun campione in un millilitro di etanolo al 50% e quindi vortexare per omogeneizzare.Due notti o circa 42 ore prima di preparare le piastre per il saggio di estrogeni su lievito (YES), utilizzare una tecnica asettica per sottocolturare il lievito aggiungendo 0,1 millilitri di ciascuna coltura attiva di lievito a 10 millilitri di terreno al glucosio sterilizzato per filtrazione in un matraccio Erlenmeyer sterile. Incubare a 30 gradi Celsius e continuare a incubare le colture originali come riserve. Due giorni dopo, al primo giorno del saggio YES, utilizzare una tecnica asettica per diluire le colture di lievito sospese e il terreno al galattosio sterilizzato per filtrazione in un becher sterile.Verificare la densità ottica prelevando con una pipetta 120 microlitri di ciascun campione di lievito in triplice replicato, insieme a tre campioni bianchi di mezzo contenente galattosio, in una piastra in polistirene trasparente. Utilizzare un fotometro a piastre per verificare che la coltura di lievito diluita abbia una densità ottica netta di 0,065 più o meno 0,005 a una lunghezza d'onda di 610 nanometri. Determinare l'OD610 netto del lievito sottraendo l'OD610 dei campioni bianchi di mezzo contenente galattosio.Utilizzando una pipetta ripetitrice con una punta sterile per siringa, aggiungere la sospensione di lievito diluita nei pozzetti di una micropiastina sterile in polipropilene a 96 pozzetti seguendo questo schema della piastra. Durante la pipettatura, mantenere il lievito in sospensione agitando continuamente il becher o mescolando con la pipetta. Infine, aggiungere 120 microlitri di mezzo al galattosio sterilizzato mediante filtrazione nei pozzetti H10-H12, indicati in verde nello schema della piastra, come controlli del mezzo per tenere conto degli assorbimenti dovuti esclusivamente al mezzo.Preparare piastre separate per ogni combinazione di ceppo di lievito e substrato calorimetrico da testare. Successivamente, costruire una curva standard in ciascuna piastra mediante diluizione seriale secondo la disposizione della piastra. Utilizzare una pipetta monocanale con punte sterili per aggiungere cinque microlitri di standard di estradiolo nei pozzetti A2, A2 e A3. Usare una pipetta multicanale per mescolare il contenuto dei pozzetti mediante pipettaggio, quindi trasferire 205 microlitri dai pozzetti A1 ad A3 nei pozzetti B1 a B3. Ripetere il trasferimento di 205 microlitri fino alla riga G. Al termine della diluizione seriale, scartare 205 microlitri dai pozzetti G1 a G3. Al termine di questo passaggio, tutti i pozzetti dello standard dovranno contenere 120 microlitri.Aggiungere cinque microlitri di etanolo al 50% in ciascun pozzetto del controllo veicolo contenente la sospensione di lievito, pozzetti H1, H2 e H3, indicati in blu in questo schema della piastra. Il passaggio successivo consiste nell'aggiungere triplicati di cinque microlitri di campioni o controlli negativi di estrazione nei pozzetti contenenti la sospensione di lievito, indicati in viola nello schema della piastra. Annotare quali campioni o controlli di estrazione vengono posizionati in ciascun pozzetto.Per tenere traccia di quali pozzetti contengono campioni e quali no, iniziare con una nuova scatola di punte e utilizzare le punte dalle stesse posizioni della scatola corrispondenti alle posizioni dei pozzetti nella piastra. Mescolare il contenuto dei pozzetti del campione, del controllo di estrazione e del controllo del veicolo mediante pipettaggio. Regolare i volumi di questi pozzetti a 120 microlitri rimuovendo 205 microlitri da ciascuno.Sigillare ogni piastra con un film adesivo sterile poroso, etichettarla e incubarla a 30 gradi Celsius per 17 ore. Dopo l'incubazione di 17 ore, rimuovere le piastre dall'incubatore. Se le piastre non possono essere processate immediatamente, avvolgerle nella pellicola trasparente e conservarle in frigorifero, a quattro gradi Celsius, per sei giorni.Quando si è pronti per elaborare le piastre, rimuovere l'involucro. Utilizzare una pipetta multicanale per mescolare il contenuto di ogni riga di pozzetti, quindi trasferire 50 microlitri di sospensione di lievito da ogni pozzetto al pozzetto corrispondente di una nuova piastra microtitolazione da 96 pozzetti in polistirene trasparente. Etichettare la nuova piastra.Per evitare la contaminazione incrociata tra pozzetti, utilizzare punte di pipetta nuove per ciascun pozzetto, ma le punte non devono essere sterili. In una cappa chimica, aggiungere 20 microlitri di DTT uno molare a 20 millilitri di buffer LacZ scongelato e a temperatura ambiente per ottenere una concentrazione finale di un millimolare di DTT. Mescolare bene il buffer LacZ.Utilizzando una pipetta ripetitrice, aggiungere 200 microlitri di tampone LacZ contenente DTT e ONPG o CPRG in tutte le pozzette della piastra in polistirene e misurare immediatamente e registrare la densità ottica a 610 nanometri di tutte le pozzette utilizzando un lettore di piastre. Ripetere secondo necessità per piastre aggiuntive. Coprire le piastre con un coperchio e incubarle a 30 gradi Celsius per i tempi indicati.Al termine dell'incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatore. Utilizzare una pipetta ripetitrice per aggiungere 100 microlitri di carbonato di sodio in ciascun pozzetto per arrestare la reazione della beta-galattosidasi. Misurare e registrare la densità ottica a 405 nanometri per ONPG oppure a 574 nanometri per CPRG di tutti i pozzetti, utilizzando un spettrofotometro per piastre.Il calcolo dei valori LacZ può essere effettuato utilizzando un'applicazione automatizzata che richiede l'installazione di Java. Per iniziare, aprire l'applicazione automatizzata LacZ descritta nell'appendice uno. Incollare le letture di densità ottica a 405 nanometri per ONPG o a 574 nanometri per CPRG di tutti i pozzetti, utilizzando un layout della piastra identico a quello mostrato nella figura uno.Inserire la durata dell'incubazione e le ore necessarie per lo sviluppo del colore nel saggio, quindi fare clic su Avanti. Incollare i valori di densità ottica a 610 nanometri per tutti i pozzetti. Fare clic su Invia per visualizzare i risultati di LacZ.I risultati di LacZ possono essere copiati utilizzando i comandi della tastiera e incollati in un foglio elettronico o in altri file secondo necessità. Per iniziare questa analisi, aprire l'applicazione online per l'analisi dei dati del saggio YES. Caricare un file di dati CSV formattato come descritto nella prima scheda.Digitalizzare la curva standard di estradiolo nella seconda scheda e stimare i parametri di regressione. Visualizzare i risultati del modello di regressione nella terza scheda, quindi trovare i valori interpolati sull'asse x corrispondenti ai valori di LacZ dei campioni nella quarta scheda. Fare clic sulla quinta scheda per visualizzare i valori di equivalente estrogenico (EEQ) dei campioni.Infine, standardizzare i valori di EEQ rispetto alla massa originale del campione come descritto nel protocollo del testo. Vengono mostrati esempi di curve standard ottenute dopo un'incubazione di 17 ore di lievito con 17 beta-estradiolo. Per i motivi discussi nel manoscritto, il CPRG è spesso una scelta di substrato migliore rispetto all'ONPG.In linea con osservazioni precedenti, i saggi condotti con lieviti che esprimono ER Beta hanno mostrato una sensibilità superiore di oltre un ordine di grandezza rispetto ai saggi con lieviti che esprimono ER Alpha. Pertanto, l'attività estrogenica è stata rilevata più frequentemente utilizzando lieviti che esprimono ER Beta. Un ulteriore obiettivo dello studio era testare durate di incubazione compatibili con il programma di un corso di laboratorio per studenti universitari. Quando è stato introdotto un periodo di refrigerazione di sei giorni dopo l'incubazione di 17 ore, le curve standard ottenute da piastre refrigerate erano paragonabili a quelle ottenute da piastre non refrigerate. Gli errori standard dei parametri stimati mediante modelli di regressione logistica a quattro parametri sono risultati tutti inferiori per le piastre refrigerate rispetto a quelle non refrigerate. Pertanto, la refrigerazione delle piastre per sei giorni riduce l'errore e migliora l'accuratezza delle stime di EEQ.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due o tre-quattro sessioni di lavoro. Durante l'esecuzione della procedura, è fondamentale ricordare di adottare una tecnica asettica per tutti i passaggi eseguiti prima del periodo di incubazione di 17 ore, di pipettare con attenzione e precisione e di seguire il layout della piastra illustrato nella figura uno. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi, come saggi in vivo su animali, possono essere eseguiti per indagare ulteriori meccanismi d'azione degli estrogeni e gli effetti sull'organismo nel suo complesso.Dopo il suo sviluppo, il test per lo screening degli estrogeni nel lievito è stato accettato come metodo economico per misurare ligandi estrogenici in campioni ambientali come alimenti, tessuti vegetali e prodotti per la cura personale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire semplici estrazioni di prodotti per la cura personale, coltivare lieviti, preparare curve di diluizione standard, eseguire il saggio YES in una piastra a 96 pozzetti e completare i calcoli associati. E non dimenticare che lavorare con l'estradiolo può essere estremamente pericoloso, e che è sempre necessario adottare precauzioni come indossare guanti e altri dispositivi di protezione individuale, oltre a garantire lo smaltimento appropriato durante l'esecuzione di questa procedura.

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Rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari (Video) | JoVE Journal

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